Imágenes de calcio in vivo exitosas con un microscopio miniaturizado head-mount en la amígdala del ratón que se comporta libremente
Summary
La imagen de calcio microendoscópica in vivo es una herramienta invaluable que permite el monitoreo en tiempo real de las actividades neuronales en animales que se comportan libremente. Sin embargo, aplicar esta técnica a la amígdala ha sido difícil. Este protocolo tiene como objetivo proporcionar una guía útil para atacar con éxito las células de amígdala con un microscopio miniaturizado en ratones.
Abstract
El monitoreo in vivo en tiempo real de las actividades neuronales en animales en movimiento libre es uno de los enfoques clave para vincular la actividad neuronal con el comportamiento. Para ello, se ha desarrollado y aplicado con éxito a muchas estructuras cerebrales1,2,3,4,5,6una técnica de imágenes in vivo que detecta transitorios de calcio en las neuronas utilizando indicadores de calcio codificados genéticamente (GECIs), un microscopio de fluorescencia miniaturizado y una lente de índice refractivo degradado (GRIN). Esta técnica de imágenes es particularmente potente porque permite la toma de imágenes simultáneas crónicas de poblaciones celulares genéticamente definidas durante un período a largo plazo hasta varias semanas. Aunque útil, esta técnica de imagen no se ha aplicado fácilmente a las estructuras cerebrales que se encuentran en lo profundo del cerebro como la amígdala, una estructura cerebral esencial para el procesamiento emocional y la memoria del miedo asociativo7. Hay varios factores que dificultan la aplicación de la técnica de imagen a la amígdala. Por ejemplo, los artefactos de movimiento generalmente ocurren con más frecuencia durante las imágenes realizadas en las regiones cerebrales más profundas porque un microscopio de montaje en la cabeza implantado en las profundidades del cerebro es relativamente inestable. Otro problema es que el ventrículo lateral se coloca cerca de la lente GRIN implantada y su movimiento durante la respiración puede causar artefactos de movimiento altamente irregulares que no se pueden corregir fácilmente, lo que dificulta la formación de una vista de imagen estable. Además, debido a que las células de la amígdala suelen estar silenciosas en un estado de reposo o anestesiado, es difícil encontrar y enfocar las células objetivo que expresan GECI en la amígdala durante el procedimiento de placa base para obtener imágenes posteriores. Este protocolo proporciona una guía útil sobre cómo dirigirse eficientemente a las células que expresan GECI en la amígdala con microscopio miniaturizado de montaje en la cabeza para obtener imágenes de calcio in vivo exitosas en una región cerebral más profunda. Se observa que este protocolo se basa en un sistema particular (por ejemplo, Inscopix) pero no se limita a él.
Introduction
El calcio es un segundo mensajero omnipresente, jugando un papel crucial en casi todas las funciones celulares8. En las neuronas, el disparo potencial de acción y la entrada sináptica causan un cambio rápido de libre intracelular [Ca2+]9,10. Por lo tanto, el seguimiento de los transitorios de calcio proporciona una oportunidad para monitorear la actividad neuronal. Los GECIs son potentes herramientas que permiten monitorear [Ca2+] en poblaciones celulares definidas y compartimentos intracelulares11,12. Entre muchos tipos diferentes de indicadores de calcio a base de proteínas, GCaMP, una sonda Ca2+ basada en una sola molécula GFP13,es la GECI más optimizada y por lo tanto ampliamente utilizada. A través de múltiples rondas de ingeniería, se han desarrollado una serie de variantes de GCaMP12,14,15,16. Utilizamos uno de los GCaMPs recientemente desarrollados, GCaMP7b, en este protocolo16. Los sensores GCaMP han contribuido en gran medida al estudio de las funciones de circuito neural en una serie de organismos modelo como la toma de imágenes de los transitorios Ca2+ durante el desarrollo17,la imagen in vivo en una capa cortical específica18,la medición de la dinámica de circuito en el aprendizaje de tareas motoras19 y la imagen de la actividad del conjunto celular relacionada con la memoria de miedo asociativa en el hipocampo y la amígdala20,21.
