Summary
Abbiamo sviluppato un metodo per rilevare gli zoospori di Phytophthora capsici nelle fonti d'acqua utilizzando un metodo di estrazione del DNA della carta filtro accoppiato con un'amplificazione isotermica mediata a ciclo (LAMP) che può essere analizzata sul campo o in laboratorio.
Abstract
Phytophthora capsici è un patogeno oomiceto devastante che colpisce molte importanti colture di conforto e cucurbit causando perdite economiche significative nella produzione vegetale ogni anno. Phytophthora capsici è di origine del suolo e un problema persistente nei campi vegetali a causa delle sue strutture di sopravvivenza di lunga durata (oospores e chlamydospores) che resistono agli intemperie e al degrado. Il metodo principale di dispersione è attraverso la produzione di zoospores, che sono monotono, spore flagellate che possono nuotare attraverso sottili pellicole d'acqua presenti sulle superfici o in pori del suolo pieni d'acqua e possono accumularsi in pozzanghere e stagni. Pertanto, gli stagni di irrigazione possono essere una fonte dell'agente patogeno e dei punti iniziali dei focolai di malattia. Il rilevamento di P. capsici nell'acqua di irrigazione è difficile utilizzando metodi tradizionali basati sulla coltura perché altri microrganismi presenti nell'ambiente, come Pythium spp., di solito sovrasessero P. capsici rendendolo inosservabile. Per determinare la presenza di spore P. capsici nelle fonti d'acqua (acqua di irrigazione, deflusso, ecc.), abbiamo sviluppato un metodo di filtro a base di pompa a mano (8-10 m) che cattura le spore dell'agente patogeno (zoospore) e viene successivamente utilizzato per amplificare il DNA dell'agente patogeno attraverso un nuovo esempio di amplificazione isotermica mediata dal ciclo (LAMP) progettato per l'amplificazione specifica dei tappi Pici. Questo metodo può amplificare e rilevare il DNA da una concentrazione a partire da 1,2 x 102 zoospores/mL, che è 40 volte più sensibile della PCR convenzionale. Non è stata ottenuta alcuna amplificazione incrociata durante il test di specie strettamente correlate. LAMP è stato anche eseguito utilizzando un colorante mix master LAMP colorimetrico, visualizzando risultati che potrebbero essere letti ad occhio nudo per il rilevamento rapido in loco. Questo protocollo potrebbe essere adattato ad altri agenti patogeni che risiedono, si accumulano o sono dispersi tramite sistemi di irrigazione contaminati.
Introduction
Il riciclo dell'acqua nelle aziende agricole e negli asili nido sta diventando sempre più popolare a causa dell'aumento dei costi dell'acqua e delle preoccupazioni ambientali alla base dell'utilizzo dell'acqua. Molti metodi di irrigazione sono stati sviluppati per i coltivatori per ridurre la diffusione e l'insorgenza di malattie vegetali. Indipendentemente dalla fonte dell'acqua (irrigazione o precipitazioni), viene generato il deflusso, e molti coltivatori di ortaggi e vivaio hanno uno stagno per raccogliere e riciclare ildeflusso 1. Questo crea un serbatoio per un possibile accumulo di agenti patogeni favorendo la diffusione di agenti patogeni quando l'acqua riciclata viene utilizzata per irrigare lecolture 2,3,4. Gli agenti patogeni delle piante di oomicete beneficiano particolarmente di questa pratica in quanto gli zoospore si accumulano in acqua e la spore dispersiva primaria è auto-motile ma richiedeacqua superficiale 5,6,7. Phytophthora capsici è un agente patogeno oomicete che colpisce un numero significativo di colture di conforto e cucurbit in modi diversi8. Spesso, i sintomi sono smorzamento-off di piantine, radice e marciume corona; tuttavia, in colture come cetriolo, zucca, melone, zucca, anguria, melanzane e pepe, interi raccolti possono essere persi a causa del marciumedella frutta 9. Anche se ci sono metodi noti per rilevare questo agente patogeno della pianta, la maggior parte richiedono un'infezione che è già avvenuta che è troppo tardi per eventuali fungicidi preventivi per avere un effettosignificativo 10.
Il metodo tradizionale per testare l'acqua di irrigazione per il rilevamento e la diagnosi di microrganismi mirati è un approccio antiquato quando velocità e sensibilità sono cruciali per il successo e la produzione di coltureredditizie 11,12. Il tessuto vegetale suscettibile all'agente patogeno mirato (ad esempio, melanzane per P. capsici)è attaccato a una trappola modificata che viene sospesa in uno stagno di irrigazione per un periodo prolungato prima di essere rimosso e ispezionato per l'infezione. I campioni del tessuto vegetale vengono poi placcati su supporti semi-selettivi (PARPH) e incubati per la crescita della coltura, quindi l'identificazione morfologica viene eseguita utilizzando un microscopiocomposto 13. Ci sono altri metodi di rilevamento simili per altri agenti patogeni vegetali che utilizzano supporti selettivi e placcano piccole quantità di acqua contaminata prima di sub-culturing14,15. Questi metodi richiedono da 2 a 6 settimane, diversi cicli di sub-culturing per isolare l'organismo, e l'esperienza sulla diagnostica Phytophthora per essere in grado di riconoscere i caratteri morfologici chiave di ogni specie. Questi metodi tradizionali non funzionano bene per il rilevamento dell'acqua di irrigazione contaminata da P. capsici a causa di fattori come l'interferenza di altri microrganismi che sono presenti anche nelle fonti d'acqua. Alcuni microrganismi in rapida crescita come Pythium spp. e batteri a base d'acqua possono sovracrescere sulla piastra rendendo P. capsici inosservabile16,17.
Lo scopo di questo studio era quello di sviluppare un metodo molecolare sensibile e specifico che possa essere utilizzato sia in campo che in laboratorio per rilevare gli zoospori P. capsici nell'acqua di irrigazione. Il protocollo include lo sviluppo di un nuovo set di primer LAMP (IOthermal amplification) mediato a ciclo continuo in grado di amplificare specificamente P. capsici, basato su un frammento di coppia di 1121 basi (bp) di P. capsici18,19. Un primer LAMP sviluppato in precedenza da Dong et al. (2015) è stato utilizzato in confronto al saggio che è stato sviluppato per questo studio20.
