लूप-मध्यस्थता आइसोथर्मल प्रवर्धन का उपयोग करके सिंचाई जल में फाइटोफथोरा कैप्सिकी का पता लगाना
Summary
हमने एक फिल्टर पेपर डीएनए निष्कर्षण विधि का उपयोग करके जल स्रोतों में फाइटोफथोरा कैप्सपोर का पता लगाने के लिए एक विधि विकसित की है, जिसमें लूप-मध्यस्थता आइसोथर्मल प्रवर्धन (लैंप) परख है जिसका विश्लेषण क्षेत्र में या प्रयोगशाला में किया जा सकता है।
Abstract
फाइटोफथोरा कैप्सिकी एक विनाशकारी ओमीसेट रोगजनक है जो कई महत्वपूर्ण सोलनसियस और कुकुरबिट फसलों को प्रभावित करता है जिससे सब्जी उत्पादन में सालाना महत्वपूर्ण आर्थिक नुकसान होता है। फाइटोफथोरा कैप्सिकी मिट्टी जनित है और सब्जी के खेतों में एक लगातार समस्या है क्योंकि इसकी लंबे समय से जीवित रहने वाली जीवित संरचनाओं (ओस्पोर और क्लैमाइडोसपोर्स) के कारण मौसम और गिरावट का विरोध होता है। फैलाव की मुख्य विधि चिड़ियाघरों के उत्पादन के माध्यम से है, जो एकल कोशिकीय, ध्वजारोहण बीजाणु हैं जो सतहों पर या पानी से भरे मिट्टी के छिद्रों में मौजूद पानी की पतली फिल्मों के माध्यम से तैर सकते हैं और पोखर और तालाबों में जमा हो सकते हैं। इसलिए सिंचाई तालाब रोगजनक और रोग फैलने के शुरुआती बिंदुओं का स्रोत हो सकते हैं। सिंचाई के पानी में पी कैप्सिकी का पता लगाना पारंपरिक संस्कृति आधारित तरीकों का उपयोग करना मुश्किल है क्योंकि पर्यावरण में मौजूद अन्य सूक्ष्मजीव, जैसे पाइथियम एसपीपी, आमतौर पर ओवरग्रो पी कैप्सिकी इसे अज्ञेय बनाता है। पी की उपस्थिति निर्धारित करना। जल स्रोतों (सिंचाई जल, अपवाह, आदि) में शिमला मिर्च बीजाणु, हमने एक हैंडपंप-आधारित फिल्टर पेपर (8-10 माइक्रोन) विधि विकसित की जो रोगजनक के बीजाणुओं (चिड़ियाघरों) को कैप्चर करती है और बाद में पी के विशिष्ट प्रवर्धन के लिए डिज़ाइन किए गए उपन्यास लूप-मध्यस्थता आइसोथेरमल एम्पलीफिकेशन (लैंप) परख के माध्यम से रोगजनक के डीएनए को बढ़ाना करने के लिए उपयोग किया जाता है। यह विधि 1.2 x 10 2 चिड़ियाघरों/एमएल2 के रूप में कम एकाग्रता से डीएनए को बढ़ाना और पता लगा सकती है, जो पारंपरिक पीसीआर की तुलना में ४० गुना अधिक संवेदनशील है । बारीकी से संबंधित प्रजातियों का परीक्षण करते समय कोई क्रॉस-प्रवर्धन प्राप्त नहीं किया गया था। लैंप को एक कोलोरिमेट्रिक लैंप मास्टर मिक्स डाई का उपयोग करके भी किया गया था, जिसमें उन परिणामों को प्रदर्शित किया गया था जिन्हें ऑन-साइट रैपिड डिटेक्शन के लिए नग्न आंखों से पढ़ा जा सकता था। इस प्रोटोकॉल को अन्य रोगजनकों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है जो दूषित सिंचाई प्रणालियों के माध्यम से रहते हैं, जमा होते हैं या फैलाए जाते हैं।
Introduction
खेतों और नर्सरी में पानी रीसाइक्लिंग पानी की लागत में वृद्धि और पानी के उपयोग के पीछे पर्यावरण चिंताओं के कारण तेजी से लोकप्रिय होता जा रहा है । पौधों की बीमारी के फैलाव और घटना को कम करने के लिए उत्पादकों के लिए कई सिंचाई विधियां विकसित की गई हैं । पानी (सिंचाई या वर्षा) के स्रोत के बावजूद, अपवाह उत्पन्न होता है, और कई सब्जी और नर्सरी उत्पादकों के पास अपवाह1को इकट्ठा करने और रीसायकल करने के लिए एक तालाब है। यह संभावित रोगजनक संचय के लिए एक जलाशय बनाता है जो रोगजनकों के प्रसार के पक्ष में होता है जब पुनर्नवीनीकरण पानी का उपयोग फसलों की सिंचाई के लिए किया जाता है2,3,4. ओमिसेट पौधे के रोगजनक विशेष रूप से इस अभ्यास