Caractérisation cytométrique en flux du développement des lymphocytes B murins
Summary
Nous décrivons ici une analyse simple de l’hétérogénéité du compartiment des cellules B immunitaires murines dans le péritoine, la rate et les tissus de la moelle osseuse par cytométrie en flux. Le protocole peut être adapté et étendu à d’autres tissus de souris.
Abstract
Des études approfondies ont caractérisé le développement et la différenciation des cellules B murines dans les organes lymphoïdes secondaires. Les anticorps sécrétés par les lymphocytes B ont été isolés et développés en thérapies bien établies. La validation du développement des cellules B murines, dans le contexte de souris sujettes auto-immunes, ou chez des souris dont le système immunitaire est modifié, est un élément crucial du développement ou du test d’agents thérapeutiques chez la souris et constitue une utilisation appropriée de la cytométrie en flux. Des paramètres cytométriques en flux de cellules B bien établis peuvent être utilisés pour évaluer le développement des cellules B dans le péritoine murin, la moelle osseuse et la rate, mais un certain nombre de meilleures pratiques doivent être respectées. En outre, l’analyse cytométrique en flux des compartiments des cellules B devrait également compléter des lectures supplémentaires du développement des cellules B. Les données générées à l’aide de cette technique peuvent approfondir notre compréhension des modèles murins de type sauvage et sujets à tendance auto-immune ainsi que des souris humanisées qui peuvent être utilisées pour générer des anticorps ou des molécules semblables à des anticorps à titre thérapeutique.
Introduction
Les anticorps monoclonaux sont devenus de plus en plus la thérapie de choix pour de nombreuses maladies humaines à mesure qu’ils font partie de la médecine traditionnelle1,2. Nous avons déjà décrit des souris génétiquement modifiées qui produisent efficacement des anticorps hébergeant des régions variables entièrement humaines avec des constantes IgH de souris3,4. Plus récemment, nous avons décrit des souris génétiquement modifiées qui produisent des molécules semblables à des anticorps qui ont une liaison distincte à l’antigène5. Les anticorps sont sécrétés par les cellules B et forment la base de l’immunité humorale adaptative. Il existe deux types distincts de cellules B, B-1 et B-2. Chez les mammifères, les cellules B-1 proviennent du foie fœtal et sont enrichies dans les tissus muqueux et les cavités pleurales et péritonéales après la naissance, tandis que les cellules B-2 proviennent du foie fœtal avant la naissance et par la suite dans la moelle osseuse (BM). Les cellules B-2 sont enrichies dans les organes lymphoïdes secondaires, y compris la rate et le sang6,7,8. Dans le BM, les progéniteurs hématopoïétiques B-2 commencent à se différencier en cellules pro-B lors de l’initiation du réarrangement de la chaîne lourde Ig mu9,10. Le réarrangement réussi de la chaîne lourde Ig et son assemblage dans le récepteur des cellules pré-B (pré-BCR), ainsi que la signalisation et l’expansion proliférative, conduisent à la différenciation des cellules pré-B. Une fois que les cellules pré-B ont réarrangé leurs chaînes légères Ig kappa (Igκ) ou, si elles sont improductives, Ig lambda (Igλ), elles s’associent à μ chaîne lourde, ce qui entraîne une expression igM BCR de surface. Il est important de souligner que l’expression de surface des IgM est connue pour être réduite dans des conditions d’autoréactivité, contribuant ainsi à l’auto-tolérance dans les cellules B fonctionnellement insensibles ou anergiques11,12. Les lymphocytes B immatures entrent alors dans une phase de transition, où ils commencent à co-exprimer les IgD et à migrer du BM vers la rate. Dans la rate, l’expression des IgD augmente encore et les cellules mûrissent dans une deuxième étape de cellules B transitionnelles, suivie de l’achèvement de leur état de maturation et de leur développement en cellules de zone marginale (MZ) ou folliculaires (Fol)13,14,15. Chez les souris adultes, dans un environnement non malade, le nombre de cellules B matures reste constant malgré 10 à 20 millions de cellules B immatures générées quotidiennement dans le BM. Parmi ceux-ci, seulement trois pour cent entrent dans le pool de cellules B matures. La taille du compartiment périphérique des lymphocytes B est limitée par la mort cellulaire, due en partie à plusieurs facteurs, notamment l’autoréactivité et la maturation incomplète16,17,18. L’analyse cytométrique en flux a été largement utilisée pour caractériser et dénombrer de nombreux sous-compartiments de cellules immunitaires chez l’homme et la souris. Bien qu’il existe certaines similitudes entre les compartiments des cellules B humaines et murines, ce protocole ne s’applique qu’à l’analyse des cellules B murines. Ce protocole a été développé dans le but de phénotyper des souris génétiquement modifiées, afin de déterminer si la manipulation génétique modifierait le développement des cellules B. La cytométrie en flux a également été extrêmement populaire dans de nombreuses autres applications, notamment dans la mesure de l’activation cellulaire, de la fonction, de la prolifération, de l’analyse du cycle, de l’analyse du contenu de l’ADN, de l’apoptose et du tri cellulaire 19,20.
