Análise e Especificação das Distribuições de Tamanho do Granulo de Amido

Summary

Apresentado aqui é um procedimento para determinações reprodutíveis e estatisticamente válidas de distribuições de tamanho de grânulo de amido, e para especificar as distribuições de tamanhonormal de enrasculado determinados do granulo usando uma forma multiplicativa de dois parâmetros. É aplicável a todas as análises de dimensionamento de grânulos de amostras de amido em escala grama para pesquisa em ciência vegetal e alimentar.

Abstract

Amido de todas as fontes de plantas são compostos de grânulos em uma variedade de tamanhos e formas com diferentes frequências de ocorrência, ou seja, exibindo um tamanho e uma distribuição deforma. Os dados de tamanho do grânulo de amido determinados usando vários tipos de técnicas de dimensionamento de partículas são muitas vezes problemáticos devido à baixa reprodutibilidade ou falta de significância estatística resultante de alguns erros sistemáticos intransponíveis, incluindo sensibilidade às formas de grânulo e limites de tamanhos amostrais de grânulo. Delineamos um procedimento para determinações reprodutíveis e estatisticamente válidas das distribuições de tamanho do grânulo de amido usando a técnica da zona de sensoriamento elétrico, e para especificar as distribuições determinadas de tamanho de lognormal do grânulo usando uma forma multiplicativa de dois parâmetros adotada com melhor precisão e comparabilidade. É aplicável a todas as análises de dimensionamento de grânulos de amostras de amido em escala grama e, portanto, poderia facilitar estudos sobre como os tamanhos do grânulo de amido são moldados pelo aparelho e mecanismos de biosíntese de amido; e como eles impactam propriedades e funcionalidades de amidos para alimentos e usos industriais. Os resultados representativos são apresentados a partir de análises de réplica das distribuições de tamanho de granuloso de amostras de amido de doce de pote de milho utilizando o procedimento descrito. Discutimos ainda vários aspectos técnicos fundamentais do procedimento, especialmente, a especificação multiplicativa das distribuições de tamanhonormal do granulo lognormal e alguns meios técnicos para superar o bloqueio frequente de abertura por agregados de grânulos.

Introduction

Os grânulos de amido são a estrutura física na qual dois polímeros homoglucanos de reserva principal em fotossíntese vegetal e tecidos de armazenamento, a amilolose linear ou pouco ramificada e a amilódeina altamente ramificada, são embaladas ordenadamente junto com alguns componentes menores, incluindo lipídios e proteínas. Grânulos de amido de várias espécies vegetais exibem muitas formas tridimensionais (3D) (revisadas em ref.^1,2), incluindo esferas, elipsoides, poliedros, plaquetas, cubos, cuboides e tubulos irregulares. Mesmo aqueles do mesmo tecido ou tecidos diferentes da mesma espécie vegetal poderiam ter um conjunto de formas com frequências de ocorrência variadas. Em outras palavras, grânulos de amido de uma espécie de planta podem ter uma distribuição estatística característica, em vez de uma forma específica. As formas de grânulo não uniforme e não esférica dificultam a medição adequada e a definição dos tamanhos do grânulo do amido. Além disso, os grânulos de amido dos mesmos tecidos de uma espécie vegetal são de uma gama de tamanhos com diferentes proporções, ou seja, exibindo uma distribuição de tamanho característica. Essa distribuição de tamanho complica ainda mais a análise e descrição dos tamanhos do grânulo de amido.

