Caratterizzazione citometrica a flusso dello sviluppo delle cellule B murine

Summary

Descriviamo qui una semplice analisi dell’eterogeneità del compartimento delle cellule B immunitarie murine nel peritoneo, nella milza e nei tessuti del midollo osseo mediante citometria a flusso. Il protocollo può essere adattato ed esteso ad altri tessuti di topo.

Abstract

Studi approfonditi hanno caratterizzato lo sviluppo e la differenziazione delle cellule B murine negli organi linfoidi secondari. Gli anticorpi secreti dalle cellule B sono stati isolati e sviluppati in terapie ben consolidate. La convalida dello sviluppo delle cellule B murine, nel contesto di topi autoimmuni o in topi con sistema immunitario modificato, è una componente cruciale dello sviluppo o della sperimentazione di agenti terapeutici nei topi ed è un uso appropriato della citometria a flusso. Parametri citometrici a flusso di cellule B ben consolidati possono essere utilizzati per valutare lo sviluppo delle cellule B nel peritoneo murino, nel midollo osseo e nella milza, ma è necessario rispettare una serie di migliori pratiche. Inoltre, l’analisi citometrica a flusso dei compartimenti delle cellule B dovrebbe anche integrare ulteriori letture dello sviluppo delle cellule B. I dati generati utilizzando questa tecnica possono migliorare la nostra comprensione di modelli murini selvatici, autoimmuni e di topi umanizzati che possono essere utilizzati per generare anticorpi o molecole simili a anticorpi come terapeutici.

Introduction

Gli anticorpi monoclonali sono diventati sempre più la terapia di scelta per molte malattie umane in quanto entrano a far parte della medicina ^{tradizionale1,2}. Abbiamo precedentemente descritto topi geneticamente modificati che producono in modo efficiente anticorpi che ospitano regioni variabili completamente umane con costanti IgH di ^topo3,4. Più recentemente, abbiamo descritto topi geneticamente modificati che producono molecole simili a anticorpi che hanno un legame antigene ^distinto5. Gli anticorpi sono secreti dalle cellule B e costituiscono la base dell’immunità umorale adattativa. Esistono due tipi distinti di cellule B, B-1 e B-2. Nei mammiferi, le cellule B-1 hanno origine nel fegato fetale e sono arricchite nei tessuti mucosi e nelle cavità pleurica e peritoneale dopo la nascita, mentre le cellule B-2 hanno origine nel fegato fetale prima della nascita e successivamente nel midollo osseo (BM). Le cellule B-2 sono arricchite negli organi linfoidi secondari tra cui la milza e il ^sangue6,7,8. Nel BM, i progenitori ematopoietici B-2 iniziano a differenziarsi in cellule pro-B all’inizio del riarrangiamento della catena pesante Ig ^mu9,10. Il riarrangiamento riuscito della catena pesante Ig e il suo assemblaggio nel recettore delle cellule pre-B (pre-BCR), insieme alla segnalazione e all’espansione proliferativa, porta alla differenziazione in cellule pre-B. Dopo che le cellule pre-B riorganizzano le loro catene leggere Ig kappa (Igκ), o se improduttive, Ig lambda (Igλ), si accoppiano con μ catena pesante, con conseguente espressione superficiale di IgM BCR. È importante sottolineare che l’espressione superficiale delle IgM è nota per essere ridotta in condizioni di autoreattività, contribuendo così all’autotolleranza nelle cellule B funzionalmente non reattive o anergiche11,12. Le cellule B immature entrano quindi in una fase di transizione, dove iniziano a co-esprimere IgD e migrano dal BM alla milza. Nella milza, l’espressione di IgD aumenta ulteriormente e le cellule maturano in un secondo stadio di cellule B di transizione, seguito dal completamento del loro stato di maturazione e dallo sviluppo in cellule della zona marginale (MZ) o follicolari (Fol)13,14,15. Nei topi adulti, in un ambiente non malato, il numero di cellule B mature rimane costante nonostante 10-20 milioni di cellule B immature vengano generate quotidianamente nel BM. Di questi, solo il tre per cento entra nel pool di cellule B mature. La dimensione del compartimento periferico delle cellule B è limitata dalla morte cellulare, dovuta in parte a diversi fattori tra cui l’auto-reattività e la maturazione incompleta16,17,18. L’analisi citometrica a flusso è stata ampiamente utilizzata per caratterizzare ed enumerare molti sottocompartimenti delle cellule immunitarie negli esseri umani e nei topi. Mentre ci sono alcune somiglianze tra compartimenti di cellule B umane e murine, questo protocollo si applica solo all’analisi delle cellule B murine. Questo protocollo è stato sviluppato con lo scopo di fenotipizzare topi geneticamente modificati, per determinare se la manipolazione genetica avrebbe alterato lo sviluppo delle cellule B. La citometria a flusso è stata anche molto popolare in molte applicazioni aggiuntive, tra cui la misurazione dell’attivazione cellulare, della funzione, della proliferazione, dell’analisi del ciclo, dell’analisi del contenuto del DNA, dell’apoptosi e dello smistamento cellulare ^19,20.