Il test LAMP è una forma relativamente nuova di rilevamento molecolare che è stato dimostrato di essere più rapida, sensibile e specifica rispetto alla reazione a catena polimerasi convenzionale (PCR)21. In generale, i saggi PCR convenzionali non sono in grado di rilevare meno di 500 copie (1,25 pg/L); al contrario, studi precedenti hanno dimostrato che la sensibilità di LAMP può essere da 10 a 1.000 volte superiore rispetto alla PCR convenzionale e può facilmente rilevare anche 1 fg/L di DNA genomico22,23. Inoltre, il saggio può essere effettuato rapidamente (spesso in 30 min) e in loco (nel campo) utilizzando un blocco di riscaldamento portatile per l'amplificazione e un colorante colorimetrico che cambia colore per un campione positivo (eliminando la necessità di elettroforesi). In questo studio, abbiamo confrontato la sensibilità dei saggi PCR e LAMP utilizzando un metodo di estrazione del filtro. Il metodo di rilevamento proposto consente ai ricercatori e agli agenti di estensione di rilevare facilmente la presenza di spore P. capsici provenienti da diverse fonti d'acqua in meno di due ore. Il saggio è dimostrato di essere più sensibile rispetto al PCR convenzionale ed è stato convalidato in situ rilevando la presenza dell'agente patogeno nell'acqua di irrigazione utilizzata da un coltivatore. Questo metodo di rilevamento permetterà ai coltivatori di stimare la presenza e la densità di popolazione dell'agente patogeno in varie fonti d'acqua utilizzate per l'irrigazione, prevenendo focolai devastanti e perdite economiche.
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Protocol
1. Rilevamento in loco di Phytophthora capsici dall'acqua di irrigazione mediante amplificazione isotermica mediata a ciclo portabile
- Impostazione della pompa e del filtro
- Fissare un flacone filtrante a un tubo collegato a una pompa a mano in modo che quando la pompa è attivata, l'aria verrà tirata attraverso la bocca del pallone filtrante.
- Inserire l'imbuto Buchner nel tappo di gomma alla bocca del pallone filtrante e inserire il pezzo di carta da filtro di dimensioni appropriato nell'imbuto Buchner in modo che l'aria sia tirata attraverso la carta da filtro. La carta da filtro deve avere una dimensione di ritenzione di 15 m.
NOTA: La carta da filtro deve adattarsi ai bordi dell'imbuto Buchner in modo che l'acqua minima fluisse intorno alla carta da filtro.
- Campionamento e filtraggio dell'acqua
- Prelevate campioni d'acqua dalla fonte mirata. L'acqua può avere piccole quantità di detriti, ma non sedimenti significativi o suolo.
- Versare fino a 1.000 mL (1 litro) di acqua di prova sulla carta da filtro posizionata all'interno dell'imbuto Buchner abbastanza lentamente da evitare l'overflow, mentre la pompa a mano (o vuoto) viene utilizzata per creare un'aspirazione per tirare l'acqua attraverso.
NOTA: Non c'è una quantità minima di acqua che può essere testata con questo metodo, e anche se si suggerisce almeno 50 mL, 1000 mL è il massimo per questo metodo. - Utilizzando le forcepi, rimuovere la carta da filtro dall'imbuto Buchner e tagliarla in piccoli pezzi con forbici sterili. Aggiungere il maggior numero di pezzi (8-12) quanti possono essere sommersi nella quantità di buffer di estrazione (400 L per l'estrazione a base di perline magnetiche) richiesti dal protocollo in un tubo da 1,5 mL. Salvare i pezzi di carta da filtro rimanenti per l'elaborazione dopo l'estrazione del primo set.
- Vortice o comunque agitare i pezzi di carta da filtro e buffer di estrazione per 10 s ogni minuto per 5 min. Quindi, utilizzando le forcepi, rimuovere la carta filtro perdendo il meno del buffer di estrazione possibile. Ripetere questo passaggio con i pezzi di carta da filtro rimanenti fino a quando tutti i pezzi non sono stati vorticosati/agitati e immersi nel buffer di estrazione.
- Estrazione magnetica a base di perline del DNA dalla carta da filtro
- Per il tubo da 1,5 mL (che ora contiene circa 200-300 L di buffer di estrazione), aggiungere 20 L di proteinase K e 10 L di 10 ng/L RNase.
- Incubare a temperatura ambiente per 15 min, vortice o scuotere il tubo ogni 3 min.
- Aggiungere al campione 500 L di perline magnetiche con il buffer di rilegatura e mescolare bene agitando. Quindi incubare per 5 min a temperatura ambiente.
- Posizionare il tubo nel rack separatore magnetico per 2 minuti fino a quando tutte le perline sono state tirate al magnete. Rimuovere e scartare il supernatant.
- Rimuovere il tubo dal separatore magnetico. Aggiungere 500 L di Wash Buffer 1 e sospendere nuovamente le perline agitando vigorosamente il tubo. Attendere 30 s e quindi posizionare il tubo di nuovo nel separatore magnetico. Attendere 2 minuti fino a quando tutte le perline sono state tirate verso il magnete prima di rimuovere e scartare il supernante.
NOTA: Quando si attende che le perline magnetiche si magnetizzino al separatore, si consiglia di invertire il tubo, che può spostare perline magnetiche attaccate al tappo e ai lati del tubo e provocare un maggior numero di perline attaccate. - Ripetere il passaggio 1.3.5 con 500 L di Wash Buffer 2.
- Ripetere il passaggio 1.3.5 con 500 L di etanolo dell'80%.
- Aridare il pellet di perline magnetiche per 15 minuti a temperatura ambiente (18-27 gradi centigradi) con il coperchio aperto. Se le temperature non lo permettono, incubare in una mano guantata con il tappo aperto per 15 min.
- Rimuovere il tubo dal separatore magnetico. Aggiungere 50 L di buffer di eluizione e sospendere nuovamente le perline mediante pipettamento su e giù per 1 min.
- Posizionare il tubo in un separatore magnetico. Attendere 2 minuti prima di trasferire il supernatant senza disturbare le perline in un tubo separato per l'immagazzinamento del DNA.
NOTA: Qui l'esperimento può essere messo in pausa prima di andare avanti. Il DNA estratto deve essere conservato su ghiaccio o in un congelatore a -20 gradi centigradi.
- Applicazione del test LAMP di recente sviluppo
- Preparare il mix primer LAMP utilizzando 0,2 M di ogni primer F3 e B3, 0,8 M di ogni primer Loop-F e Loop-B e 1,6 M di ogni primer FIP e BIP(Tabella 2).
- Aggiungere la seguente soluzione LAMP a un singolo tubo PCR, o a ciascun singolo tubo nella striscia di 8 tubi: 2,5 L di miscela primer (passo 1.4.1), 12,5 L di miscela master LAVA LAMP, 1 L di DNA estratto e 9 L di ddH2O. Il volume totale è di 25 L.
