Imagerie au calcium In vivo réussie avec un microscope miniaturisé head-mount dans l’Amygdale de la souris qui se comporte librement
Summary
L’imagerie microendoscopique in vivo de calcium est un outil inestimable qui permet la surveillance en temps réel des activités neuronales chez les animaux qui se comportent librement. Cependant, l’application de cette technique à l’amygdale a été difficile. Ce protocole vise à fournir une ligne directrice utile pour cibler avec succès les cellules d’amygdale avec un microscope miniaturisé chez la souris.
Abstract
La surveillance en temps réel in vivo des activités neuronales chez les animaux en mouvement libre est l’une des approches clés pour relier l’activité neuronale au comportement. À cette fin, une technique d’imagerie in vivo qui détecte les transitoires de calcium dans les neurones à l’aide d’indicateurs de calcium génétiquement codés (GECI), d’un microscope à fluorescence miniaturisé et d’une lentille de l’indice réfractif de gradient (GRIN) a été développée et appliquée avec succès à de nombreuses structurescérébrales 1,2,3,4,5,6. Cette technique d’imagerie est particulièrement puissante parce qu’elle permet l’imagerie simultanée chronique des populations cellulaires génétiquement définies pendant une période à long terme jusqu’à plusieurs semaines. Bien qu’utile, cette technique d’imagerie n’a pas été facilement appliquée aux structures cérébrales qui se situent profondément dans le cerveau comme l’amygdale, une structure cérébrale essentielle pour le traitement émotionnel et la mémoire de peur associative7. Il existe plusieurs facteurs qui rendent difficile l’application de la technique d’imagerie à l’amygdale. Par exemple, les artefacts de mouvement se produisent habituellement plus fréquemment pendant l’imagerie menée dans les régions cérébrales plus profondes parce qu’un microscope de tête-montage implanté profondément dans le cerveau est relativement instable. Un autre problème est que le ventricule latéral est positionné près de la lentille GRIN implantée et son mouvement pendant la respiration peut causer des artefacts de mouvement très irréguliers qui ne peuvent pas être facilement corrigés, ce qui rend difficile de former une vue d’imagerie stable. En outre, parce que les cellules dans l’amygdale sont habituellement calmes à un état de repos ou anesthésié, il est difficile de trouver et de concentrer les cellules cibles exprimant GECI dans l’amygdale pendant la procédure de baseplating pour la formation image ultérieure. Ce protocole fournit une ligne directrice utile pour la façon de cibler efficacement les cellules exprimant GECI dans l’amygdale avec le microscope miniaturisé tête-montage pour la formation image in vivo réussie de calcium dans une telle région plus profonde de cerveau. Il est à noter que ce protocole est basé sur un système particulier (par exemple, Inscopix) mais ne s’y limite pas.
Introduction
Le calcium est un deuxième messager omniprésent, jouant un rôle crucial dans presque toutes les fonctions cellulaires8. Dans les neurones, le tir potentiel d’action et l’entrée synaptique provoquent un changement rapide de libre intracellulaire [Ca2+]9,10. Par conséquent, le suivi des transitoires de calcium fournit une occasion de surveiller l’activité neuronale. Les GECI sont des outils puissants qui permettent de surveiller [Ca2+] dans les populations cellulaires définies et les compartiments intracellulaires11,12. Parmi de nombreux types différents d’indicateur de calcium à base de protéines, GCaMP, une sonde Ca2+ basée sur une seule molécule GFP13, est la plus optimisée et donc largement utilisée GECI. Grâce à plusieurs cycles d’ingénierie, un certain nombre de variantes de GCaMP a étédéveloppé 12,14,15,16. Nous utilisons l’un des GCaMPs récemment développés, GCaMP7b, dans ce protocole16. Les capteurs GCaMP ont grandement contribué à l’étude des fonctions du circuit neuronal dans un certain nombre d’organismes modèles tels que l’imagerie des transitoires Ca2+ au cours dudéveloppement 17,l’imagerie in vivo dans une couche corticalespécifique 18,la mesure de la dynamique du circuit dans l’apprentissage destâches motrices 19 et l’imagerie de l’activité de l’ensemble cellulaire liée à la mémoire de peur associative dans l’hippocampe et l’amygdale20,21.