से लाभान्वित होते हैं क्योंकि चिड़ियाघर के बीजाणु पानी में जमा हो जाएंगे और प्राथमिक फैलाव बीजाणु आत्म-गतिशील होता है लेकिन इसके लिए सतही जल5,,6,7कीआवश्यकता होती है। फाइटोफथोरा कैप्सिकी एक ओमोफिसेट रोगजनक है जो विभिन्न तरीकों से काफी संख्या में सोलनसियस और क्यूकरबिट फसलों को प्रभावित करता है8. अक्सर, लक्षण रोपण, जड़ और मुकुट सड़ांध के बंद होते हैं; हालांकि, ककड़ी, स्क्वैश, तरबूज, कद्दू, तरबूज, बैंगन और काली मिर्च के रूप में फसलों में, पूरी फसल फल सड़ांध9के कारण खो सकता है . यद्यपि इस पौधे के रोगजनक का पता लगाने के ज्ञात तरीके हैं, अधिकांश को पहले से ही संक्रमण की आवश्यकता होती है जो किसी भी निवारक कवकनाशकों के लिए बहुत देर हो चुकी है10महत्वपूर्ण प्रभाव है।
लक्षित सूक्ष्मजीवों का पता लगाने और निदान के लिए सिंचाई के पानी का परीक्षण करने की पारंपरिक विधि एक प्राचीन दृष्टिकोण है जब गति और संवेदनशीलता सफलता और लाभदायक फसल उत्पादन के लिए महत्वपूर्ण है11,12. लक्षित रोगजनक के लिए अतिसंवेदनशील पौधे के ऊतक (उदाहरण के लिए, पी कैप्सिकीके लिए बैंगन) एक संशोधित जाल से जुड़ा हुआ है जिसे संक्रमण के लिए हटाया और निरीक्षण करने से पहले विस्तारित अवधि के लिए सिंचाई तालाब में निलंबित कर दिया जाता है। पौधे के ऊतकों से नमूने फिर अर्ध-चयनात्मक मीडिया (PARPH) पर चढ़ाया जाता है और संस्कृति के विकास के लिए इनक्यूबेटेड होता है, फिर यौगिक माइक्रोस्कोप13का उपयोग करके रूपात्मक पहचान की जाती है। चुनिंदा मीडिया का उपयोग करके अन्य पौधों के रोगजनकों के लिए अन्य समान पहचान के तरीके हैं और14,,15से पहले दूषित पानी की थोड़ी मात्रा में चढ़ाना है। इन तरीकों को 2 से 6 सप्ताह तक कहीं भी आवश्यकता होती है, जीव को अलग करने के लिए उप-संस्कृति के कई दौर, और प्रत्येक प्रजाति के प्रमुख रूपात्मक पात्रों को पहचानने में सक्षम होने के लिए फाइटोफथोरा निदान पर अनुभव। ये पारंपरिक तरीके जल स्रोतों में मौजूद अन्य सूक्ष्मजीवों के हस्तक्षेप जैसे कारकों के कारण पी कैप्सी द्वारा दूषित सिंचाई जल का पता लगाने के लिए अच्छी तरह से काम नहीं करते हैं । पिथियम एसपीपी और जल जनित जीवाणु जैसे कुछ तेजी से बढ़ते सूक्ष्मजीव प्लेट पर अधिक वृद्धि कर सकते हैं जिससे पी कैप्सिकी अज्ञेय16,,17हो सकती है ।
इस अध्ययन का उद्देश्य एक संवेदनशील और विशिष्ट आणविक विधि विकसित करना था जिसका उपयोग सिंचाई के पानी में पी कैप्सी चिड़ियाघरों का पता लगाने के लिए क्षेत्र और प्रयोगशाला दोनों सेटिंग्स में किया जा सकता है। प्रोटोकॉल में पी कैप्सिकी,18, 19 के 1121-बेस जोड़ी (बीपी) टुकड़े के आधार पर विशेष रूप से पी कैप्सिकीको बढ़ाने में सक्षम एक उपन्यास लूप-मध्यस्थता इसोथर्मल प्रवर्धन (लैंप) प्राइमर का विकास शामिल19 है।18 डोंग एट अल (2015) से पहले विकसित लैंप प्राइमर का उपयोग इस अध्ययन20के लिए विकसित की गई परख की तुलना में किया गया था।
