Påvisning af Phytophthora capsici i vandingsvand ved hjælp af Loop-medieret isotermisk forstærkning
Summary
Vi udviklede en metode til at detektere Phytophthora capsici zoospores i vandkilder ved hjælp af et filter papir DNA ekstraktion metode kombineret med en loop-medieret isotermisk forstærkning (LAMP) analyse, der kan analyseres i marken eller i laboratoriet.
Abstract
Phytophthora capsici er en ødelæggende oomycete patogen, der påvirker mange vigtige solanaceous og cucurbit afgrøder forårsager betydelige økonomiske tab i vegetabilsk produktion årligt. Phytophthora capsici er jordbåren og et vedvarende problem i grøntsagsmarker på grund af sin langlivede overlevelse strukturer (oosporer og klamydosporer), der modstår forvitring og nedbrydning. Den vigtigste metode til spredning er gennem produktion af zoosporer, som er encellede, flagellated sporer, der kan svømme gennem tynde film af vand til stede på overflader eller i vandfyldte jordporer og kan ophobes i vandpytter og damme. Derfor kan vanding damme være en kilde til patogenet og de første punkter i sygdomsudbrud. Påvisning af P. capsici i kunstvanding vand er vanskeligt ved hjælp af traditionelle kultur-baserede metoder, fordi andre mikroorganismer til stede i miljøet, såsom Pythium spp., normalt overgrow P. capsici gør det målbart. For at bestemme tilstedeværelsen af P. capsici sporer i vandkilder (vandingsvand, afstrømning, osv.), vi udviklet en hånd pumpe-baseret filter papir (8-10 μm) metode, der fanger patogenets sporer (zoosporer) og senere bruges til at forstærke patogenets DNA gennem en roman loop-medieret isotermisk forstærkelse (LAMP) assay designet til den specifikke forstærkning af Pici caps. Denne metode kan forstærke og detektere DNA fra en koncentration så lavt som 1,2 x 102 zoosporer/ml, hvilket er 40 gange mere følsomt end konventionel PCR. Der blev ikke opnået krydsforstærkning ved afprøvning af nært beslægtede arter. LAMP blev også udført ved hjælp af en kolonmetrisk LAMP master mix farvestof, der viser resultater, der kunne læses med det blotte øje for on-site hurtig detektion. Denne protokol kan tilpasses til andre patogener, der bor, ophobes eller spredes via forurenede vandingssystemer.
Introduction
Genbrug af vand i gårde og planteskoler bliver mere og mere populære på grund af stigningen i vandomkostninger og miljøhensyn bag vandforbruget. Mange vandingsmetoder er blevet udviklet for avlere for at reducere spredningen og forekomsten af plantesygdomme. Uanset kilden til vandet (kunstvanding eller nedbør), afstrømning genereres, og mange grøntsager og planteskole avlere har en dam til at indsamle og genbruge afstrømning1. Dette skaber et reservoir for mulig patogen akkumulering begunstige spredningen af patogener, når det genvundne vand bruges til at overrisleafgrøder 2,3,4. Oomycete plantepatogener især drage fordel af denne praksis som zoosporer vil ophobes i vand og den primære dispersive spore er selv-motile, men kræver overfladevand5,6,7. Phytophthora capsici er et oomycet patogen, der påvirker et betydeligt antal solanaceous og cucurbit afgrøder på forskellige måder8. Ofte er symptomerne dæmpning-off af planter, rod og krone rådne; dog i afgrøder som agurk, squash, melon, græskar, vandmelon, aubergine og peber, kan hele høsten gå tabt på grund af frugt rådne9. Selv om der er kendte metoder til påvisning af dette plantepatogen, kræver de fleste, at der allerede er fundet en infektion, hvilket er for sent til, at eventuelle forebyggende fungicider har enbetydelig virkning 10.
