البكتيريا الزراعية-بوساطة التحول الجيني، وإنتاج تحويل الجينات، وتطبيقها لدراسة التنمية الإنجابية للذكور في الأرز
Summary
يصف هذا العمل استخدام تكنولوجيا تحرير الجينوم CRISPR-Cas9 إلى الجينات الذاتية خروج المغلوب OsABCG15 متبوعة ببروتوكول تحويل معدل بوساطة Agrobacteriumلإنتاج خط مستقر معقم للذكور في الأرز.
Abstract
عقم الذكور هو سمة زراعية هامة لإنتاج البذور الهجينة التي تتميز عادة بعيوب وظيفية في الأعضاء التناسلية للذكور / الأماشعة. التقدم الأخير في تكنولوجيا تحرير الجينوم CRISPR-Cas9 يسمح بكفاءة تحرير عالية وطفرات خروج المغلوب المنقذة للاوقات من الجينات المرشحة الذاتية في مواقع محددة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن التحول الجيني للأرز بوساطة البكتيريا الزراعيةهو أيضاً طريقة رئيسية لتعديل الجينات، وهو ما تم تبنيه على نطاق واسع من قبل العديد من المختبرات العامة والخاصة. في هذه الدراسة، طبقنا CRISPR-Cas9 أدوات تحرير الجينوم ونجحنا في توليد ثلاثة خطوط متحولة عقيمة من الذكور عن طريق تحرير الجينوم المستهدف من OsABCG15 في أصناف japonica. استخدمنا طريقة تحويل الأرز المعدلة بوساطة أغروباكتيريومالتي يمكن أن توفر وسائل ممتازة للإحتياج الوراثي لإنتاج البذور الهجين في الأرز. يمكن الحصول على النباتات المعدلة وراثيا في غضون 2-3 أشهر، وتم فحص المحولات homozygous بواسطة genotyping باستخدام تضخيم PCR وتسلسل سانجر. تم تنفيذ توصيف الثيرنيتيبيك الأساسي لخط الهو انسجامزيجوات المعقم من قبل الملاحظة المجهرية للأعضاء التناسلية الذكورية الأرز، تحليل جدوى حبوب اللقاح بواسطة يوديد البوتاسيوم اليود (I2-KI) تلطيخ المقطع المقطع الفرعي شبه رقيقة من الأنثرس النامية.
Introduction
ويعتبر الأرز أهم المحاصيل الغذائية، لا سيما في البلدان النامية، وهو يمثل غذاء أساسيا لأكثر من نصف سكان العالم. وعموما، فإن الطلب على حبوب الأرز آخذ في الازدياد ومن المتوقع أن يزداد بنسبة 50 في المائة بحلول عام 2030 و 100 في المائة بحلول عام 20501،2. ويتعين أن تستفيد التحسينات المستقبلية في غلة الأرز من الموارد الجزيئية والجينية المتنوعة التي تجعل من الأرز نموذجاً ممتازاً لبحوث النباتات أحادية الكولدون. وتشمل هذه نظام التحول كفاءة ، والخريطة الجزيئية المتقدمة ، وقاعدة بيانات متاحة للجمهور من علامات تسلسل التعبير ، والتي تم إنشاؤها على مدى سنوات عديدة3،4. استراتيجية واحدة لتحسين غلة المحاصيل هي إنتاج البذور الهجين5، وهو عنصر مركزي منها هو القدرة على التلاعب خصوبة الذكور. يمكن أن يساعد فهم التحكم الجزيئي في خصوبة الذكور في محاصيل الحبوب على ترجمة المعرفة الرئيسية إلى تقنيات عملية لتحسين إنتاج البذور الهجينة وتعزيز إنتاجية المحاصيل6،7.