NOTA: se si utilizza lo strumento di amplificazione portatile (ad esempio, Genie III) con colorante coloremetrico (ad esempio, Warmstart), fare riferimento alla sezione 2.4.2- 2.4.3. - Designare due tubi come controlli positivi e negativi. Per il controllo positivo, utilizzare un controllo fornito dal kit LAVA LAMP o un campione di DNA positivo noto. Per il controllo negativo, utilizzare ddH2O. Per entrambi, sostituire il 1 L del DNA estratto con 1 L del controllo positivo o ddH2O.
- Impostare i campioni in un blocco di calore (o strumento di amplificazione portatile) impostato su 64 gradi centigradi per 45 min.
NOTA: Qui possono essere utilizzati altri metodi di estrazione invece dell'estrazione a base di perline magnetiche. CTAB e un kit commerciale di estrazione del DNA sono stati entrambi testati con successo utilizzando i protocolli standard e sostituendo i pezzi di carta filtrante per il campionevegetale 24,25. I risultati sono stati confrontati nella Tabella 2. Se la concentrazione di DNA può essere quantificata, utilizzare tra 1-10 ng DNA genomico.
- Visualizzazione dei risultati
- Se eseguiti in un ambiente di laboratorio, visualizzare i prodotti di amplificazione caricando 5 L di ogni campione in un gel di agarose dell'1%, eseguendoli in una macchina per l'elettroforesi gel e stampandoli in una macchina per l'imaging UV.
- Se è stato utilizzato un colorante colorimetrico (ad esempio, Warmstart), visualizzare la modifica del colore per determinare i risultati come positivi o negativi.
- Se è stato utilizzato uno strumento di amplificazione portatile (ad esempio, Genie III), visualizzare il grafico di amplificazione sullo schermo per determinare i risultati.
- Applicazione del test PCR precedentemente sviluppato
NOTA: se si utilizza un'analisi PCR convenzionale, i passaggi da 1 a 3 rimangono invariati e al posto dei punti 1.4 e 1.5 devono essere applicati i seguenti passaggi.- Aggiungere 1 L di ogni estrazione del DNA a singoli tubi contenenti i seguenti componenti: 12,5 L di miscela master PCR verde, 9,5 L di ddH2O e 1 1 L di primer in avanti e inverso(tabella 2).
- Girare verso il basso ogni campione utilizzando un microcentrifuge e posizionare i tubi in un ciclo termico.
- Utilizzare le seguenti impostazioni del ciclo termico in conformità con le pubblicazioni precedenti: 94 gradi centigradi per 5 min, 30 cicli di denaturazione a 94 gradi centigradi per 30 s, annealing a 54 gradi centigradi per 30 s, estensione a 72 gradi centigradi per 1 min e estensione finale a 72 gradi centigradi per 10 minuti.
- Eseguire il prodotto in un gel di agarose dell'1%. Osservare la presenza di bande sotto la luce UV in cui le reazioni positive avranno una dimensione della banda di 508 bp.
- Metodo tradizionale di rilevamento
NOTA: esistono diversi metodi di placcatura selettiva per il rilevamento degli agenti patogeni e il seguente è un protocollo generale per P. capsici.- In primo luogo, ottenere un frutto di melanzane sano (un ospite suscettibile per P. capsici) e sterilizzare la superficie lavando la superficie della frutta con 70% alcool isopropile.
- Mettere il frutto delle melanzane in casse di latte con un dispositivo di galleggiamento (schiuma di polietilene o altro) e distribuirlo in stagni di irrigazione. Fissare ogni trappola esca in un singolo punto e lasciare le trappole nel serbatoio dell'acqua (acqua di irrigazione riciclata) per almeno 7 giorni o fino a quando non si osservano i sintomi del marciume della frutta. Raccogliere il frutto e trasportarlo in laboratorio.
- Sciacquare e asciugare il frutto in un cappuccio sterile prima di rimuovere piccoli pezzi di tessuti infetti e metterli su un piatto di PARPH medio modificato con 25 mg/L pentachloronitrobenzene, 0.0005% pimaricin, 250 mg/L ampicillin, 10 mg/L rifampicina e 50 mg/L imexa. Incubare piastre a 25 gradi centigradi per 5 giorni.
- Visualizza le piastre al microscopio composto per l'identificazione morfologica tradizionale a 4 giorni dall'isolamento.
2. Determinazione del limite di rilevamento della concentrazione di zoospore
- Sospensione zoospore
- Incubate P. capsici su V8 agar (100 mL di succo V8, 900 mL di ddH2O, 1 g di CaCO3) piastre per 1 settimana a 26 gradi centigradi. Più piastre possono essere utilizzate per ottenere una maggiore quantità di sospensione zoospore.
- Incubare le piastre sotto luce continua a temperatura ambiente per 3 giorni per stimolare la sporulation.
- Inondare le piastre aggiungendo 15 mL di ddH2O ad ogni piatto e metterli in un frigorifero da 4 gradi per 25 minuti. Quindi tornare alla temperatura ambiente per 30 min.
- Piastre agitate per spostare zoospores e pipette la soluzione in un unico tubo da 50 mL da tutte le piastre.
- Per ottenere una stima accurata della concentrazione di zoospore, aggiungere 10 L della sospensione delle spore su un emocitometro e osservare al microscopio per contare le zoospore e stimare la concentrazione media.
- Diluizione seriale
- Aggiungere 1 mL delle sospensioni spore e 9 mL di ddH2O in un tubo separato. Ripetere questo passaggio per tutte le diluizioni di 10 volte desiderate.
- Le soluzioni Spore vengono quindi presentate per l'estrazione del DNA sulla base del protocollo precedente utilizzando il metodo di filtrazione.
NOTA: Se si desidera un volume maggiore di sospensioni, raddoppiare il volume: 2 mL di sospensione delle spore e 18 mL di ddH2O.
- Rilevamento del limite di concentrazione delle zoospore
- Valutare il limite di rilevamento delle spore eseguendo ogni diluizione seriale singolarmente attraverso il saggio fino a quando non vengono più osservati risultati chiaramente positivi. Una volta ottenuta la diluizione finale, diluire di un fattore di 2 (da 4,8 a 2,4 in questo esempio) ed eseguire nuovamente il test per ottenere un limite di rilevamento più accurato.
- Sviluppo e ottimizzazione del metodo LAMP
NOTA: i primer LAMP sono stati progettati sulla base di un frammento di coppia di 1121 basi (bp) di P. capsici (Li et al.19), come illustrato nella Figura supplementare 2.- Se si utilizza il colorante colorimetrico (ad esempio, Warmstart), utilizzare la seguente soluzione: 2,5 L di miscela primer, 12,5 L di colorante colorimetrico, 0,5 L di colorante fluorescente verde, 1 L di DNA estratto e 8,5 L di ddH2O. Il volume totale è di 25 L.