La cytométrie en flux est l’outil de choix pour caractériser divers compartiments lymphocytaires chez la souris et l’homme, y compris dans des organes complexes tels que la rate, le BM et le sang. En raison des réactifs d’anticorps spécifiques à la souris largement disponibles pour la cytométrie en flux, cette technique peut être utilisée pour étudier non seulement les protéines de surface cellulaire, mais aussi les phosphoprotéines intracellulaires et les cytokines, ainsi que les lectures fonctionnelles21. Nous démontrons ici comment les réactifs de cytométrie en flux peuvent être utilisés pour identifier les sous-ensembles de cellules B à mesure qu’ils mûrissent et se différencient dans les organes lymphoïdes secondaires. Après l’optimisation des conditions de coloration, la manipulation des échantillons, la configuration correcte de l’instrument et l’acquisition des données, et enfin l’analyse des données, un protocole d’analyse cytométrique en flux complète du compartiment des cellules B chez la souris peut être utilisé. Une telle analyse complète est basée sur une nomenclature vieille de plusieurs décennies conçue par Hardy et ses collègues, où le développement de cellules BM B-2 peut être divisé en différentes fractions (Fraction) en fonction de leur expression de B220, CD43, BP-1, CD24, IgM et IgD22. Hardy et al., ont montré que les cellules B B CD220+ CD43 peuvent être subdivisées en quatre sous-ensembles (Fraction A-C’) sur la base de l’expression BP-1 et CD24 (30F1), tandis que les cellules B BM B 220+ (dim to neg) peuvent être résolues en trois sous-ensembles (Fraction D-F) basés sur l’expression différentielle des IgD et des IgM23 de surface. La fraction A (cellules pré-pro-B) est définie comme BP-1-CD24 (30F1)–, la fraction B (cellules pro-B précoces) est définie comme BP-1-CD24 (30F1)+, la fraction C (cellules pro-B tardives) est définie comme BP-1+ CD24 (30F1)+, et la fraction C'(cellules pré-B précoces) est définie comme BP-1+ et CD24high. En outre, la fraction D (cellules pré-B) est définie comme des cellules B220+ CD43-IgM-B, et la fraction E (cellules B nouvellement générées, combinaison de cellules immatures et transitionnelles) est définie comme des cellules B B B220+ CD43– IgM+ et la fraction F (cellules B matures et recirculantes) est définie comme des cellules B B B220high CD43– IgM+. En revanche, la majorité des lymphocytes B naïfs présents dans la rate peuvent être divisés en cellules B matures (B220+ CD93–) et cellules transitionnelles (T1, T2, T3) en fonction de l’expression de CD93, CD23 et IgM. Les cellules B matures peuvent être résolues en sous-ensembles marginaux et folliculaires basés sur l’expression des IgM et des CD21/CD35, et les sous-ensembles folliculaires peuvent être divisés en sous-ensembles folliculaires matures de type I et folliculaires de type II B en fonction du niveau de leur expression de surface IgM et IgD24. Ces populations de lymphocytes B spléniques expriment principalement la chaîne légère Igκ. Enfin, les populations de cellules B-1 B, qui proviennent du foie fœtal et se trouvent principalement dans les cavités péritonéales et pleurales de souris adultes, ont été décrites dans la littérature. Ces lymphocytes B péritonéaux peuvent être distingués des lymphocytes B-2 décrits précédemment par leur manque d’expression de CD23. Ils sont ensuite subdivisés en populations B-1a ou B-1b, la première étant définie par la présence de CD5 et la seconde par son absence25. Les progéniteurs des cellules B-1 sont abondants dans le foie fœtal, mais ne se trouvent pas chez le BM adulte. Bien que les cellules B-1a et B-1b proviennent de différents progéniteurs, elles ensemencent toutes deux les cavités péritonéale et pleurale24. Contrairement aux cellules B-2, les cellules B-1 sont uniquement capables de s’auto-renouveler et sont responsables de la production d’anticorps IgM naturels.