التحول الوراثي هو أداة رئيسية للبحث الأساسي والزراعة التجارية لأنه يتيح إدخال الجينات الأجنبية أو التلاعب بالجينات الذاتية في نباتات المحاصيل، ويؤدي إلى توليد خطوط معدلة وراثيا. ويمكن أن يساعد بروتوكول التحويل المناسب على تسريع الدراسات البيولوجية الوراثية والجزيئية من أجل الفهم الأساسي للتنظيم الجيني8. في البكتيريا, يحدث التحول الوراثي بشكل طبيعي; ومع ذلك، في النباتات، يتم تنفيذها اصطناعيا باستخدام تقنيات البيولوجيا الجزيئية9،10. Agrobacterium tumefaciens هي بكتيريا تحملها التربة، الغرام السلبية التي تسبب مرض المرارة التاج في النباتات عن طريق نقل T-DNA، وهي منطقة من بيلازمد تي، إلى الخلية النباتية عن طريق نظام إفراز نوع الرابع11،12. في النباتات، A. tumefaciens-يتوسط التحول يعتبر وسيلة واسعة النطاق لتعديل الجينات لأنه يؤدي إلى تكامل عدد نسخة مستقرة ومنخفضة من T-DNA في الجينوم المضيف13. تم توليد الأرز المحور وراثيا لأول مرة من خلال تحويل الجينات الزراعيةبوساطة في منتصف 1990s في جابونيكا cultivar14. باستخدام هذا البروتوكول، تم الحصول على العديد من الخطوط المعدلة وراثيا في غضون فترة 4 أشهر مع كفاءة التحول من 10٪ -30٪. وأشارت الدراسة إلى أن هناك خطوتين حاسمتين للتحول الناجح: الأولى هي تحريض الكولوس الجنيني من البذور الناضجة والأخرى هي إضافة الأسيتوسيرينجون، وهو مركب فينولي، إلى الثقافة البكتيرية أثناء الزراعة المشتركة، مما يسمح بكفاءة تحويل أعلى في النباتات14،15. وقد استخدم هذا البروتوكول على نطاق واسع مع تعديلات طفيفة في japonica16،17،18،19 ، فضلا عن أصناف أخرى مثل indica20،21،22،23 وjaponicaالاستوائية24،25. في الواقع، أكثر من 80٪ من المقالات التي تصف تحويل الأرز استخدام Agrobacterium-بوساطة تحويل الجينات كأداة13. حتى الآن، وقد تم تطوير العديد من بروتوكولات التحول الجيني باستخدام بذور الأرز كمادة البداية لالتحريض كالوس16،17،18،19. ومع ذلك ، لا يعرف سوى القليل جدا عن ازهار الشباب كما explants لإنتاج كالوس. وعموما، من المهم وضع بروتوكول سريع وفعال لتحويل الجينات وتجديدها من أجل علم الجينوم الوظيفي والدراسات المتعلقة بتحسين المحاصيل.
في السنوات الأخيرة، أدى تقدم تكنولوجيا CRISPR-Cas9 إلى آلية دقيقة لتحرير الجينوم لفهم وظيفة الجينات وتقديم تحسينات هامة زراعيا لتربية النباتات26،27. كما تقدم CRISPR وعدًا كبيرًا بالتلاعب في التنمية الإنجابية للذكور والإنتاج الهجين. في هذه الدراسة، استخدمنا نظام خروج المغلوب الجينات باستخدام تكنولوجيا CRISPR-Cas9 ويقترن ذلك ببروتوكول فعال لتحويل جينات الأرز باستخدام النضحات الصغيرة ككزروع، وبالتالي خلق خطوط عقيمة ذكورية مستقرة لدراسة التنمية الإنجابية.
Protocol
Representative Results
Discussion
يتم عادةً توليد المسوخ العقيمة الذكرية الاصطناعية بواسطة الطفرات الفيزيائية أو الكيميائية أو البيولوجية العشوائية. على الرغم من أن هذه هي تقنيات قوية، طبيعتها العشوائية فشل في الاستفادة من كمية هائلة من المعرفة الجينومية الحديثة التي لديها القدرة على تقديم تحسينات مصممة خصيصا في تربية …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود المؤلفون أن يعترفوا بـ “شياوفي تشن” لتوفيرها لفلورات الأرز الصغيرة والمساعدة في جعل زراعة أنسجة الأرز متوسطة. وقد دعم هذا العمل المؤسسة الوطنية الصينية للعلوم الطبيعية (31900611).