La citometria a flusso è lo strumento di scelta per caratterizzare vari compartimenti linfocitari nei topi e nell’uomo, anche in organi complessi come la milza, il BM e il sangue. Grazie ai reagenti anticorpali specifici del topo ampiamente disponibili per la citometria a flusso, questa tecnica può essere utilizzata per studiare non solo le proteine di superficie cellulare, ma anche le fosfoproteine intracellulari e le citochine, nonché le letture ^funzionali21. Qui dimostriamo come i reagenti per citometria a flusso possono essere utilizzati per identificare i sottoinsiemi di cellule B man mano che maturano e si differenziano negli organi linfoidi secondari. Dopo l’ottimizzazione delle condizioni di colorazione, la gestione dei campioni, la corretta configurazione dello strumento e l’acquisizione dei dati e, infine, l’analisi dei dati, è possibile utilizzare un protocollo per l’analisi citometrica a flusso completa del compartimento delle cellule B nei topi. Tale analisi completa si basa su una nomenclatura vecchia di decenni ideata da Hardy e colleghi, in cui lo sviluppo di cellule BM B-2 può essere diviso in diverse frazioni (Frazione) a seconda della loro espressione di B220, CD43, BP-1, CD24, IgM e ^IgD22. Hardy et al., hanno dimostrato che le cellule B220⁺ CD43 BM B possono essere suddivise in quattro sottoinsiemi (Frazione A-C’) sulla base dell’espressione DI BP-1 e CD24 (30F1), mentre le cellule B220⁺ CD43^{-(dim to neg)} possono essere risolte in tre sottoinsiemi (Frazione D-F) basati sull’espressione differenziale di IgD e IgM23 di superficie. La frazione A (cellule pre-pro-B) è definita come BP-1^– CD24 (30F1)^–, la frazione B (prime cellule pro-B) è definita come BP-1^– CD24 (30F1)⁺, la frazione C (cellule pro-B tardive) è definita come BP-1⁺ CD24 (30F1)⁺, e la frazione C’ (prime cellule pre-B) è definita come BP-1⁺ e CD24high. Inoltre, la Frazione D (cellule pre-B) è definita come B220⁺ CD43^– IgM^– B, e la Frazione E (cellule B di nuova generazione, combinazione di cellule immature e transitorie) è definita come B220⁺ CD43^– IgM⁺ B cells e la Frazione F (cellule B mature, a ricircolo) è definita come B220high CD43^– IgM⁺ B cells. Al contrario, la maggior parte delle cellule B naïve presenti nella milza può essere suddivisa in cellule B mature (B220⁺ CD93^–) e cellule transizionali (T1, T2, T3) a seconda dell’espressione di CD93, CD23 e IgM. Le cellule B mature possono essere risolte in zone marginali e sottoinsiemi follicolari basati sull’espressione di IgM e CD21/CD35, e sottoinsiemi follicolari possono essere ulteriormente suddivisi in sottoinsiemi follicolari maturi di tipo I e follicolari di tipo II B a seconda del livello della loro espressione superficiale IgM e ^IgD24. Queste popolazioni di cellule B spleniche esprimono prevalentemente la catena leggera Igκ. Infine, in letteratura sono state descritte popolazioni di cellule B-1 B, che hanno origine nel fegato fetale e si trovano principalmente nelle cavità peritoneale e pleurica di topi adulti. Queste cellule B peritoneali possono essere distinte dalle cellule B-2 B precedentemente descritte per la loro mancanza di espressione di CD23. Sono poi ulteriormente suddivisi in popolazioni B-1a o B-1b, con la prima definita dalla presenza di CD5 e la seconda dalla sua ^assenza25. I progenitori delle cellule B-1 sono abbondanti nel fegato fetale, ma non si trovano nel BM adulto. Mentre le cellule B-1a e B-1b provengono da diversi progenitori, entrambe seminano le cavità peritoneale e ^pleurica24. A differenza delle cellule B-2, le cellule B-1 sono in grado di auto-rinnovarsi e sono responsabili della produzione di anticorpi IgM naturali.