Os tamanhos do grânulo de amido foram analisados utilizando várias categorias de técnicas de dimensionamento de partículas (revisadas no ref.³), incluindo microscopia, sedimentação/fracionamento de fluxo de campo esterico (Sd/StFFF), difração a laser e zona de sensoriamento elétrico (ESZ). No entanto, essas técnicas não são igualmente adequadas para a determinação de tamanhos de grânulos de amido na presença de uma forma de grânulo e uma distribuição de tamanho. A microscopia, incluindo microscopia eletrônica leve, confocal e de varredura, é excelente para os estudos de morfologia^4,5,6,7, estrutura^8,9 e desenvolvimento^10,11 de grânulos de amido, mas dificilmente adequado para definir suas distribuições de tamanho devido a algumas deficiências inerentes. Medições diretas de imagens de grânulos microscópicos ou análise de imagem assistida por software de dados de microscopia óptica (IAOM), que têm sido usados para a determinação de tamanhos de grânulos de amidos de várias espécies, incluindo milho¹², trigo^13,14, batata¹⁵ e cevada¹⁶, pode medir apenas tamanhos 1D (geralmente comprimento máximo) ou 2D (área de superfície) de números muito limitados (dezenas a alguns milhares) de imagens de grânulo de amido. Os pequenos tamanhos de amostragem de grânulos inerentemente constrangidos pelas técnicas raramente poderiam ser estatisticamente representativos, considerando os enormes números de granulo por unidade de peso de amido (~120 x 10⁶ por grama, assumindo todas as esferas de 10 μm em densidade de 1,5 g/cm³), e, portanto, poderia levar à baixa reprodutibilidade dos resultados. A técnica Sd/StFFF pode ter alta velocidade e resolução, e frações de tamanho estreito de grânulos de amido^17,mas raramente tem sido usada provavelmente porque sua precisão pode ser severamente afetada por danos, diferentes formas e densidade de grânulos de amido. A técnica de difração a laser é a mais utilizada, e tem sido aplicada para análises de tamanho de granulo de amido para todas as principais espécies de cultura^3,14,16. Embora a técnica tenha muitas vantagens, na verdade não é adequada para determinações de tamanhos de grânulo de amido na presença de uma distribuição de forma de grânulo. A maioria dos instrumentos simultâneos de difração a laser dependem da teoria de dispersão de luz^{Mie 18} para partículas esféricas uniformes e a teoria mie^{modificada 18} para algumas outras formas de uniformidade. A técnica é, portanto, inerentemente muito sensível às formas de partículas, e não é inteiramente adequada mesmo para certas formas de uniformidade¹⁹, muito menos para grânulos de amido com um conjunto de formas de proporções variadas. A técnica ESZ mede a perturbação do campo elétrico proporcional ao volume da partícula que passa por uma abertura. Fornece tamanhos de volume de granulo, bem como as informações de distribuição de números e volumes, etc., em altas resoluções. Uma vez que a técnica ESZ é independente de quaisquer propriedades ópticas de partículas, incluindo cor, forma, composição ou índice refrativo, e os resultados são muito reprodutíveis, é particularmente adequado para determinar distribuições de tamanho de grânulos de amido com um conjunto de formas.

Os tamanhos do grânulo de amido também foram definidos usando muitos parâmetros. Muitas vezes foram descritos simplistamente por diâmetros médios, que em alguns casos foram os meios aritméticos dos comprimentos máximos microscopicamente medidos de imagens 2D^12,20ou médias de diâmetros equivalentes da esfera³. Em outros casos, as distribuições de tamanho do grânulo foram especificadas utilizando-se faixas de tamanho^21,22, o volume médio de distribuição ou diâmetro médio (equivalente de esfera, ponderado por número, volume ou área de superfície) assumindo uma distribuição normal^{14,23,24,25,26}. Estes descritores de tamanhos de grânulo de amido de várias análises são de natureza muito diferente, e não estritamente comparáveis. Poderia ser muito enganoso se esses “tamanhos” de grânulos de amido de diferentes espécies ou mesmo os mesmos tecidos da mesma espécie fossem diretamente comparados. Além disso, o parâmetro de propagação (ou forma) das distribuições normais presumidas, ou seja, o desvio padrão σ (ou desvio padrão gráfico σ_g) medindo a largura da distribuição (ou seja, a disseminação dos tamanhos), tem sido ignorado na maioria dos estudos.