Materials
| 1-Naphthaleneacetic acid | Sigma-Aldrich | N0640 | |
| 2，4-Dichlorophenoxyacetic Acid | Sigma-Aldrich | D7299 | |
| 6-Benzylaminopurine (6-BA) | Sigma-Aldrich | B3408 | |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
| Agar | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10000561 | |
| Ammonium sulfate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10002918 | |
| Aneurine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T4625 | |
| Anhydrous ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10009218 | |
| Bacteriological peptone | Sangon Biotech | A100636 | |
| Beef extract | Sangon Biotech | A600114 | |
| Boric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10004808 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 20011160 | |
| Casein acid hydrolysate | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | C184 | |
| Cobalt(Ⅱ) chloride hexahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10007216 | |
| Copper(Ⅱ) sulfate pentahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10008218 | |
| D(+)-Glucose anhydrous | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 63005518 | |
| D-sorbitol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 63011037 | |
| EDTA, Disodium Salt, Dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| EOS Digital SLR and Compact System Cameras | Canon | EOS 700D | |
| Formaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010018 | |
| Fully Automated Rotary Microtome | Leica Biosystems | Leica RM 2265 | |
| Glacial acetic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10000208 | |
| Glycine | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 62011516 | |
| Hygromycin | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | H370 | |
| Inositol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 63007738 | |
| Iodine | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10011517 | |
| Iron(Ⅱ) sulfate heptahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10012116 | |
| Kanamycine | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | K378 | |
| Kinetin | Sigma-Aldrich | K0753 | |
| L-Arginine | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 62004034 | |
| L-Aspartic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 62004736 | |
| L-Glutamine | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | G229 | |
| L-proline | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | P698 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10013018 | |
| Manganese sulfate monohydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10013418 | |
| Microscopes | NIKON | Eclipse 80i | |
| MS | Phytotech | M519 | |
| Nicotinic acid | Sigma-Aldrich | N0765 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| Potassium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10016308 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10017608 | |
| Potassium iodide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10017160 | |
| Potassium nitrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 1001721933 | |
| Pyridoxine Hydrochloride (B6) | Sigma-Aldrich | 47862 | |
| Rifampicin | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | R501 | |
| Sodium hydroxide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019718 | |
| Sodium molybdate dihydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019816 | |
| Stereo microscopes | Leica Microsystems | Leica M205 A | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10021418 | |
| Technovit embedding Kits 7100 | Heraeus Teknovi, Germany | 14653 | |
| Timentin | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | T869 | |
| Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Water bath for paraffin sections | Leica Biosystems | Leica HI1210 | |
| Yeast extract | Sangon Biotech | A515245 | |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10024018 |
Referências
- Izawa, T., Shimamoto, K. Becoming a model plant: The importance of rice to plant science. Trends in Plant Science. 1 (3), 95-99 (1996).
- Shimamoto, K., Kyozuka, J. Rice as a model for comparative genomics of plants. Annual Review of Plant Biology. 53 (1), 399-419 (2002).
- Selva, C., et al. Hybrid breeding in wheat: how shaping floral biology can offer new perspectives. Functional Plant Biology. 47 (8), 675-694 (2020).
- Lippman, Z. B., Zamir, D. Heterosis: revisiting the magic. Trends in Genetics. 23 (2), 60-66 (2007).
- Zhang, D., Liang, W. Improving food security: using male fertility for hybrid seed breeding. Science. , 45-48 (2016).
- Masters, A., et al. Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes. Journal of Visualized Experiments. (156), e60782 (2020).
- Laurenceau, R., et al. A type IV pilus mediates DNA binding during natural transformation in Streptococcus pneumoniae. PLoS Pathogens. 9 (6), 1003473 (2013).
- Tzfira, T., Citovsky, V. Agrobacterium-mediated genetic transformation of plants: biology and biotechnology. Current Opinion in Biotechnology. 17 (2), 147-154 (2006).