L’imagerie optique des GECI présente plusieurs avantages22. L’encodage génétique permet d’exprimer de façon durable les IGE pendant une longue période dans un sous-ensemble spécifique de cellules définies par le profil génétique ou des modèles spécifiques de connectivité anatomique. L’imagerie optique permet une surveillance simultanée chronique in vivo de centaines à des milliers de neurones chez les animaux vivants. Quelques systèmes optiques d’imagerie ont été développés pour l’imagerie in vivo et l’analyse des GECI dans le cerveau des souris se comportant librement avec des microscopes miniaturisés de fluorescence detête-montage 21,23,24,25. En dépit de la technique d’imagerie optique in vivo basée sur les GECI, lentille GRIN, et un microscope miniature tête-montage étant un outil puissant pour étudier le lien entre l’activité et le comportement du circuit neuronal, l’application de cette technologie à l’amygdale a été difficile en raison de plusieurs problèmes techniques liés au ciblage de la lentille GRIN aux cellules exprimant gecis dans l’amygdale sans causer d’artefacts de mouvement qui réduisent gravement la qualité de l’acquisition d’images et de trouver des cellules exprimant GECI. Ce protocole vise à fournir une ligne directrice utile pour les procédures chirurgicales de fixation de plaque de base et l’implantation de lentilles GRIN qui sont des étapes critiques pour la formation image optique réussie du calcium in vivo dans l’amygdale. Bien que ce protocole cible l’amygdale, la plupart des procédures décrites ici sont généralement applicables à d’autres régions cérébrales plus profondes. Bien que ce protocole soit basé sur un système particulier (par exemple, Inscopix), le même objectif peut être facilement atteint avec d’autres systèmes alternatifs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Techniques de chirurgie habiles sont essentiels pour atteindre le succès in vivo imagerie optique de calcium avec microscopie miniature tête-montage dans les régions cérébrales plus profondes telles que l’amygdale comme nous l’avons décrit ici. Par conséquent, bien que ce protocole fournit une ligne directrice pour optimiser les processus chirurgicaux de fixation de la plaque de base et l’implantation de lentilles GRIN, des processus d’optimisation supplémentaires pourraient être nécessaires pour les é…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été soutenus par des subventions de la Samsung Science and Technology Foundation (Project Number SSTF-BA1801-10).
Materials
| 26G needle | BD | 302002 | Surgery |
| AAV1-Syn-GCaMP7b-WPRE | Addgene | 104493-AAV1 | Surgery |
| AAV2/1-CaMKiiα-GFP | custom made | Surgery | |
| Acrylic-Dental cement (Ortho-jet Acrylic Pink) | Lang | 1334-pink | Surgery & Baseplate Attachment |
| Air flow manipulator | Neurotar | NTR000253-04 | Baseplate Attachment |
| Amoxicillin | SIGMA | A8523-5G | Surgery |
| Baseplate | INSCOPIX | 1050-002192 | Baseplate Attachment |
| Baseplate cover | INSCOPIX | 1050-002193 | Baseplate Attachment |
| Behavioral apparatus (chamber) | Coulbourn Instrument | Testcage | Behavior test |
| Behavioral apparatus (software) | Coulbourn Instrument | Freeze Frame | Behavior test |
| Carbon cage | Neurotar | 180mm x 70mm | Baseplate Attachment |
| Carprofen | SIGMA | PHR1452-1G | Surgery |
| Data processing software | INSCOPIX | INSCOPIX Data Processing Software | Baseplate Attachment & Behavior test |
| Dexamethasone | SIGMA | D1756-500MG | Surgery |
| Drill | Seyang | marathon-4 | Surgery |
| Drill bur | ELA | US1/2, Shank104 | Surgery |
| Glass needle | WPI | PG10165-4 | Surgery |
| GRIN lens (INSCOPIX Proview Lens Probe) | INSCOPIX | 1050-002208 | Surgery |
| Hamilton Syringe | Hamilton | 84875 | Surgery |
| Head plate | Neurotar | Model 5 | Surgery |
| Hex-key | INSCOPIX | 1050-004195 | Baseplate Attachment |
| Laptop computer | Samsung | NT950XBV | Surgery & Baseplate Attachment |
| Lens holder, Stereotaxic rod (INSCOPIX proview implant kit) | INSCOPIX | 1050-004223 | Surgery |
| Microscope gripper | INSCOPIX | 1050-002199 | Baseplate Attachment |
| Microscope, DAQ software, hardware | INSCOPIX | nVista 3.0 | Baseplate Attachment & Behavior test |
| Mobile homecage | Neurotar | MHC V5 | Baseplate Attachment |
| Moterized arm | Neurostar | Customized | Surgery |
| Moterized arm software | Neurostar | Customized | Surgery |
| NI board | National instrument | Behavior test | |
| Removable epoxy bond | WPI | Kwik-Cast | Surgery |
| Resin cement (Super-bond) | Sun medical | Super bond C&B | Surgery |
| Skull screw | Stoelting | 51457 | Surgery |
| Stereotaxic electrode holder | ASI | EH-600 | Surgery |
| Stereotaxic frame | Stoelting | 51600 | Surgery |
| Stereotaxic manipulator | Stoelting | 51600 | Baseplate Attachment |
Referências
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