Caracterización citométrica de flujo del desarrollo de células B murinas
Summary
Describimos aquí un análisis simple de la heterogeneidad del compartimento de células B inmunes murinas en el peritoneo, el bazo y los tejidos de la médula ósea por citometría de flujo. El protocolo se puede adaptar y extender a otros tejidos de ratón.
Abstract
Extensos estudios han caracterizado el desarrollo y la diferenciación de las células B murinas en los órganos linfoides secundarios. Los anticuerpos secretados por las células B han sido aislados y desarrollados en terapias bien establecidas. La validación del desarrollo de células B murinas, en el contexto de ratones propensos a la autoinmunidad, o en ratones con sistemas inmunes modificados, es un componente crucial del desarrollo o prueba de agentes terapéuticos en ratones y es un uso apropiado de la citometría de flujo. Se pueden utilizar parámetros citométricos de flujo de células B bien establecidos para evaluar el desarrollo de células B en el peritoneo murino, la médula ósea y el bazo, pero se deben seguir una serie de mejores prácticas. Además, el análisis citométrico de flujo de los compartimentos de células B también debe complementar las lecturas adicionales del desarrollo de células B. Los datos generados utilizando esta técnica pueden ampliar nuestra comprensión de los modelos de ratón propensos autoinmunes de tipo salvaje, así como de los ratones humanizados que se pueden usar para generar anticuerpos o moléculas similares a anticuerpos como terapéuticos.
Introduction
Los anticuerpos monoclonales se han convertido cada vez más en la terapia de elección para muchas enfermedades humanas a medida que se convierten en parte de la medicina convencional1,2. Hemos descrito previamente ratones genéticamente modificados que producen eficientemente anticuerpos que albergan regiones variables completamente humanas con constantes de IgH de ratón3,4. Más recientemente, hemos descrito ratones genéticamente modificados que producen moléculas similares a anticuerpos que tienen una unión a antígenos distinta5. Los anticuerpos son secretados por las células B y forman la base de la inmunidad humoral adaptativa. Hay dos tipos distintos de células B, B-1 y B-2. En los mamíferos, las células B-1 se originan en el hígado fetal y se enriquecen en los tejidos de la mucosa y las cavidades pleural y peritoneal después del nacimiento, mientras que las células B-2 se originan en el hígado fetal antes del nacimiento y posteriormente en la médula ósea (BM). Las células B-2 se enriquecen en órganos linfoides secundarios, incluyendo el bazo y la sangre6,7,8. En el BM, los progenitores hematopoyéticos B-2 comienzan a diferenciarse a células pro-B al iniciar el reordenamiento de la cadena pesada Ig mu9,10. El reordenamiento exitoso de la cadena pesada de Ig y su ensamblaje en el receptor de células pre-B (pre-BCR), junto con la señalización y la expansión proliferativa, conduce a la diferenciación a células pre-B. Después de que las células pre-B reorganizan sus cadenas ligeras Ig kappa (Igκ), o si son improductivas, Ig lambda (Igλ), se emparejan con μ cadena pesada, lo que resulta en la expresión superficial de IgM BCR. Es importante señalar que se sabe que la expresión superficial de IgM se reduce en condiciones de autorreactividad, contribuyendo así a la autotolerancia en células B funcionalmente insensibles o anérgicas11,12. Las células B inmaduras entran en una etapa de transición, donde comienzan a coexpresar IgD y migran de la BM al bazo. En el bazo, la expresión de IgD aumenta aún más y las células maduran en una segunda etapa de células B de transición, seguida de la finalización de su estado de maduración y el desarrollo en células de zona marginal (MZ) o foliculares (Fol)13,14,15. En ratones adultos, en un entorno no enfermo, el número de células B maduras permanece constante a pesar de que se generan diariamente 10-20 millones de células B inmaduras en el BM. De estos, solo el tres por ciento ingresa al grupo de células B maduras. El tamaño del compartimento periférico de las células B está limitado por la muerte celular, debido en parte a varios factores, incluida la autorreactividad y la maduración incompleta16,17,18. El análisis citométrico de flujo se ha utilizado ampliamente para caracterizar y enumerar muchos subcompartimentos de células inmunes en humanos y ratones. Si bien existen algunas similitudes entre los compartimentos de células B humanas y murinas, este protocolo se aplica solo al análisis de células B murinas. Este protocolo fue desarrollado con el propósito de fenotipar ratones genéticamente modificados, para determinar si la manipulación genética alteraría el desarrollo de las células B. La citometría de flujo también ha sido muy popular en muchas aplicaciones adicionales, incluida la medición de la activación celular, la función, la proliferación, el análisis del ciclo, el análisis del contenido de ADN, la apoptosis y la clasificación celular 19,20.