Difetti nello sviluppo delle cellule B possono insorgere in molti casi, tra cui carenze nei componenti del ^BCR26,27, perturbazioni di molecole di segnalazione che influenzano la potenza di segnalazione BCR14,28,29, o interruzione delle citochine che modulano la sopravvivenza delle cellule ^B30,31 . L’analisi citometrica a flusso dei compartimenti linfoidi ha contribuito alla caratterizzazione dei blocchi di sviluppo delle cellule B in questi topi e in molti altri. Un vantaggio dell’analisi citometrica a flusso dei compartimenti linfoidi è che offre la possibilità di effettuare misurazioni su singole cellule ottenute da tessuto dissociato vivo. La disponibilità di reagenti in una gamma sempre più ampia di fluorofori consente l’analisi simultanea di più parametri e consente la valutazione dell’eterogeneità delle cellule B. Inoltre, l’enumerazione delle cellule B mediante analisi citometrica a flusso integra altri saggi immunologici come i metodi immunoistochimici che visualizzano la localizzazione cellulare all’interno degli organi linfoidi, il rilevamento dei livelli di anticorpi circolanti come misura dell’immunità umorale, nonché due microscopi a fotoni per misurare le risposte delle cellule B nello spazio e nel tempo ^reali32.

Protocol

Tutti gli studi sui topi sono stati supervisionati e approvati dall’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) di Regeneron. L’esperimento è stato condotto su tessuti di tre topi femmina C57BL / 6J (17 settimane di età) dei Jackson Laboratories. Titolare tutti gli anticorpi prima di iniziare l’esperimento per determinare la concentrazione ideale. Quando si utilizzano perline di compensazione per la compensazione monocolore, assicurarsi che siano brillanti o più luminose dei campioni. Mantenere tutti i tamponi…

Representative Results

Qui presentiamo la strategia di gating per caratterizzare lo sviluppo delle cellule B nel peritoneo di topo, nel BM e nella milza. La base dell’analisi si forma attorno al concetto di colorazione con colorante di vitalità, quindi estraendo doppietti basati su Forward-Scatter-Area (FSC-A) e Forward-Scatter-Height (FSC-H), e infine estraendo i detriti selezionando le celle in base alle loro caratteristiche FSC-A e Side-Scatter-Area (SSC-A), qui indicate come size gate, che riflettono la di…

Discussion

L’analisi citometrica a flusso di tessuti linfoidi e non linfoidi ha permesso l’identificazione simultanea e l’enumerazione delle sottopopolazioni di cellule B nei topi e negli esseri umani dal 1980. È stato usato come misura dell’immunità umorale e può essere applicato ulteriormente per valutare la funzionalità delle cellule B. Questo metodo sfrutta la disponibilità di reagenti per valutare le diverse fasi della maturazione delle cellule B nei topi e nell’uomo, attraverso l’analisi simultanea di più parametri che …

Materials

0.5 mL safe-lock Eppendorf tubes	Eppendorf	22363611	0.5 mL microcentrifuge tube
1.5mL Eppendorf tubes	Eppendorf	22364111	1.5 mL microcentrifuge tube
15 mL Falcon tubes	Corning	352097	15 mL conical tube
18 gauge needle	BD	305196
25 gauge needle	BD	305124
3 mL syringe	BD	309657
70 mM MACS SmartStrainer	Miltenyi Biotec	130-110-916	70 mM cell strainer
96 well U bottom plate	VWR	10861-564
ACK lysis buffer	GIBCO	A1049201	red blood cell lysis buffer
Acroprep Advance 96 Well Filter Plate	Pall Corporation	8027	filter plate
B220	eBiosciences	17-0452-82
BD CompBead Anti-Mouse Ig/κ	BD	552843	compensation beads
BD CompBead Anti-Rat Ig/κ	BD	552844	compensation beads
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A8577	BSA
BP-1	BD	740882
Brilliant Stain Buffer	BD	566349	brilliant stain buffer
C-Kit	BD	564011
CD11b	BD	563168
CD11b	BioLegend	101222
CD19	BD	560143
CD21/35	BD	562756
CD23	BD	740216
CD24 (HSA)	BioLegend	138504
CD3	BD	561388
CD3	BioLegend	100214
CD43	BD	553270
CD43	BioLegend	121206
CD5	BD	563194
CD93	BD	740750
CD93	BioLegend	136504
DPBS (1x)	ThermoFisher	14190-144	DPBS
eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 506	ThermoFisher	65-0866-14	viability dye
Extended Fine Tip Transfer Pipette	Samco	233	disposable transfer pipette
FACSymphony A3 flow cytometer	BD	custom order	flow cytometer
Fc Block, CD16/CD32 (2.4G2)	BD	553142	Fc block
FlowJo	Flowjo		flow cytometer analysis software
gentleMACS C Tubes	Miltenyi Biotec	130-096-334	automated dissociation tube
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters	Miltenyi Biotec	130-095-937	tissue dissociator instrument
GR1 (Ly6C/6G)	BioLegend	108422
IgD	BioLegend	405710
IgM	eBiosciences	25-5790-82
Kappa	BD	550003
Lambda	BioLegend	407308
paraformaldehyde, 32% Solution	Electron Microscopy Sciences	15714
Ter119	BioLegend	116220
True-Stain Monocyte Blocker	BioLegend	426103	monocyte blocker
UltraPure EDTA, pH 8.0	ThermoFisher	15575038	EDTA
Vi-CELL XR	Beckman Coulter	731050	cell counter instrument