- Quando si utilizza lo strumento di amplificazione portatile con mastermix LAVALAMP, avere un primo passo di 95 gradi centigradi per 3 min come raccomandato dal produttore, ma questo non è necessario. Non è necessario un passaggio finale per osservare il grafico di modifica del colore o di amplificazione. Non eseguire un passaggio warmstart se si desidera utilizzare il colorante colorimetrico commerciale.
- Visualizza i risultati dell'analisi LAMP in uno dei seguenti metodi: eseguire campioni su un gel di agarose dell'1% o visualizzare utilizzando una macchina di imaging UV ad occhio nudo o vista sullo schermo di amplificazione in tempo reale Genie III.
- Ottimizzare la temperatura del test LAMP utilizzando lo strumento di amplificazione portatile e analizzato utilizzando il grafico di amplificazione in tempo reale per velocità e livello di sensibilità. Eseguire campioni con temperature uniche per determinare l'amplificazione più veloce con il più alto livello di sensibilità.
- Determinare il limite di rilevamento del saggio lampeggi sviluppato effettuando una diluizione seriale del DNA estratto (come con la sospensione delle spore al punto 2.2.1) e mantenendo le condizioni di reazione descritte in precedenza per la reazione LAMP per ogni diluizione.
- Determinazione del limite di rilevamento e confronto con il metodo PCR convenzionale
- Utilizzare il DNA estratto nei passaggi della sezione 1.3 per confrontare il livello di rilevamento della PCR convenzionale con quello del saggio LAMP.
- Aggiungere 1 L di DNA a un tubo PCR che conteneva 1 L di primer PCR sia in avanti che in retromarcia (tabella2), 12,5 L di PcR Mastermix verde e 9,5 L di ddH2O per un totale di 25 L.
- Amplificare i campioni in un ciclo termico utilizzando le seguenti condizioni: 94 gradi centigradi per 5 minuti, 30 cicli di denaturazione a 94 gradi centigradi per 30 s, annealing a 54 gradi centigradi per 30 s, estensione a 72 gradi centigradi per 1 min e estensione finale a 72 gradi centigradi per 10 minuti.
- Eseguire campioni in una macchina per l'elettroforesi su un gel di agarose dell'1% e visualizzare su una macchina di imaging UV. La dimensione della banda eccetto era di 508 bp.
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Representative Results
Ottimizzazione del metodo LAMP
In questo studio, abbiamo rilevato la presenza di Phytophthora capsici nell'acqua di irrigazione utilizzando un'amplificazione isotermica mediata a ciclo portatile (LAMP). In primo luogo, il saggio LAMP proposto è stato ottimizzato testando diverse concentrazioni di primer LAMP [F3, B3 (0,1–0,5 M ciascuno); LF, LB (0,5–1,0 M ciascuno) e FIP, BIP (0,8–2,4 M ciascuno)], durate (30-70 min) e temperature (55-70 gradi centigradi). L'ultimo mix di primer LAMP utilizzato in questo studio è stato: 0,2 M di ogni primer F3 e B3, 0,8 M di ogni primer Loop-F e Loop-B, 1,6 M di ogni primer FIP e BIP. L'ottimizzazione della temperatura di reazione è stata eseguita nello strumento di amplificazione portatile (ad esempio, Genie III) determinando quale temperatura ha eseguito la reazione più veloce senza amplificazione negativa aggiuntiva. La temperatura ottimale è stata confermata a 64 gradi centigradi (dati non visualizzati). Il tempo ottimale per l'esecuzione del saggio a 64 gradi centigradi è stato di 45 min, in quanto le concentrazioni più basse che sono state positive per il rilevamento (1,2 x10 2 spore/mL) sono ancora amplificate di 40 min, mentre le concentrazioni più elevate sono state amplificate a 20 min(Figura 2D). I prodotti LAMP amplificati sono stati ulteriormente osservati sul gel di agarose dell'1% macchiato con una macchia di acido nucleico per confermare l'amplificazione. Tutte le reazioni sono state ripetute almeno tre volte.
Gli isolati di P. capsici sono stati presi da Tennessee, Florida e Georgia e sono stati sottoposti allo stesso protocollo descritto nei metodi. Tutti i campioni di isolamenti P. capsici sono stati amplificati correttamente in tutte le esecuzioni del saggio (Figura 3).
Rilevamento e test di sensibilità di Phytophthora capsici nell'acqua di irrigazione utilizzando l'analisi portatile LAMP
Questo metodo LAMP basato su carta di filtro è stato standardizzato in condizioni di laboratorio utilizzando una diluizione seriale delle sospensioni delle spore P. capsici (Figura 1). Diluizioni seriali sono state fatte da una sospensione spore P. capsici a partire da 4,8 x10 4 zoospores/mL e correre con il saggio LAMP in triplicato. Le concentrazioni di spore sono mostrate piuttosto che la concentrazione di DNA a causa del metodo coinvolto per l'estrazione del DNA. L'estrazione del DNA CTAB della più alta concentrazione di spore è stata di 4,5 ng/L misurata da Nanodrop, e il protocollo di estrazione del DNA del perline magnetico ha prodotto 3,8 ng/L26. Il nuovo set di primer LAMP potrebbe rilevare una concentrazione a partire da 1,2 x 102 spore/mL(Figura 2B, 2C e 2D) con tutti i metodi di estrazione. La sensibilità mostrata nel grafico di amplificazione sullo strumento di amplificazione portatile era identica a quella mostrata nell'immagine UV senza ulteriore sensibilità. La stessa diluizione seriale è stata eseguita in una reazione LAMP utilizzando il colorante colorimetrico per determinare il livello di sensibilità ad occhio nudo per il rilevamento del campo. La concentrazione osservabile più bassa è stata di 4,8 x 103 spore/mL(Figura 2C).
Per valutare la capacità di questo saggio utilizzando campioni reali, sono stati raccolti campioni d'acqua da sette stagni utilizzati per la produzione di ortaggi commerciali nella contea di Tift, Georgia (Tabella 1, Figura 5e Figura supplementare 1). Dei 7 stagni, 3 hanno mostrato risultati LAMP positivi (P1, P4 e P6)(Figura 6A, 6B e 6C). Questi risultati suggeriscono che il metodo LAMP basato su carta da filtro portatile potrebbe essere molto utile per il rilevamento dell'agente patogeno anche con una bassa concentrazione di zoospore. Ciò dimostra l'applicabilità di LAMP come un saggio di rilevamento più sensibile rispetto alla PCR per lo screening della contaminazione dell'acqua di irrigazione da P. capsici.