Des défauts dans le développement des lymphocytes B peuvent survenir dans de nombreux cas, y compris des déficiences dans les composants du BCR26,27, des perturbations des molécules de signalisation qui ont un impact sur la force de signalisation BCR14,28,29, ou une perturbation des cytokines qui modulent la survie des lymphocytes B30,31 . L’analyse par cytométrie en flux des compartiments lymphoïdes a contribué à la caractérisation des blocs de développement des cellules B chez ces souris et bien d’autres. L’un des avantages de l’analyse cytométrique en flux des compartiments lymphoïdes est qu’elle offre la possibilité d’effectuer des mesures sur des cellules individuelles obtenues à partir de tissus dissociés vivants. La disponibilité de réactifs dans une gamme sans cesse croissante de fluorophores permet l’analyse simultanée de plusieurs paramètres et permet d’évaluer l’hétérogénéité des cellules B. En outre, le dénombrement des cellules B par analyse cytométrique en flux complète d’autres tests immunologiques tels que les méthodes d’immunohistochimie qui visualisent la localisation cellulaire dans les organes lymphoïdes, la détection des niveaux d’anticorps circulants comme mesure de l’immunité humorale, ainsi que la microscopie à deux photons pour mesurer les réponses des cellules B dans l’espace et le temps réels32.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’analyse cytométrique en flux des tissus lymphoïdes et non lymphoïdes a permis l’identification et le dénombrement simultanés des sous-populations de cellules B chez la souris et l’homme depuis les années 1980. Il a été utilisé comme mesure de l’immunité humorale et peut être appliqué davantage pour évaluer la fonctionnalité des cellules B. Cette méthode tire parti de la disponibilité des réactifs pour évaluer les différentes étapes de la maturation des lymphocytes B chez la souris et l’hom…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Matthew Sleeman pour la lecture critique du manuscrit. Nous remercions également les départements Vivarium Operations et Flow Cytometry Core de Regeneron pour leur soutien à cette recherche.
Materials
| 0.5 mL safe-lock Eppendorf tubes | Eppendorf | 22363611 | 0.5 mL microcentrifuge tube |
| 1.5mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 22364111 | 1.5 mL microcentrifuge tube |
| 15 mL Falcon tubes | Corning | 352097 | 15 mL conical tube |
| 18 gauge needle | BD | 305196 | |
| 25 gauge needle | BD | 305124 | |
| 3 mL syringe | BD | 309657 | |
| 70 mM MACS SmartStrainer | Miltenyi Biotec | 130-110-916 | 70 mM cell strainer |
| 96 well U bottom plate | VWR | 10861-564 | |
| ACK lysis buffer | GIBCO | A1049201 | red blood cell lysis buffer |
| Acroprep Advance 96 Well Filter Plate | Pall Corporation | 8027 | filter plate |
| B220 | eBiosciences | 17-0452-82 | |
| BD CompBead Anti-Mouse Ig/κ | BD | 552843 | compensation beads |
| BD CompBead Anti-Rat Ig/κ | BD | 552844 | compensation beads |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A8577 | BSA |
| BP-1 | BD | 740882 | |
| Brilliant Stain Buffer | BD | 566349 | brilliant stain buffer |
| C-Kit | BD | 564011 | |
| CD11b | BD | 563168 | |
| CD11b | BioLegend | 101222 | |
| CD19 | BD | 560143 | |
| CD21/35 | BD | 562756 | |
| CD23 | BD | 740216 | |
| CD24 (HSA) | BioLegend | 138504 | |
| CD3 | BD | 561388 | |
| CD3 | BioLegend | 100214 | |
| CD43 | BD | 553270 | |
| CD43 | BioLegend | 121206 | |