लैंप परख आणविक पहचान का एक अपेक्षाकृत नया रूप है जिसे पारंपरिक पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (पीसीआर)21की तुलना में अधिक तेजी से, संवेदनशील और विशिष्ट होने का प्रदर्शन किया गया है। सामान्य तौर पर, पारंपरिक पीसीआर परख 500 प्रतियों (1.25 स्नातकोत्तर/μL) के तहत पता नहीं लगा सकता है; इसके विपरीत, पिछले अध्ययनों से पता चला है कि लैंप की संवेदनशीलता पारंपरिक पीसीआर की तुलना में 10 से 1,000 गुना अधिक हो सकती है और आसानी से जीनोमिक डीएनए22, 23,23के 1 fg/μL का भी पता लगा सकती है। इसके अतिरिक्त, परख तेजी से किया जा सकता है (अक्सर 30 मिनट में) और साइट पर (क्षेत्र में) प्रवर्धन के लिए एक पोर्टेबल हीटिंग ब्लॉक और एक कोलोरिमेट्रिक डाई का उपयोग करके जो एक सकारात्मक नमूने के लिए रंग बदलता है (इलेक्ट्रोफोरेसिस की आवश्यकता को हटाना)। इस अध्ययन में, हमने फिल्टर निष्कर्षण विधि का उपयोग करके पीसीआर और लैंप की संवेदनशीलता की तुलना की। प्रस्तावित पहचान विधि शोधकर्ताओं और विस्तार एजेंटों को आसानी से दो घंटे से भी कम समय में विभिन्न जल स्रोतों से पी कैप्सी बीजाणुओं की उपस्थिति का पता लगाने की अनुमति देती है । परख पारंपरिक पीसीआर की तुलना में अधिक संवेदनशील साबित होती है और एक उत्पादक द्वारा उपयोग किए जाने वाले सिंचाई पानी में रोगजनक की उपस्थिति का पता लगाकर सीटू में मान्य किया गया था। यह पता लगाने की विधि उत्पादकों को सिंचाई के लिए इस्तेमाल किए जा रहे विभिन्न जल स्रोतों में रोगजनक की उपस्थिति और जनसंख्या घनत्व का अनुमान लगाने की अनुमति देगी, जिससे विनाशकारी प्रकोपों और आर्थिक नुकसान को रोका जा सकेगा ।
Protocol
Representative Results
Discussion
फाइटोपैथोजन के लिए सिंचाई के पानी की जांच सिंचाई तालाबों और पुनर्नवीनीकरणजलका उपयोग करने वाले उत्पादकों के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है । सिंचाई तालाब कई फाइटोपैथोजन के लिए एक जलाशय और प्रजनन स?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को जॉर्जिया कमोडिटी कमीशन फॉर मज़ेज प्रोजेक्ट आईडी # FP00016659 की वित्तीय मदद मिली। लेखकों ने फाइटोफथोरा एसपीपीकी शुद्ध संस्कृतियों को उपलब्ध कराने के लिए जॉर्जिया विश्वविद्यालय के डॉ पिंगशेंग जी और ओहियो स्टेट यूनिवर्सिटी के डॉ ऐनी डोरेंस का शुक्रिया अदा किया । हम पूरे अध्ययन में उनकी तकनीकी सहायता के लिए ली वांग और डेलोरिस वेनी को भी धन्यवाद देते हैं ।
Materials
| Agarose gel powder | Thomas Scientific | C997J85 | |
| Buchner funnel | Southern Labware | JBF003 | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24 | |
| Centrifuge 5430 | Eppendorf | 22620509 | |
| Chloroform | Fischer Scientific | C298-500 | |
| CTAB solution | Biosciences | 786-565 | |
| Dneasy Extraction Kit | Qiagen | 69104 | |
| Filter Flask | United | FHFL1000 | |
| Filter Paper | United Scientific Supplies | FPR009 | |
| Gel Green 10000X | Thomas Scientific | B003B68 (1/EA) | |
| Genie III | OptiGene | ||
| Hand pump | Thomas Scientific | 1163B06 | |
| Iso-amyl Alcohol | Fischer Scientific | BP1150-500 | |
| LAVA LAMP master mix | Lucigen | 30086-1 | |
| Magnetic bead DNA extraction | Genesig | genesigEASY-EK | |
| Magnetic Separator | Genesig | genesigEASY-MR | |
| polyvinylpyrrolidone | Sigma Aldrich | PVP40-500G | |
| Primers | Sigma Aldrich | ||
| Prism Mini Centrifuge | Labnet | C1801 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | |
| UV Gel Doc | Analytik Jena | 849-00502-2 | |
| Warmstart Colorimetric Dye | Lucigen | E1800m | |
| Wide Mini ReadySub-Cell GT Cell | Bio-Rad | 1704489EDU | |
| 70% isopropanol | Fischer Scientific | A451-1 |
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