Analisi comparativa di diversi metodi: esca tradizionale, PCR convenzionale e l'analisi portatile basata su LAMP
Al fine di confrontare la sensibilità di rilevamento di LAMP con PCR convenzionale, il DNA estratto dalla diluizione seriale delle sospensioni delle spore sono stati eseguiti in una reazione PCR. I risultati hanno mostrato che la PCR convenzionale era 40 volte meno sensibile di LAMP, in grado di rilevare solo una concentrazione di zoospore a partire da 4,8 x 103 spore/mL (Figura 2A). Inoltre, i campioni di DNA ottenuti dall'acqua filtrata dello stagno di irrigazione sono stati testati utilizzando la PCR convenzionale e solo uno dei tre campioni positivi (P4) è stato amplificato con successo come dimensione prevista della banda più contaminanti significativi con conseguente alcune bande di sbavatura e non specifiche (Figura 6D). Nella tabella 3 vengono visualizzate le differenze tra i metodi di rilevamento che utilizzano variabili quali il tempo, il costo, la sensibilità e la preparazione necessari. LAMP era il metodo meno costoso tra questi tre metodi ed era anche il più veloce, che va da 30-60 min per l'amplificazione (estrazione del DNA esclusa). La PCR convenzionale variava da 120-180 min per l'amplificazione (estrazione del DNA esclusa).
Infine, per determinare la specificità dei primer, campioni di patomiceti strettamente correlati (Phytophthora sansomeana, Phytophthora sojae, Phytophthora cinnamomi, Phytophthora palmivora, Pythium ultimum var. ultimum, Phytopythium vexans, Phytopythium helicoidese Pythium aphanidermatum) sono stati ottenuti, il DNA è stato estratto utilizzando lo stesso protocollo per la coerenza e valutato dal nuovo saggio LAMP con un controllo positivo e negativo (Figura 4) per determinare la specificità dei primer. Tutti i campioni non bersaglio erano negativi utilizzando i 64 gradi centigradi ottimizzati per 45 minuti. Questo è stato osservato sul grafico di amplificazione in tempo reale e immagine su un gel di agarose 1% sotto la luce UV.
Figura 1: Diagramma che mostra i diversi passaggi coinvolti in Phytophthora capsici da una diluizione seriale di una sospensione di spore concentrata in condizioni di laboratorio. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Ottimizzazione di laboratorio del limite per il rilevamento di Phytophthora capsici. (A) Il saggio PCR convenzionale è stato effettuato utilizzando specifici primer P. capsici su fattori di diluizione seriali e viene visualizzato su 1% di gel di agarose. 1, Scala; 2-7, 4,8 x 104, 4,8 x 103, 4,8 x 102, 2,4 x 102, 1,2 x 102 spore/mL, rispettivamente e 7, controllo dell'acqua negativo. (B) LAMPsay fattori di diluizione seriale visualizzati su 1% agarose gel. 1-6, una concentrazione di spore decrescente: 4,8 x 104, 4,8 x 103, 4,8 x 102, 2,4 x 102, 1,2 x 102 spore/mL e 7, controllo dell'acqua negativo. (C) RISULTATI LAMP visualizzati utilizzando il colorante colorimetrico. 1-6, una concentrazione di spore decrescente: 4,8 x 104, 4,8 x 103, 4,8 x 102, 2,4 x 102, 1,2 x 102 spore/mL e 7, controllo dell'acqua negativo. (D) Risultati LAMP visualizzati sul grafico di amplificazione. Rosso - 4,8 x 104, Blu scuro - 4,8 x 103, Arancione - 4,8 x10 2, Azzurro - 2,4 x10 2, Verde - 1,2 x 102 spore/mL, Rosa - Controllo negativo (altre specie di Phytophthora), Giallo - ddH2O. (E) Una curva standard che mostra la quantificazione dei valori mostrati nei risultati in tempo reale. Ln (Spore count) viene visualizzato sull'asse X e i minuti per l'amplificazione sull'asse Y. (F) Analisi LAMP con primer pubblicato (Dong et al. 2015) sui fattori di diluizione seriali visualizzati su 1% agarose gel. 1-6, una concentrazione di spore decrescente: 4,8 x 104, 4,8 x 103, 4,8 x 102, 2,4 x 102, 1,2 x 102 spore/mL e 7, controllo dell'acqua negativo. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Amplificazione del DNA P. capsici da varie posizioni. (A) RISULTATI LAMP visualizzati su 1% agarose gel. 1, PC_TN1; 2, PC_TN2; 3, PC_FL1; 4.PC_FL2; 5, PC_GA1; 6, PC_GA2; N, Controllo negativo. I campioni 1 e 2 sono stati isolati da TN; campioni 3 e 4 isolati da FL; campioni 5 e 6 sono stati isolati da GA. (B) Risultati visualizzati utilizzando il colorante colorimetrico. 1, PC_TN1; 2, PCTN2; 3, PC_FL1; 4.PC_FL2; 5, PC_GA1; 6, PC_GA2. (C) Risultati visualizzati nel grafico di amplificazione. Rosso, PC_TN1; Arancione, PCTN2; Giallo, PC_FL1; Verde, PC_FL2; Blu scuro, PC_GA1; Azzurro, PC_GA2; Rosa, controllo negativo. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Determinazione della specificità del saggio LAMP utilizzando il DNA di specie non bersaglio P. capsici. (A) Reazione di analisi LAMP con specie non bersaglio correlate su gel di agarose e visualizzata su 1% di gel di agarose. L, Scala; 1, Phytophthora sansomeana; 2, Phytophthora sojae; 3, Fitophthora cinnamomi; 4, Phytophthora palmivora; 5, Pythium ultimum var. ultimum; 6, Phytopythium vexans; 7, Controllo negativo; 8, Phytophthora capsica. (B) Risultati LAMP visualizzati utilizzando il colorante colorimetrico. 1, Phytophthora sansomeana; 2, Phytophthora sojae; 3, Fitophthora cinnamomi; 4, Phytophthora palmivora; 5, Pythium ultimum var. ultimum; 6, Phytopythium vexans; 7, Controllo negativo; 8, Phytophthora capsici (C) RISULTATI LAMP visualizzati sul grafico di amplificazione. Rosso - Phytophthora capcisi, tutti gli altri campioni di specie non bersaglio non sono stati amplificati. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Immagini che mostrano il campionamento e la lavorazione dell'acqua riciclata per il rilevamento di Phytophthora capsici sul campo. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Risultati del rilevamento in loco di Phytophthora capsici nelle fonti d'acqua di irrigazione. (A) Gel di Agarose che mostra i risultati dell'amplificazione LAMP dell'acqua testata da sette aziende agricole in Georgia del Sud. Nomi di esempio da sinistra a destra: P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, Controllo negativo, N. (B) Risultati LAMP visualizzati utilizzando il colorante colorimetrico warmstart dei campioni di campo: P1, P2, P3, P4, P5, P6, P7, Controllo negativo, N. (C) Risultati dall'amplificazione LAMP dei campioni di campo utilizzando il grafico. Rosso: P1, Verde: P2, Viola: P3, Giallo: P4, Blu: P5, Arancione: P6, Rosa: P7, Controllo negativo, N. (D) Gel Agarose che mostra i risultati PCR convenzionali dell'amplificazione utilizzando primer specifici PC-1/PC-2 (nota di un solo sito risultato positivo rispetto a tre in LAMP). Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Nome stagno | Contea di State | Colture di destinazione per l'irrigazione | Rilevamento PCR | Rilevamento LAMP | Storia della malattia (Y/N) |
| P1 | Tift, GA | Verdure | | + | N |
| P2 | Tift, GA | Verdure | - | - | N |
| P3 | Tift, GA | Verdure | - | - | N |
| P4 | Tift, GA | Verdure | + | + | N |
| P5 | Tift, GA | Verdure | - | - | N |
| P6 | Tift, GA | Verdure | - | + | N |
| P7 | Tift, GA | Verdure | - | - | N |
Tabella 1: Rilevamento dell'acqua di irrigazione dalla GA meridionale.