| CD5 | BD | 563194 | |
| CD93 | BD | 740750 | |
| CD93 | BioLegend | 136504 | |
| DPBS (1x) | ThermoFisher | 14190-144 | DPBS |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 506 | ThermoFisher | 65-0866-14 | viability dye |
| Extended Fine Tip Transfer Pipette | Samco | 233 | disposable transfer pipette |
| FACSymphony A3 flow cytometer | BD | custom order | flow cytometer |
| Fc Block, CD16/CD32 (2.4G2) | BD | 553142 | Fc block |
| FlowJo | Flowjo | flow cytometer analysis software | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | automated dissociation tube |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-095-937 | tissue dissociator instrument |
| GR1 (Ly6C/6G) | BioLegend | 108422 | |
| IgD | BioLegend | 405710 | |
| IgM | eBiosciences | 25-5790-82 | |
| Kappa | BD | 550003 | |
| Lambda | BioLegend | 407308 | |
| paraformaldehyde, 32% Solution | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| Ter119 | BioLegend | 116220 | |
| True-Stain Monocyte Blocker | BioLegend | 426103 | monocyte blocker |
| UltraPure EDTA, pH 8.0 | ThermoFisher | 15575038 | EDTA |
| Vi-CELL XR | Beckman Coulter | 731050 | cell counter instrument |
Referências
- Shepard, H. M., Philips, G. L., Thanos, D., Feldman, M. Developments in therapy with monoclonal antibodies and related proteins. Clinical Medicine. 17 (3), 220 (2017).
- Ecker, D. M., Jones, S. D., Levine, H. L. The therapeutic monoclonal antibody market. MAbs. 7 (1), 9-14 (2015).
- Macdonald, L. E., et al. Precise and in situ genetic humanization of 6 Mb of mouse immunoglobulin genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (14), 5147-5152 (2014).
- Murphy, A. J., et al. Mice with megabase humanization of their immunoglobulin genes generate antibodies as efficiently as normal mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (14), 5153-5158 (2014).
- Macdonald, L. E., et al. Kappa-on-Heavy (KoH) bodies are a distinct class of fully-human antibody-like therapeutic agents with antigen-binding properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (1), 292-299 (2020).
- Pieper, K., Grimbacher, B., Eibel, H. B-cell biology and development. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 131 (4), 959-971 (2013).
- Nagasawa, T. Microenvironmental niches in the bone marrow required for B-cell development. Nature Reviews: Immunology. 6 (2), 107-116 (2006).
- Lund, F. E. Cytokine-producing B lymphocytes-key regulators of immunity. Current Opinion in Immunology. 20 (3), 332-338 (2008).
- Martensson, I. L., Keenan, R. A., Licence, S. The pre-B-cell receptor. Current Opinion in Immunology. 19 (2), 137-142 (2007).
- von Boehmer, H., Melchers, F. Checkpoints in lymphocyte development and autoimmune disease. Nature Immunology. 11 (1), 14-20 (2010).
- Goodnow, C. C., et al. Altered immunoglobulin expression and functional silencing of self-reactive B lymphocytes in transgenic mice. Nature. 334 (6184), 676-682 (1988).
- Zikherman, J., Parameswaran, R., Weiss, A. Endogenous antigen tunes the responsiveness of naive B cells but not T cells. Nature. 489 (7414), 160-164 (2012).
- Melchers, F. Checkpoints that control B cell development. Journal of Clinical Investigation. 125 (6), 2203-2210 (2015).
- Henderson, R. B., et al. A novel Rac-dependent checkpoint in B cell development controls entry into the splenic white pulp and cell survival. Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 837-853 (2010).