Para resolver os problemas críticos acima mencionados frente às análises de dimensionamento do grânulo de amido, delineamos um procedimento para determinações reprodutíveis e estatisticamente válidas das distribuições de tamanho de grânulo de amostras de amido usando a técnica ESZ, e para especificar adequadamente as distribuições de tamanho periculoso de granulo determinado usando uma forma multiplicativa de dois parametrados^{adotadas 27} com melhor precisão e comparabilidade. Para validação e demonstração, realizamos análises de dimensionamento de grânulos de réplica de amostras de amido de doce de pote usando o procedimento, e especificamos as distribuições de volume-volume-diâmetro de volume-quantidade equivalente de volume-equivalente de volume-equivalente lognormal usando seus meios geométricos gráficos e desvios padrão multiplicativos s* em uma forma ^x/ (multiplique e divida) s*

Protocol

1. Preparação de amostras de amido Prepare duas (ou três) amostras de amido de réplica em escala de grama de tecidos acumulados de amido de várias espécies vegetais seguindo os procedimentos estabelecidos (por exemplo, batatas15, potes de doce28,grãos de trigo13,29e grãos de milho30,etc.). Lave completamente amostras de amido com acetona ou tolueno 3-4x para minimi…

Representative Results

Para validar o procedimento e demonstrar a reprodutibilidade da distribuição determinada do tamanho do grânulo, foram realizadas análises de dimensionamento de amostras de amido de doces. Preparamos amostras de amido replicante (S1 e S2) de potes doces cultivados em campo de uma linha de reprodução SC1149-19 em idade de desenvolvimento semelhante usando um procedimento descrito anteriormente28. De cada extrato de amido, duas alíquotas de 0,5 g (a e b) foram amostradas, suspensas em 5 mL de …

Discussion

O procedimento delineado resolveu algumas questões críticas em vários métodos existentes para análises de tamanho de grânulo de amido, incluindo dimensionamento 1D ou 2D inadequado de grânulos 3D, distorção das medidas de dimensionamento devido a formas de grânulo não uniforme, baixa reprodutibilidade e validade estatística duvidosa devido a tamanhos limitados de amostra de granulo, especificações imprecisas ou inadequadas (especialmente o uso do tamanho médio) de tamanhos de grânulo na presença de forma…

Materials

Analytical beaker	Beckman Coulter Life Sciences	A35595	Smart-Technology (ST) beaker
Aperture tube, 100 µm	Beckman Coulter Life Sciences	A36394	For the MS4E, , 1000 µm
Disposable transfer pipettor,	Fisher Scientific (Fishersci.com)	13-711-9AM	Other disposable transfer pipettors with similar orifice can also be used.
Fisherbrand Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 50 ml	Fisher Scientific (Fishersci.com)	05-539-13	Any other similar types of tubes can be used.
Glass beakers, 150 to 250 ml	Fisher Scientific (Fishersci.com)	02-540K	These beakers are used to contain methanol for washing the aperture tube and stirer between runs.
LiCl	Fisher Chemical	L121-100
Methanol	Fisher Chemical	A412-500	Buy in bulk as the analysis uses a large quantity of methanol.
Mettler Toledo ML-T Precision Balances	Mettler Toledo	30243412	Any other precision balance with a readablity 0.01 g to 1 mg will work.
Multisizer 4e Coulter Counter	Beckman Coulter Life Sciences	B23005	The old model, Multisizer 3 can also be used with slight adjustment of parameters. The 4e model comes with a 100 μm aperture tube. Other aperture tubes of different diameter can be purchased separately from the company.
Ultrasonic processor UP50H	Hielscher Ultrasound Technology	UP50H	Other laborator sonicator having a low-power (<50 Watt) output can be also used. Both MS1 and MS2 sonotrodes for the particular sonicator can be used to disperse starch granules in 5 ml methanol. Always use the lowest setting first, 20% amplitude and 0.1 or 0.2 cycle, and raise the setting if aggregates persist in suspension.