| Tipo di primer | Nome primer | Sequenza 5'-3' | fonte | ||
| Lampada | Scheda PCA3-F3 | TGTGTGTGTTCGATCACA | Questo studio | ||
| Scheda PCA3-B3 | TTTTTGCGTGCGTCCAGA | Questo studio | |||
| PCA3-FIP | GACACCAAGCACTCGTACTOGTTTTTAATTGTGCAGAGGGAGGA | Questo studio | |||
| PCA3-BIP | AGAACGAGTATTCGGCGGCGGCGGCGGCGGCGAAAAAGGACCCGG | Questo studio | |||
| PCA3-LF | TGTCGAATGGATTTGCGATCTT | Questo studio | |||
| PCA3-LB | ATACGCAGGTCATTTGACTGAC | Questo studio | |||
| Pcr | PC-1 | GTCTTGTACCCTATCATGGCG | Ehang et al., 2006 | ||
| PC-2 | CGCCACAGCAGGAAAAGCATT | Ehang et al., 2006 | |||
Tabella 2: Primer utilizzati in questo studio.
| Parametri | Tradizionale | PCR convenzionale | Lampada |
| Sensibilità | Na | 4.8 X 102 spore/ml | 1.2 X 102 spore/ml |
| Ore | 2 settimane o più | 2-3 ore (compresa l'estrazione del DNA) | 30 minuti - 1 ora (compresa l'estrazione del DNA) |
| Preparazione | Creazione di supporti - Placcatura e isolamento e - Progettare una trappola |
- Raccolta spore con carta filtro - estrazione del DNA e - Analisi PCR |
- Raccolta spore con carta filtro - estrazione del DNA e - Analisi LAMP |
| Materiali | Autoclave - Supporti e piatti - Sala di incubazione Cappa di flusso - Melanzane - Cassa di latte |
- Ciclo termico Gel di agar Gel Doc |
Blocco termico o Genie III |
| Costo | 5,00 USD per trappola | 0,60 USD per reazione | 0,75 USD per reazione |
Tabella 3: Confronto dei metodi per il rilevamento di P. capsici.
Figura supplementare 1: Posizione di Tift County, GA e campioni di acqua di irrigazione prelevati da varie posizioni all'interno dello stato. I campioni positivi sono stati mostrati come punti rossi. Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura.
Figura supplementare 2: Progettazione del set primer LAMP. Le frecce mostrano la direzione di come vengono letti i primer. Si prega di fare clic qui per scaricare questa figura.
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Discussion
La sperimentazione dell'acqua di irrigazione per i fitopatogeni è un passo cruciale per i coltivatori che utilizzano stagni di irrigazione e acqua riciclata27. Stagni di irrigazione forniscono un serbatoio e terreno di allevamento per un certo numero di fitopatogeni come acqua di irrigazione in eccesso è diretto dal campo allo stagno portando con sé eventuali agenti patogeni che possono essere statipresenti 16,27. Il metodo tradizionale per il rilevamento di un agente patogeno vegetale in una grande fonte d'acqua consiste nell'impostare un'esca per l'agente patogeno utilizzando tessuti ospite suscettibili (ad esempio, frutta, foglie) sospesi nello stagno e attendere che si verifica un'infezione, quindi rimuovere la frutta/foglie e confermare la diagnosi con microscopia o metodi molecolari13,14. Questi metodi sono limitanti a causa della quantità di tempo necessaria per eseguire il test di rilevamento (2 settimane o più) e la manodopera e le attrezzature necessarie. Inoltre, per risultati accurati sono necessarie una vasta esperienza e conoscenza della diagnosi visiva, della morfologia patogena e della tassonomia. Tecniche molecolari come PCR, qPCR e ibridazione del DNA richiedono molto meno tempo (3-4 h) rispetto ai metodi tradizionali di rilevamento; tuttavia, richiedono attrezzature costose e un ambiente di laboratorio. Inoltre, queste tecniche non consentono la lavorazione di grandi volumi di acqua. Anche i saggi sierologici non sono all'incisi nella loro capacità di rilevazione a causa di reazioni positive non bersaglio e non sono stati sviluppati saggi specifici per le specie di Phytophthora. L'amplificazione isotermica mediata a ciclo (LAMP) è stata recentemente utilizzata come tecnica di diagnosi in loco per il rilevamento rapido e sensibile di più agenti patogeni, poiché il saggio richiede solo una singola temperatura anziché un ciclo termico28,29. LAMP può essere eseguito sul campo utilizzando un colorante colorimetrico per la conferma visiva o utilizzando una macchina di amplificazione in tempo reale per i risultati in meno di un'ora30.
L'obiettivo di questo esperimento era quello di sviluppare un metodo rapido e sensibile per rilevare la presenza di Phytophthora capsici nelle fonti d'acqua in loco o in laboratorio. Per aumentare la velocità di rilevamento e combattere i limiti dei metodi menzionati in precedenza per rilevare P. capsici nell'acqua di irrigazione, abbiamo progettato un metodo utilizzando carta filtrante per catturare le spore ed estrarre il loro DNA da un volume maggiore di acqua. Dopo che le spore sono state catturate utilizzando la tecnica della carta filtro e il DNA è stato estratto, la presenza dell'agente patogeno è stata confermata sulla base di un set di primer LAMP di nuova con progettazione specifico per P. capsici. La sensibilità e la specificità del rilevamento sono state confrontate utilizzando LAMP e PCR. In tutte e 3 le repliche e con tutte le concentrazioni di zoospore, LAMP era un metodo di rilevamento più rapido e sensibile (Tabella 3). Questo metodo non è limitato dall'avere un piccolo volume di campioni come metodi tradizionali, in quanto questo metodo può essere testato fino a 1 L di acqua in una sola volta, aumentando le probabilità di rilevamento di agenti patogeni. È stato notato nel test che versare acqua di irrigazione lentamente attraverso l'imbuto Buchner ad una velocità non superiore a 40 mL al secondo ha aumentato la capacità di cattura delle spore della carta da filtro.