La imagen óptica de los GECIs tiene varias ventajas22. La codificación genética permite que los GECIs se expresen de forma estable durante un período de tiempo a largo plazo en un subconjunto específico de células definidas por perfil genético o patrones específicos de conectividad anatómica. Las imágenes ópticas permiten un monitoreo simultáneo crónico in vivo de cientos a miles de neuronas en animales vivos. Se han desarrollado algunos sistemas ópticos de imágenes para imágenes in vivo y análisis de GECIs dentro del cerebro de ratones que se comportan libremente con microscopios de fluorescencia miniaturizados de montaje en la cabeza21,23,24,25. A pesar de que la técnica de imagen óptica in vivo basada en GECIs, la lente GRIN y un microscopio en miniatura de montaje en la cabeza son una poderosa herramienta para estudiar el vínculo entre la actividad y el comportamiento de los circuitos neuronales, aplicar esta tecnología a la amígdala ha sido difícil debido a varios problemas técnicos relacionados con la orientación de la lente GRIN a las células que expresan GECIs en la amígdala sin causar artefactos de movimiento que reducen severamente la calidad de la adquisición de imágenes y la búsqueda de células que expresan GECIs. Este protocolo tiene como objetivo proporcionar una guía útil para los procedimientos quirúrgicos de fijación de placa base e implantación de lentes GRIN que son pasos críticos para obtener imágenes ópticas de calcio in vivo exitosas en la amígdala. Aunque este protocolo se dirige a la amígdala, la mayoría de los procedimientos descritos aquí son comúnmente aplicables a otras regiones cerebrales más profundas. Aunque este protocolo se basa en un sistema en particular (por ejemplo, Inscopix), el mismo propósito puede lograrse fácilmente con otros sistemas alternativos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las técnicas de cirugía hábiles son esenciales para lograr imágenes ópticas de calcio in vivo exitosas con microscopía en miniatura de montaje en la cabeza en regiones cerebrales más profundas como la amígdala como la describimos aquí. Por lo tanto, aunque este protocolo proporciona una guía para procesos quirúrgicos optimizados de fijación de placa base e implantación de lentes GRIN, es posible que sean necesarios procesos de optimización adicionales para pasos críticos. Como se menciona en la sección de…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de Samsung Science and Technology Foundation (Número de proyecto SSTF-BA1801-10).
Materials
| 26G needle | BD | 302002 | Surgery |
| AAV1-Syn-GCaMP7b-WPRE | Addgene | 104493-AAV1 | Surgery |
| AAV2/1-CaMKiiα-GFP | custom made | Surgery | |
| Acrylic-Dental cement (Ortho-jet Acrylic Pink) | Lang | 1334-pink | Surgery & Baseplate Attachment |
| Air flow manipulator | Neurotar | NTR000253-04 | Baseplate Attachment |
| Amoxicillin | SIGMA | A8523-5G | Surgery |
| Baseplate | INSCOPIX | 1050-002192 | Baseplate Attachment |
| Baseplate cover | INSCOPIX | 1050-002193 | Baseplate Attachment |
| Behavioral apparatus (chamber) | Coulbourn Instrument | Testcage | Behavior test |
| Behavioral apparatus (software) | Coulbourn Instrument | Freeze Frame | Behavior test |
| Carbon cage | Neurotar | 180mm x 70mm | Baseplate Attachment |
| Carprofen | SIGMA | PHR1452-1G | Surgery |
| Data processing software | INSCOPIX | INSCOPIX Data Processing Software | Baseplate Attachment & Behavior test |
| Dexamethasone | SIGMA | D1756-500MG | Surgery |
| Drill | Seyang | marathon-4 | Surgery |
| Drill bur | ELA | US1/2, Shank104 | Surgery |
| Glass needle | WPI | PG10165-4 | Surgery |
| GRIN lens (INSCOPIX Proview Lens Probe) | INSCOPIX | 1050-002208 | Surgery |
| Hamilton Syringe | Hamilton | 84875 | Surgery |
| Head plate | Neurotar | Model 5 | Surgery |
| Hex-key | INSCOPIX | 1050-004195 | Baseplate Attachment |
| Laptop computer | Samsung | NT950XBV | Surgery & Baseplate Attachment |
| Lens holder, Stereotaxic rod (INSCOPIX proview implant kit) | INSCOPIX | 1050-004223 | Surgery |
| Microscope gripper | INSCOPIX | 1050-002199 | Baseplate Attachment |
| Microscope, DAQ software, hardware | INSCOPIX | nVista 3.0 | Baseplate Attachment & Behavior test |
| Mobile homecage | Neurotar | MHC V5 | Baseplate Attachment |
| Moterized arm | Neurostar | Customized | Surgery |
| Moterized arm software | Neurostar | Customized | Surgery |
| NI board | National instrument | Behavior test | |
| Removable epoxy bond | WPI | Kwik-Cast | Surgery |
| Resin cement (Super-bond) | Sun medical | Super bond C&B | Surgery |
| Skull screw | Stoelting | 51457 | Surgery |
| Stereotaxic electrode holder | ASI | EH-600 | Surgery |
| Stereotaxic frame | Stoelting | 51600 | Surgery |
| Stereotaxic manipulator | Stoelting | 51600 | Baseplate Attachment |
Referências
- Gonzalez, W. G., Zhang, H., Harutyunyan, A., Lois, C. Persistence of neuronal representations through time and damage in the hippocampus. Science. 365 (6455), 821-825 (2019).