Den traditionelle metode til at teste vandingsvand til påvisning og diagnosticering af målrettede mikroorganismer er en forældet tilgang , når hastighed og følsomhed er afgørende for succes og rentabelafgrødeproduktion 11,12. Plantevæv, der er modtageligt for det målrettede patogen (f.eks. aubergine til P. capsici), er fastgjort til en modificeret fælde, der er suspenderet i en vandings dam i længere tid, før det fjernes og inspiceres for infektion. Prøver fra plantevævet belagt derefter på halvselektive medier (PARPH) og inkuberes for dyrs vækst, hvor derefter udføres morfologisk identifikation ved hjælp af et sammensat mikroskop13. Der findes andre lignende påvisningsmetoder for andre plantepatogener , der anvender selektive medier og plettering af små mængder forurenetvand,før de erunderdyrende 14,15. Disse metoder kræver alt fra 2 til 6 uger, flere runder af sub-culturing at isolere organismen, og erfaring på Phytophthora diagnostik at være i stand til at genkende de vigtigste morfologiske tegn i hver art. Disse traditionelle metoder fungerer ikke godt til påvisning af kunstvanding vand forurenet med P. capsici på grund af faktorer som interferens fra andre mikroorganismer, der også er til stede i vandkilderne. Nogle hurtigt voksende mikroorganismer som Pythium spp. og vandbårne bakterier kan overgrow på pladen gør P. capsici målbart16,17.
Formålet med denne undersøgelse var at udvikle en følsom og specifik molekylær metode, der kan anvendes i både felt- og laboratoriemiljøer til at detektere P. capsici zoosporer i kunstvandingsvand. Protokollen omfatter udvikling af en ny loop-medieret isotermisk forstærkning (LAMP) primer sæt i stand til specifikt at forstærke P. capsici, baseret på en 1121-base par (bp) fragment af P. capsici18,19. En tidligere udviklet LAMP primer fra Dong et al. (2015) blev anvendt i forhold til den analyse, der blev udviklet til denne undersøgelse20.
LAMP-analysen er en forholdsvis ny form for molekylær detektion, der har vist sig at være hurtigere, følsom og specifik end konventionel polymerasekædereaktion (PCR)21. Konventionelle PCR-analyser kan generelt ikke påvise under 500 kopier (1,25 pg/μL); I modsætning hertil har tidligere undersøgelser vist, at LAMP’s følsomhed kan være 10 til 1.000 gange højere end konventionel PCR og let kan detektere selv 1 fg/μL genomisk DNA22,23. Derudover kan analysen udføres hurtigt (ofte i 30 min) og on-site (i marken) ved hjælp af en bærbar varmeblok til forstærkning og et kolormetrisk farvestof, der skifter farve til en positiv prøve (fjerne behovet for elektroforese). I denne undersøgelse sammenlignede vi følsomheden af PCR- og LAMP-analyser ved hjælp af en filterudsugningsmetode. Den foreslåede detektionsmetode gør det muligt for forskere og udvidelsesagenter nemt at detektere tilstedeværelsen af P. capsici sporer fra forskellige vandkilder på mindre end to timer. Analysen har vist sig at være mere følsom end konventionel PCR og blev valideret in situ ved at opdage tilstedeværelsen af patogenet i kunstvandingsvand, der anvendes af en producent. Denne detektionsmetode vil gøre det muligt for avlerne at anslå tilstedeværelsen og befolkningstætheden af patogenet i forskellige vandkilder, der anvendes til kunstvanding, forhindre ødelæggende udbrud og økonomiske tab.
Protocol
Representative Results
Discussion
Afprøvning af vandingsvand til fytopatogener er et afgørende skridt for avlere, der bruger kunstvanding damme og genanvendtvand 27. Kunstvanding damme giver et reservoir og yngleplads for en række fytopatogener som overskydende kunstvanding vand er rettet fra marken til dammen transporterer med det eventuelle patogener, der kan have værettil stede 16,27. Den traditionelle metode til påvisning af en plantepatogener i en stor vandkilde …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde modtog økonomisk støtte fra Georgien Commodity Commission for Grøntsager projekt ID # FP00016659. Forfatterne takker Dr. Pingsheng Ji, University of Georgia og Dr. Anne Dorrance, Ohio State University for at give rene kulturer Phytophthora spp. Vi takker også Li Wang og Deloris Veney for deres tekniske bistand gennem hele undersøgelsen.