La citometría de flujo es la herramienta de elección para caracterizar varios compartimentos de linfocitos en ratones y humanos, incluso en órganos complejos como el bazo, la BM y la sangre. Debido a los reactivos de anticuerpos específicos de ratón ampliamente disponibles para la citometría de flujo, esta técnica se puede utilizar para investigar no solo las proteínas de la superficie celular, sino también las fosfoproteínas y citoquinas intracelulares, así como las lecturas funcionales21. Aquí demostramos cómo los reactivos de citometría de flujo se pueden usar para identificar subconjuntos de células B a medida que maduran y se diferencian en los órganos linfoides secundarios. Después de la optimización de las condiciones de tinción, el manejo de muestras, la configuración correcta del instrumento y la adquisición de datos, y finalmente el análisis de datos, se puede utilizar un protocolo para el análisis citométrico de flujo integral del compartimiento de células B en ratones. Este análisis exhaustivo se basa en una nomenclatura de décadas de antigüedad ideada por Hardy y sus colegas, donde las células BM B-2 en desarrollo se pueden dividir en diferentes fracciones (Fracción) dependiendo de su expresión de B220, CD43, BP-1, CD24, IgM e IgD22. Hardy et al., demostraron que las células B B B220+ CD43 BM se pueden subdividir en cuatro subconjuntos (Fracción A-C’) sobre la base de la expresión BP-1 y CD24 (30F1), mientras que las células B B BM B B CD43-(dim a neg) se pueden resolver en tres subconjuntos (Fracción D-F) basados en la expresión diferencial de IgD e IgM23 de superficie. La fracción A (células pre-pro-B) se definen como BP-1– CD24 (30F1)–, la fracción B (células pro-B tempranas) se definen como BP-1– CD24 (30F1)+, la fracción C (células pro-B tardías) se definen como BP-1+ CD24 (30F1)+, y la fracción C’ (células pre-B tempranas) se definen como BP-1+ y CD24high. Además, la Fracción D (células pre-B) se definen como células B220+ CD43– IgM-B, y la Fracción E (células B recién generadas, combinación de células B inmaduras y de transición) se definen como células B B220+ CD43– IgM+ y la Fracción F (células B maduras, recircultantes) se definen como células B B220high CD43– IgM+. Por el contrario, la mayoría de las células B naïve que se encuentran en el bazo se pueden dividir en células B maduras (B220 + CD93–) y células de transición (T1, T2, T3) dependiendo de la expresión de CD93, CD23 e IgM. Las células B maduras pueden resolverse en subconjuntos de zonas marginales y foliculares basados en la expresión de IgM y CD21/CD35, y los subconjuntos foliculares se pueden dividir en subconjuntos de células B foliculares maduras tipo I y folicular tipo II dependiendo del nivel de su expresión superficial de IgM e IgD24. Estas poblaciones de células B esplénicas expresan predominantemente cadena ligera Igκ. Finalmente, las poblaciones de células B-1 B, que se originan en el hígado fetal y se encuentran principalmente en las cavidades peritoneal y pleural de ratones adultos, se han descrito en la literatura. Estas células B peritoneales se pueden distinguir de las células B B-2 descritas anteriormente por su falta de expresión de CD23. Luego se subdividen en poblaciones B-1a o B-1b, con la primera definida por la presencia de CD5 y la segunda por su ausencia25. Los progenitores de células B-1 son abundantes en el hígado fetal, pero no se encuentran en la BM adulta. Mientras que las células B-1a y B-1b se originan a partir de diferentes progenitores, ambas siembran las cavidades peritoneal y pleural24. A diferencia de las células B-2, las células B-1 son excepcionalmente capaces de autorrenovarse y son responsables de la producción de anticuerpos IgM naturales.