- Gelvin, S. B. Agrobacterium in the genomics age. Plant Physiology. 150 (4), 1665-1676 (2009).
- Lacroix, B., Citovsky, V. The roles of bacterial and host plant factors in Agrobacterium-mediated genetic transformation. International Journal of Developmental Biology. 57, 467-481 (2013).
- Hiei, Y., Komari, T. Agrobacterium-mediated transformation of rice using immature embryos or calli induced from mature seed. Nature Protocols. 3 (5), 824 (2008).
- Hiei, Y., Ohta, S., Komari, T., Kumashiro, T. Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. The Plant Journal. 6 (2), 271-282 (1994).
- Hiei, Y., Komari, T., Kubo, T. Transformation of rice mediated by Agrobacterium tumefaciens. Plant Molecular Biology. 35 (1-2), 205-218 (1997).
- Nishimura, A., Aichi, I., Matsuoka, M. A protocol for Agrobacterium-mediated transformation in rice. Nature Protocols. 1 (6), 2796 (2006).
- Yara, A., et al. Production of transgenic japonica rice (Oryza sativa) cultivar, Taichung 65, by the Agrobacterium-mediated method. Plant Biotechnology. 18 (4), 305-310 (2001).
- Cho, S. K., et al. Efficient transformation of Korean rice cultivars (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens. Journal of Plant Biology. 41 (4), 262-268 (1998).
- Toki, S. Rapid and efficient Agrobacterium-mediated transformation in rice. Plant Molecular Biology Reporter. 15, 16-21 (1997).
- Zhang, J., Xu, R. j., Elliott, M. C., Chen, D. F. Agrobacterium-mediated transformation of elite indica and japonica rice cultivars. Molecular Biotechnology. 8 (3), 223-231 (1997).
- Aldemita, R. R., Hodges, T. K. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of japonica and indica rice varieties. Planta. 199 (4), 612-617 (1996).
- Rashid, H., Yokoi, S., Toriyama, K., Hinata, K. Transgenic plant production mediated by Agrobacterium in indica rice. Plant Cell Reports. 15 (10), 727-730 (1996).
- Sahoo, K. K., Tripathi, A. K., Pareek, A., Sopory, S. K., Singla-Pareek, S. L. An improved protocol for efficient transformation and regeneration of diverse indica rice cultivars. Plant Methods. 7 (1), 49 (2011).
- Rachmawati, D., Hosaka, T., Inoue, E., Anzai, H. Agrobacterium-mediated transformation of Javanica rice cv. Rojolele. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 68 (6), 1193-1200 (2004).
- Dong, J., Teng, W., Buchholz, W. G., Hall, T. C. Agrobacterium-mediated transformation of Javanica rice. Molecular Breeding. 2 (3), 267-276 (1996).
- Bortesi, L., Fischer, R. The CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and beyond. Biotechnology Advances. 33 (1), 41-52 (2015).
- Li, Q., et al. Development of japonica photo-sensitive genic male sterile rice lines by editing carbon starved anther using CRISPR/Cas9. Journal of Genetics and Genomics. 43 (6), 415 (2016).
- Qin, P., et al. ABCG15 encodes an ABC transporter protein, and is essential for Post-Meiotic anther and pollen exine development in rice. Plant and Cell Physiology. 54, (2013).
- Mao, Y., et al. Application of the CRISPR-Cas system for efficient genome engineering in plants. Molecular Plant. 6 (6), 2008-2011 (2013).
- Itoh, J. I., et al. Rice plant development: from zygote to spikelet. Plant and Cell Physiology. 46 (1), 23-47 (2005).
- Gawel, N. J., Jarret, R. L. A modified CTAB DNA extraction procedure forMusa andIpomoea. Plant Molecular Biology Reporter. 9 (3), 262-266 (1991).
- Wei, F. J., Droc, G., Guiderdoni, E., Hsing, Y. i. C. International Consortium of Rice Mutagenesis: resources and beyond. Rice. 6 (1), 39 (2013).
- Feng, Z., et al. Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cas system. Cell Research. 23 (10), 1229 (2013).