Materials
| Agarose gel powder | Thomas Scientific | C997J85 | |
| Buchner funnel | Southern Labware | JBF003 | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24 | |
| Centrifuge 5430 | Eppendorf | 22620509 | |
| Chloroform | Fischer Scientific | C298-500 | |
| CTAB solution | Biosciences | 786-565 | |
| Dneasy Extraction Kit | Qiagen | 69104 | |
| Filter Flask | United | FHFL1000 | |
| Filter Paper | United Scientific Supplies | FPR009 | |
| Gel Green 10000X | Thomas Scientific | B003B68 (1/EA) | |
| Genie III | OptiGene | ||
| Hand pump | Thomas Scientific | 1163B06 | |
| Iso-amyl Alcohol | Fischer Scientific | BP1150-500 | |
| LAVA LAMP master mix | Lucigen | 30086-1 | |
| Magnetic bead DNA extraction | Genesig | genesigEASY-EK | |
| Magnetic Separator | Genesig | genesigEASY-MR | |
| polyvinylpyrrolidone | Sigma Aldrich | PVP40-500G | |
| Primers | Sigma Aldrich | ||
| Prism Mini Centrifuge | Labnet | C1801 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| UV Gel Doc | Analytik Jena | 849-00502-2 | |
| Warmstart Colorimetric Dye | Lucigen | E1800m | |
| Wide Mini ReadySub-Cell GT Cell | Bio-Rad | 1704489EDU | |
| 70% isopropanol | Fischer Scientific | A451-1 |
References
- Hong, C., Moorman, G. J. Plant pathogens in irrigation water: challenges and opportunities. Critical Reviews in Plant Sciences. 24 (3), 189-208 (2005).
- Malkawi, H. I., Mohammad, M. J. Physiology, Genetics, Morphology, & Microorganisms, E. o. Survival and accumulation of microorganisms in soils irrigated with secondary treated wastewater. Journal of Basic Microbiology. 43 (1), 47-55 (2003).
- Bush, E. A., Hong, C., Stromberg, E. L. Fluctuations of Phytophthora and Pythium spp. in components of a recycling irrigation system. Plant Disease. 87 (12), 1500-1506 (2003).
- Ghimire, S. R., et al. Distribution and diversity of Phytophthora species in nursery irrigation reservoir adopting water recycling system during winter months. Journal of Phytopathology. 159 (11-12), 713-719 (2011).
- Hausbeck, M. K., Lamour, K. H. Phytophthora capsici on vegetable crops: research progress and management challenges. Plant Disease. 88 (12), 1292-1303 (2004).
- Gevens, A., Donahoo, R., Lamour, K., Hausbeck, M. Characterization of Phytophthora capsici from Michigan surface irrigation water. Phytopathology. 97 (4), 421-428 (2007).
- Thomson, S., Allen, R. Occurrence of Phytophthora species and other potential plant pathogens in recycled irrigation water. Plant Disease Reporter. 58 (10), 945-949 (1974).
- Lamour, K. H., Stam, R., Jupe, J., Huitema, E. The oomycete broad-host-range pathogen Phytophthora capsici. Journal of Molecular Plant Pathology. 13 (4), 329-337 (2012).
- Sanogo, S., Ji, P. Water management in relation to control of Phytophthora capsici in vegetable crops. Agricultural Water Management. 129, 113-119 (2013).
- Zhang, Z., Li, Y., Fan, H., Wang, Y., Zheng, X. Molecular detection of Phytophthora capsici in infected plant tissues, soil and water. Plant Pathology. 55 (6), 770-775 (2006).
- Trout, C., Ristaino, J., Madritch, M., Wangsomboondee, T. Rapid detection of Phytophthora infestans in late blight-infected potato and tomato using PCR. Plant Disease. 81 (9), 1042-1048 (1997).