Per convalidare il protocollo di rilevamento, sono stati prelevati anche campioni d'acqua del campo in cui si sospettava che P. capsici fosse presente ( Figura 1 ) per testare il metodo progettato con uno scenario pratico. Delle 7 aziende agricole testate, 3 sono risultate positive per la presenza di P. capsici utilizzando il saggio LAMP (Figura 6A-6C) mentre solo una fattoria è stata positiva quando si utilizza il saggio PCR convenzionale (Figura 6D), mostrando LAMP come un saggio più sensibile per questo metodo di test dell'acqua di irrigazione. Anche se, questo esempio LAMP basato su filtro potrebbe rilevare il DNA da una concentrazione a partire da 1,2 x10 2 zoospores/mL che era significativamente inferiore alla sensibilità originale di questo saggio (0,01 ng DNA genomico equivalente a 5 spore) con sospensione zoospore non filtrata. Il precedente saggio LAMP di Dong et. al. (2015)20 è stato eseguito sulla stessa diluizione seriale e il livello di sensibilità era lo stesso (Figura 2F). Il livello di rilevamento per un test PCR con soluzione di spore non filtrata ha anche mostrato un più alto livello di rilevamento (equivalente a 10 spore) che era molto simile ai precedenti risultati basati su PCR10. Il limite di rilevamento delle spore del metodo di rilevamento tradizionale dell'esca non è stato controllato in quanto una singola spore potrebbe causare infezioni a seconda della sua capacità individuale. La diminuzione della sensibilità riscontrata sia nei saggi LAMP che PCR è probabilmente dovuta ad alcune spore che scorrono attraverso o intorno alla carta da filtro, o una volta attaccate alla carta da filtro, impossibili da estrarre con un'efficienza del 100%. Tuttavia, questo nuovo sistema LAMP e filtro è in grado di elaborare e analizzare un volume d'acqua molto più elevato rispetto ai metodi precedenti e conferisce un livello più elevato di specificità e velocità per il rilevamento sul campo.
Tra i metodi di estrazione utilizzati, l'estrazione a base di perline magnetiche è stata la più rapida e non ha richiesto l'uso di macchine esterne come un battitore di perline o una centrifuga, rendendola utile per le estrazioni sul campo e completa la caratteristica portatile del saggio LAMP. Il metodo basato su CTAB ha prodotto la più alta concentrazione di DNA, ma ha richiesto la più lunga quantità di tempo, mentre il kit di estrazione del DNA della pianta commerciale (ad esempio, DNeasy) è stato secondo sia nel tempo richiesto che nella concentrazione di DNA acquisita.
Sia con CTAB che con il kit commerciale di estrazione del DNA della pianta, durante l'omogeneizzazione della carta da filtro è stato notato che l'omogeneizzazione ha avuto più successo e ha prodotto una maggiore concentrazione se la soluzione CTAB (o buffer di estrazione) è stata aggiunta al tubo con i pezzi di carta da filtro prima che iniziasse il battito del tallone o l'omogeneizzazione della mano. Il battito del tallone è stato fatto 3 volte per un minuto ciascuno, ma il vortice e l'agitazione del tubo tra ogni round era necessario per l'omogeneizzazione completa in tutti i metodi di estrazione. È importante sottolineare che la carta da filtro è soggetta a rimanere bloccata sui lati o sul fondo del tubo, quindi è fondamentale assicurarsi che la carta da filtro sia spenta dalle pareti in modo che venga omogeneizzata.
Il tempo totale richiesto per l'amplificazione è di 90-120 min e può essere fatto facilmente sul campo per la diagnosi in loco. Questo metodo di filtro è anche progettato per filtrare quantità significative di acqua per aumentare le possibili probabilità per il rilevamento dell'agente patogeno. Questo metodo è applicabile anche a molti agenti patogeni che possono accumularsi in una fonte d'acqua, in particolare generi come: Pythium, Phytophthora, Fusariume batteri; l'unico cambiamento richiesto sarà lo sviluppo di un set di primer LAMP altrettanto specifico per l'agente patogenomirato 30.
Una produzione significativa di questo lavoro è lo sviluppo di un saggio LAMP a base di carta a filtro altamente sensibile e rapido per il rilevamento di P. capsici nelle fonti di acqua di irrigazione. Prevediamo che questo studio porterà ad un aumento della consapevolezza della contaminazione dell'acqua di irrigazione riciclata, migliorando infine la gestione delle malattie associate alla fitofrara, e di conseguenza ridurrà i costi di produzione e aumenterà la resa delle colture. Tali informazioni sono molto necessarie per migliorare la sostenibilità della produzione vegetale e migliorare la redditività delle produzioni vegetali.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare o conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questo lavoro ha ricevuto il sostegno finanziario della Georgia Commodity Commission for Vegetables project ID : FP00016659. Gli autori ringraziano la Dott.ssa Pingsheng Ji, Università della Georgia e la Dott.ssa Anne Dorrance, Ohio State University per aver fornito culture pure di Phytophthora spp. Ringraziamo anche Li Wang e Deloris Veney per l'assistenza tecnica durante tutto lo studio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose gel powder | Thomas Scientific | C997J85 | |
| Buchner funnel | Southern Labware | JBF003 | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24 | |
| Centrifuge 5430 | Eppendorf | 22620509 | |
| Chloroform | Fischer Scientific | C298-500 | |
| CTAB solution | Biosciences | 786-565 | |
| Dneasy Extraction Kit | Qiagen | 69104 | |
| Filter Flask | United | FHFL1000 | |
| Filter Paper | United Scientific Supplies | FPR009 | |
| Gel Green 10000X | Thomas Scientific | B003B68 (1/EA) | |
| Genie III | OptiGene | ||
| Hand pump | Thomas Scientific | 1163B06 | |
| Iso-amyl Alcohol | Fischer Scientific | BP1150-500 | |
| LAVA LAMP master mix | Lucigen | 30086-1 | |
| Magnetic bead DNA extraction | Genesig | genesigEASY-EK | |
| Magnetic Separator | Genesig | genesigEASY-MR | |
| polyvinylpyrrolidone | Sigma Aldrich | PVP40-500G | |
| Primers | Sigma Aldrich | ||
| Prism Mini Centrifuge | Labnet | C1801 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| UV Gel Doc | Analytik Jena | 849-00502-2 | |
| Warmstart Colorimetric Dye | Lucigen | E1800m | |
| Wide Mini ReadySub-Cell GT Cell | Bio-Rad | 1704489EDU | |
| 70% isopropanol | Fischer Scientific | A451-1 |
References
- Hong, C., Moorman, G. J. Plant pathogens in irrigation water: challenges and opportunities. Critical Reviews in Plant Sciences. 24 (3), 189-208 (2005).