Los defectos en el desarrollo de las células B pueden surgir en muchos casos, incluyendo deficiencias en los componentes de la BCR26,27, perturbaciones de moléculas de señalización que afectan la intensidad de señalización de BCR14,28,29, o interrupción de citoquinas que modulan la supervivencia de las células B30,31 . El análisis de citometría de flujo de los compartimentos linfoides ha contribuido a la caracterización de los bloques de desarrollo de células B en estos ratones y muchos otros. Una ventaja del análisis citométrico de flujo de compartimentos linfoides es que ofrece la capacidad de realizar mediciones en células individuales obtenidas de tejido vivo disociado. La disponibilidad de reactivos en una gama cada vez mayor de fluoróforos permite el análisis simultáneo de múltiples parámetros y permite la evaluación de la heterogeneidad de las células B. Además, la enumeración de células B por análisis citométrico de flujo complementa otros ensayos inmunológicos como los métodos de inmunohistoquímica que visualizan la localización celular dentro de los órganos linfoides, la detección de niveles de anticuerpos circulantes como medida de la inmunidad humoral, así como la microscopía de dos fotones para medir las respuestas de las células B en el espacio y el tiempo reales32.
Protocol
Representative Results
Discussion
El análisis citométrico de flujo de tejidos linfoides y no linfoides ha permitido la identificación y enumeración simultánea de subpoblaciones de células B en ratones y humanos desde la década de 1980. Se ha utilizado como una medida de la inmunidad humoral y se puede aplicar aún más para evaluar la funcionalidad de las células B. Este método aprovecha la disponibilidad de reactivos para evaluar diferentes etapas de maduración de células B en ratones y humanos, mediante el análisis simultáneo de múltiples…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Matthew Sleeman por la lectura crítica del manuscrito. También agradecemos a los departamentos de Operaciones de Vivarium y Núcleo de Citometría de Flujo en Regeneron por apoyar esta investigación.
Materials
| 0.5 mL safe-lock Eppendorf tubes | Eppendorf | 22363611 | 0.5 mL microcentrifuge tube |
| 1.5mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 22364111 | 1.5 mL microcentrifuge tube |
| 15 mL Falcon tubes | Corning | 352097 | 15 mL conical tube |
| 18 gauge needle | BD | 305196 | |
| 25 gauge needle | BD | 305124 | |
| 3 mL syringe | BD | 309657 | |
| 70 mM MACS SmartStrainer | Miltenyi Biotec | 130-110-916 | 70 mM cell strainer |
| 96 well U bottom plate | VWR | 10861-564 | |
| ACK lysis buffer | GIBCO | A1049201 | red blood cell lysis buffer |
| Acroprep Advance 96 Well Filter Plate | Pall Corporation | 8027 | filter plate |
| B220 | eBiosciences | 17-0452-82 | |
| BD CompBead Anti-Mouse Ig/κ | BD | 552843 | compensation beads |
| BD CompBead Anti-Rat Ig/κ | BD | 552844 | compensation beads |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A8577 | BSA |
| BP-1 | BD | 740882 | |
| Brilliant Stain Buffer | BD | 566349 | brilliant stain buffer |
| C-Kit | BD | 564011 | |
| CD11b | BD | 563168 | |
| CD11b | BioLegend | 101222 | |
| CD19 | BD | 560143 | |
| CD21/35 | BD | 562756 | |
| CD23 | BD | 740216 | |
| CD24 (HSA) | BioLegend | 138504 | |
| CD3 | BD | 561388 | |
| CD3 | BioLegend | 100214 | |
| CD43 | BD | 553270 | |
| CD43 | BioLegend | 121206 | |
| CD5 | BD | 563194 | |
| CD93 | BD | 740750 | |
| CD93 | BioLegend | 136504 | |
| DPBS (1x) | ThermoFisher | 14190-144 | DPBS |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 506 | ThermoFisher | 65-0866-14 | viability dye |
| Extended Fine Tip Transfer Pipette | Samco | 233 | disposable transfer pipette |
| FACSymphony A3 flow cytometer | BD | custom order | flow cytometer |
| Fc Block, CD16/CD32 (2.4G2) | BD | 553142 | Fc block |
| FlowJo | Flowjo | flow cytometer analysis software | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | automated dissociation tube |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-095-937 | tissue dissociator instrument |
| GR1 (Ly6C/6G) | BioLegend | 108422 | |
| IgD | BioLegend | 405710 | |
| IgM | eBiosciences | 25-5790-82 | |
| Kappa | BD | 550003 | |
| Lambda | BioLegend | 407308 | |
| paraformaldehyde, 32% Solution | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| Ter119 | BioLegend | 116220 | |
| True-Stain Monocyte Blocker | BioLegend | 426103 | monocyte blocker |
| UltraPure EDTA, pH 8.0 | ThermoFisher | 15575038 | EDTA |
| Vi-CELL XR | Beckman Coulter | 731050 | cell counter instrument |
Referências
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