- Pillai, S., Cariappa, A. The follicular versus marginal zone B lymphocyte cell fate decision. Nature Reviews: Immunology. 9 (11), 767-777 (2009).
- Shahaf, G., Zisman-Rozen, S., Benhamou, D., Melamed, D., Mehr, R. B. Cell Development in the Bone Marrow Is Regulated by Homeostatic Feedback Exerted by Mature B Cells. Frontiers in Immunology. 7, 77 (2016).
- Nemazee, D. Mechanisms of central tolerance for B cells. Nature Reviews: Immunology. 17 (5), 281-294 (2017).
- Petkau, G., Turner, M. Signalling circuits that direct early B-cell development. Biochemical Journal. 476 (5), 769-778 (2019).
- McKinnon, K. M. Flow Cytometry: An Overview. Current Protocols in Immunology. 120, 1-5 (2018).
- Betters, D. M. Use of Flow Cytometry in Clinical Practice. Journal of the Advanced Practioner in Oncology. 6 (5), 435-440 (2015).
- Maecker, H. T., McCoy, J. P., Nussenblatt, R. Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project. Nature Reviews: Immunology. 12 (3), 191-200 (2012).
- Van Epps, H. L. Bringing order to early B cell chaos. Journal of Experimental Medicine. 203 (6), 1389 (2006).
- Hardy, R. R., Carmack, C. E., Shinton, S. A., Kemp, J. D., Hayakawa, K. Resolution and characterization of pro-B and pre-pro-B cell stages in normal mouse bone marrow. Journal of Experimental Medicine. 173 (5), 1213-1225 (1991).
- Allman, D., Pillai, S. Peripheral B cell subsets. Current Opinion in Immunology. 20 (2), 149-157 (2008).
- Shapiro-Shelef, M., Calame, K. Regulation of plasma-cell development. Nature Reviews: Immunology. 5 (3), 230-242 (2005).
- Kitamura, D., Roes, J., Kuhn, R., Rajewsky, K. A B cell-deficient mouse by targeted disruption of the membrane exon of the immunoglobulin mu chain gene. Nature. 350 (6317), 423-426 (1991).
- Keenan, R. A., et al. Censoring of autoreactive B cell development by the pre-B cell receptor. Science. 321 (5889), 696-699 (2008).
- Chan, V. W., Meng, F., Soriano, P., DeFranco, A. L., Lowell, C. A. Characterization of the B lymphocyte populations in Lyn-deficient mice and the role of Lyn in signal initiation and down-regulation. Immunity. 7 (1), 69-81 (1997).
- Zikherman, J., Doan, K., Parameswaran, R., Raschke, W., Weiss, A. Quantitative differences in CD45 expression unmask functions for CD45 in B-cell development, tolerance, and survival. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (1), 3-12 (2012).
- Miyamoto, A., et al. Increased proliferation of B cells and auto-immunity in mice lacking protein kinase Cdelta. Nature. 416 (6883), 865-869 (2002).
- Mecklenbrauker, I., Kalled, S. L., Leitges, M., Mackay, F., Tarakhovsky, A. Regulation of B-cell survival by BAFF-dependent PKCdelta-mediated nuclear signalling. Nature. 431 (7007), 456-461 (2004).
- Okada, T., et al. Antigen-engaged B cells undergo chemotaxis toward the T zone and form motile conjugates with helper T cells. PLoS Biology. 3 (6), 150 (2005).
- Robinson, J. P. Flow Cytometry. Encyclopedia of Biomaterials and Biomedical Engineering. , 630-640 (2004).
- Lugli, E., Roederer, M., Cossarizza, A. Data analysis in flow cytometry: the future just started. Cytometry A. 77 (7), 705-713 (2010).
- Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies. European Journal of Immunology. 47 (10), 1584 (2017).
- Bigos, M. Separation index: an easy-to-use metric for evaluation of different configurations on the same flow cytometer. Current Protocols in Cytometry. , 21 (2007).
- Pillai, S., Mattoo, H., Cariappa, A. B. B cells and autoimmunity. Current Opinion in Immunology. 23 (6), 721-731 (2011).