- Malkawi, H. I., Mohammad, M. J. Physiology, Genetics, Morphology, & Microorganisms, E. o. Survival and accumulation of microorganisms in soils irrigated with secondary treated wastewater. Journal of Basic Microbiology. 43 (1), 47-55 (2003).
- Bush, E. A., Hong, C., Stromberg, E. L. Fluctuations of Phytophthora and Pythium spp. in components of a recycling irrigation system. Plant Disease. 87 (12), 1500-1506 (2003).
- Ghimire, S. R., et al. Distribution and diversity of Phytophthora species in nursery irrigation reservoir adopting water recycling system during winter months. Journal of Phytopathology. 159 (11-12), 713-719 (2011).
- Hausbeck, M. K., Lamour, K. H. Phytophthora capsici on vegetable crops: research progress and management challenges. Plant Disease. 88 (12), 1292-1303 (2004).
- Gevens, A., Donahoo, R., Lamour, K., Hausbeck, M. Characterization of Phytophthora capsici from Michigan surface irrigation water. Phytopathology. 97 (4), 421-428 (2007).
- Thomson, S., Allen, R. Occurrence of Phytophthora species and other potential plant pathogens in recycled irrigation water. Plant Disease Reporter. 58 (10), 945-949 (1974).
- Lamour, K. H., Stam, R., Jupe, J., Huitema, E. The oomycete broad-host-range pathogen Phytophthora capsici. Journal of Molecular Plant Pathology. 13 (4), 329-337 (2012).
- Sanogo, S., Ji, P. Water management in relation to control of Phytophthora capsici in vegetable crops. Agricultural Water Management. 129, 113-119 (2013).
- Zhang, Z., Li, Y., Fan, H., Wang, Y., Zheng, X. Molecular detection of Phytophthora capsici in infected plant tissues, soil and water. Plant Pathology. 55 (6), 770-775 (2006).
- Trout, C., Ristaino, J., Madritch, M., Wangsomboondee, T. Rapid detection of Phytophthora infestans in late blight-infected potato and tomato using PCR. Plant Disease. 81 (9), 1042-1048 (1997).
- Sankaran, S., Mishra, A., Ehsani, R., Davis, C. A review of advanced techniques for detecting plant diseases. Commputers and Electronics in Agriculture. 72 (1), 1-13 (2010).
- Wang, Z., et al. Development of an improved isolation approach and simple sequence repeat markers to characterize Phytophthora capsici populations in irrigation ponds in southern Georgia. Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5467-5473 (2009).
- Ali-Shtayeh, M., MacDonald, J. Occurrence of Phytophthora species in irrigation water in the Nablus area (West Bank of Jordan). Phytopathologia Mediterranea. , 143-150 (1991).
- Pringsh, P. Comparison of serological and culture plate methods for detecting species of Phytophthora, Pythium, and Rhizoctonia in ornamental plants. Plant Disease. 74 (9), 655 (1990).
- Stewart-Wade, S. M. Plant pathogens in recycled irrigation water in commercial plant nurseries and greenhouses: their detection and management. Irrigation Science. 29 (4), 267-297 (2011).
- Aragaki, M., Uchida, J. Y. Morphological distinctions between Phytophthora capsici and P. tropicalis sp. nov. Mycologia. 93 (1), 137-145 (2001).
- Tomlinson, J., Boonham, N. Potential of LAMP for detection of plant pathogens. CAB Reviews Perspectives in Agriculture Veterinary Science Nutrition and Natural Resources. 3 (066), 1-7 (2008).
- Li, P., et al. A PCR-based assay for distinguishing between A1 and A2 mating types of Phytophthora capsici. Journal of the American Society for Horticultural Science. 142 (4), 260-264 (2017).
- Dong, Z., et al. Loop-mediated isothermal amplification assay for sensitive and rapid detection of Phytophthora capsici. Canadian Journal of Plant Pathology. 37 (4), 485-494 (2015).
- Khan, M., et al. Comparative evaluation of the LAMP assay and PCR-based assays for the rapid detection of Alternaria solani. Frontiers in Microbiology. 9, 2089 (2018).
- Sowmya, N., Thakur, M., Manonmani, H. K. Rapid and simple DNA extraction method for the detection of enterotoxigenic Staphylococcus aureus directly from food samples: comparison of PCR and LAMP methods. Journal of Applied Microbiology. 113 (1), 106-113 (2012).
- Waliullah, S., et al. Comparative analysis of different molecular and serological methods for detection of Xylella fastidiosa in blueberry. PLOS ONE. 14 (9), 0221903 (2019).
- Böhm, J., et al. Real-time quantitative PCR: DNA determination in isolated spores of the mycorrhizal fungus Glomus mosseae and monitoring of Phytophthora infestans and Phytophthora citricola in their respective host plants. Journal of Phytopathology. 147, 409-416 (1999).
- Klimczak, L., Prell, H. J. C. Isolation and characterization of mitochondrial DNA of the oomycetous fungus Phytophthora infestans. Current Genetics. 8 (4), 323-326 (1984).
- Ghimire, S. R., et al. Detection of Phytophthora species in a run-off water retention basin at a commercial nursery in plant hardiness zones 7 b of Virginia in winter. Phytopathology. 96 (6), (2006).
- Feng, W., Hieno, A., Kusunoki, M., Suga, H., Kageyama, K. J. P. LAMP detection of four plant-pathogenic oomycetes and its application in lettuce fields. Plant Disease. 103 (2), 298-307 (2019).
- Aglietti, C., et al. Real-time loop-mediated isothermal amplification: an early-warning tool for quarantine plant pathogen detection. AMB Express. 9 (1), 50 (2019).
- Almasi, M. A. Development of a colorimetric loop-mediated isothermal amplification assay for the visual detection of Fusarium oxysporum f. sp. melonis. Horticultural Plant Journal. 5 (3), 129-136 (2019).
- Gill, D. J. Pathogenic Pythium from irrigation ponds. Plant Disease Reporter. 54 (12), 1077-1079 (1970).