- Ghandour, K., et al. Orchestrated ensemble activities constitute a hippocampal memory engram. Nature Communications. 10 (1), 2637 (2019).
- Grundemann, J., et al. Amygdala ensembles encode behavioral states. Science. 364 (6437), (2019).
- Krabbe, S., et al. Adaptive disinhibitory gating by VIP interneurons permits associative learning. Nature Neuroscience. 22 (11), 1834-1843 (2019).
- Betley, J. N., et al. Neurons for hunger and thirst transmit a negative-valence teaching signal. Nature. 521 (7551), 180-185 (2015).
- Jennings, J. H., et al. Visualizing hypothalamic network dynamics for appetitive and consummatory behaviors. Cell. 160 (3), 516-527 (2015).
- LeDoux, J. E. Emotion circuits in the brain. Annual Review of Neuroscience. 23, 155-184 (2000).
- Burgoyne, R. D. Neuronal calcium sensor proteins: generating diversity in neuronal Ca2+ signalling. Nature Reviews Neuroscience. 8 (3), 182-193 (2007).
- Miyakawa, H., et al. Synaptically activated increases in Ca2+ concentration in hippocampal CA1 pyramidal cells are primarily due to voltage-gated Ca2+ channels. Neuron. 9 (6), 1163-1173 (1992).
- Denk, W., Yuste, R., Svoboda, K., Tank, D. W. Imaging calcium dynamics in dendritic spines. Current Opinion in Neurobiology. 6 (3), 372-378 (1996).
- Mank, M., et al. A genetically encoded calcium indicator for chronic in vivo two-photon imaging. Nature Methods. 5 (9), 805-811 (2008).
- Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2 (2013).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
- Zariwala, H. A., et al. A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo. Journal of Neuroscience. 32 (9), 3131-3141 (2012).
- Mittmann, W., et al. Two-photon calcium imaging of evoked activity from L5 somatosensory neurons in vivo. Nature Neuroscience. 14 (8), 1089-1093 (2011).
- Huber, D., et al. Multiple dynamic representations in the motor cortex during sensorimotor learning. Nature. 484 (7395), 473-478 (2012).
- Grewe, B. F., et al. Neural ensemble dynamics underlying a long-term associative memory. Nature. 543 (7647), 670-675 (2017).
- Cai, D. J., et al. A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time. Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).
- Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. Genetically encoded indicators of neuronal activity. Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).
- Zhang, L., et al. Miniscope GRIN Lens System for Calcium Imaging of Neuronal Activity from Deep Brain Structures in Behaving Animals. Current Protocols in Neuroscience. 86 (1), 56 (2019).
- Jacob, A. D., et al. A Compact Head-Mounted Endoscope for In vivo Calcium Imaging in Freely Behaving Mice. Current Protocols in Neuroscience. 84 (1), 51 (2018).
- Ghosh, K. K., et al. Miniaturized integration of a fluorescence microscope. Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).
- Xiong, B., et al. Precise Cerebral Vascular Atlas in Stereotaxic Coordinates of Whole Mouse Brain. Frontiers in Neuroanatomy. 11, 128 (2017).
- Mukamel, E. A., Nimmerjahn, A., Schnitzer, M. J. Automated analysis of cellular signals from large-scale calcium imaging data. Neuron. 63 (6), 747-760 (2009).
- Millhouse, O. E., DeOlmos, J. Neuronal configurations in lateral and basolateral amygdala. Neurociência. 10 (4), 1269-1300 (1983).
- McDonald, A. J. Neuronal organization of the lateral and basolateral amygdaloid nuclei in the rat. Journal of Comparative Neurology. 222 (4), 589-606 (1984).
- McDonald, A. J. Neurons of the lateral and basolateral amygdaloid nuclei: a Golgi study in the rat. Journal of Comparative Neurology. 212 (3), 293-312 (1982).