- Sankaran, S., Mishra, A., Ehsani, R., Davis, C. A review of advanced techniques for detecting plant diseases. Commputers and Electronics in Agriculture. 72 (1), 1-13 (2010).
- Wang, Z., et al. Development of an improved isolation approach and simple sequence repeat markers to characterize Phytophthora capsici populations in irrigation ponds in southern Georgia. Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5467-5473 (2009).
- Ali-Shtayeh, M., MacDonald, J. Occurrence of Phytophthora species in irrigation water in the Nablus area (West Bank of Jordan). Phytopathologia Mediterranea. , 143-150 (1991).
- Pringsh, P. Comparison of serological and culture plate methods for detecting species of Phytophthora, Pythium, and Rhizoctonia in ornamental plants. Plant Disease. 74 (9), 655 (1990).
- Stewart-Wade, S. M. Plant pathogens in recycled irrigation water in commercial plant nurseries and greenhouses: their detection and management. Irrigation Science. 29 (4), 267-297 (2011).
- Aragaki, M., Uchida, J. Y. Morphological distinctions between Phytophthora capsici and P. tropicalis sp. nov. Mycologia. 93 (1), 137-145 (2001).
- Tomlinson, J., Boonham, N. Potential of LAMP for detection of plant pathogens. CAB Reviews Perspectives in Agriculture Veterinary Science Nutrition and Natural Resources. 3 (066), 1-7 (2008).
- Li, P., et al. A PCR-based assay for distinguishing between A1 and A2 mating types of Phytophthora capsici. Journal of the American Society for Horticultural Science. 142 (4), 260-264 (2017).
- Dong, Z., et al. Loop-mediated isothermal amplification assay for sensitive and rapid detection of Phytophthora capsici. Canadian Journal of Plant Pathology. 37 (4), 485-494 (2015).
- Khan, M., et al. Comparative evaluation of the LAMP assay and PCR-based assays for the rapid detection of Alternaria solani. Frontiers in Microbiology. 9, 2089 (2018).
- Sowmya, N., Thakur, M., Manonmani, H. K. Rapid and simple DNA extraction method for the detection of enterotoxigenic Staphylococcus aureus directly from food samples: comparison of PCR and LAMP methods. Journal of Applied Microbiology. 113 (1), 106-113 (2012).
- Waliullah, S., et al. Comparative analysis of different molecular and serological methods for detection of Xylella fastidiosa in blueberry. PLOS ONE. 14 (9), 0221903 (2019).
- Böhm, J., et al. Real-time quantitative PCR: DNA determination in isolated spores of the mycorrhizal fungus Glomus mosseae and monitoring of Phytophthora infestans and Phytophthora citricola in their respective host plants. Journal of Phytopathology. 147, 409-416 (1999).
- Klimczak, L., Prell, H. J. C. Isolation and characterization of mitochondrial DNA of the oomycetous fungus Phytophthora infestans. Current Genetics. 8 (4), 323-326 (1984).
- Ghimire, S. R., et al. Detection of Phytophthora species in a run-off water retention basin at a commercial nursery in plant hardiness zones 7 b of Virginia in winter. Phytopathology. 96 (6), (2006).
- Feng, W., Hieno, A., Kusunoki, M., Suga, H., Kageyama, K. J. P. LAMP detection of four plant-pathogenic oomycetes and its application in lettuce fields. Plant Disease. 103 (2), 298-307 (2019).
- Aglietti, C., et al. Real-time loop-mediated isothermal amplification: an early-warning tool for quarantine plant pathogen detection. AMB Express. 9 (1), 50 (2019).
- Almasi, M. A. Development of a colorimetric loop-mediated isothermal amplification assay for the visual detection of Fusarium oxysporum f. sp. melonis. Horticultural Plant Journal. 5 (3), 129-136 (2019).
- Gill, D. J. Pathogenic Pythium from irrigation ponds. Plant Disease Reporter. 54 (12), 1077-1079 (1970).
