Agrobacterium-Transformation génétique médiée, production transgénique et application pour l’étude du développement de la reproduction masculine dans le riz
Summary
Ce travail décrit l’utilisation de la technologie d’édition du génome CRISPR-Cas9 pour éliminer le gène endogène OsABCG15 suivi d’un protocole de transformation modifié sous médiation agrobactériepour produire une lignée stable mâle-stérile dans le riz.
Abstract
La stérilité masculine est un trait agronomique important pour la production de semences hybrides qui se caractérise habituellement par des défauts fonctionnels dans les organes reproducteurs mâles/gamètes. Les progrès récents de la technologie d’édition du génome CRISPR-Cas9 permettent une efficacité d’édition élevée et des mutations par KO de gènes candidats endogènes à des sites spécifiques. En outre, la transformation génétique du riz par agrobactérieest également une méthode clé pour la modification des gènes, qui a été largement adoptée par de nombreux laboratoires publics et privés. Dans cette étude, nous avons appliqué des outils d’édition du génome CRISPR-Cas9 et avons réussi à générer trois lignées mutantes stériles mâles par modification du génome ciblée d’OsABCG15 dans un cultivar japonica. Nous avons utilisé une méthode modifiée de transformation du riz sous médiation agrobactériequi pourrait fournir d’excellents moyens d’émasculation génétique pour la production de semences hybrides dans le riz. Les plantes transgéniques peuvent être obtenues dans un délai de 2 à 3 mois et les transformateurs homozygotes ont été examinés par génotypage à l’aide de l’amplification pcr et du séquençage sanger. La caractérisation phénotypique de base de la ligne mâle d’homozygote stérile a été exécutée par l’observation microscopique des organes reproducteurs mâles de riz, l’analyse de viabilité de pollen par l’iodure de potassium d’iode (I2-KI) tachetant semi-mince-sectionment de développement des anthers.
Introduction
Le riz est la culture alimentaire la plus importante, en particulier dans les pays en développement, et représente un aliment de base pour plus de la moitié de la population mondiale. Dans l’ensemble, la demande de céréales de riz augmente et devrait augmenter de 50 % d’ici 2030 et de 100 % d’ici 20501,2. Les améliorations futures du rendement du riz devront tirer parti de diverses ressources moléculaires et génétiques qui font du riz un excellent modèle pour la recherche sur les plantes monocotyledonous. Il s’agit notamment d’un système de transformation efficace, d’une carte moléculaire avancée et d’une base de données accessible au public des balises de séquence exprimées, qui ont été générées sur de nombreuses années3,4. Une stratégie pour améliorer le rendement des cultures est la production de semences hybrides5, dont un élément central est la capacité de manipuler la fertilité masculine. Comprendre le contrôle moléculaire de la fertilité masculine dans les cultures céréalières peut aider à traduire les connaissances clés en techniques pratiques pour améliorer la production de semences hybrides et améliorer la productivité des cultures6,7.
La transformation génétique est un outil clé pour la recherche fondamentale et l’agriculture commerciale, car elle permet l’introduction de gènes étrangers ou la manipulation de gènes endogènes dans les plantes cultivées, et entraîne la génération de lignées génétiquement modifiées. Un protocole de transformation approprié peut aider à accélérer les études de biologie génétique et moléculaire pour la compréhension fondamentale de la régulation des gènes8. Chez les bactéries, la transformation génétique a lieu naturellement; cependant, dans les plantes, il est effectué artificiellement en utilisant des techniques de biologie moléculaire9,10. Agrobacterium tumefaciens est une bactérie gramnégative transmise par le sol qui cause la maladie de la gale de la couronne chez les plantes en transférant t-ADN, une région de son Plasmide Ti, dans la cellule végétale via un système de sécrétion de type IV11,12. Chez les plantes, la transformation sous médiation A. tumefaciensest considérée comme une méthode répandue de modification génétique parce qu’elle conduit à l’intégration stable et faible du nombre de copies de l’ADN T dans le génome hôte13. Le riz transgénique a été généré pour la première fois par la transformation des gènes sous médiation Agrobacteriumau milieu des années 1990 dans le cultivarjaponica 14. À l’aide de ce protocole, plusieurs lignées transgéniques ont été obtenues en l’espace de 4 mois avec une efficacité de transformation de 10 à 30 %. L’étude a indiqué qu’il y a deux étapes critiques pour la transformation réussie : l’une est l’induction du callus embryogène des graines mûres et l’autre est l’addition de l’acétosyringone, un composé phénolique, à la culture bactérienne pendant la co-culture, qui permet une plus grande efficacité de transformation dans les plantes14,15. Ce protocole a été largement utilisé avec des modifications mineures dans japonica16,17,18,19 ainsi que d’autres cultivars tels que indica20,21,22,23 et tropical japonica24,25. En effet, plus de 80 % des articles décrivant la transformation du riz utilisent la transformation génétique d’Agrobacteriumcomme outil13. À ce jour, plusieurs protocoles de transformation génétique ont été développés en utilisant les semences de riz comme matériau de départ pour l’induction de callus16,17,18,19. Cependant, on sait très peu de choses sur l’inflorescence des jeunes comme explants pour la production de callus. Dans l’ensemble, il est important d’établir un protocole de transformation et de régénération des gènes rapide, reproductible et efficace pour la génomique fonctionnelle et les études sur l’amélioration des cultures.
Ces dernières années, l’avancement de la technologie CRISPR-Cas9 a abouti à un mécanisme précis d’édition du génome pour comprendre la fonction des gènes et apporter des améliorations agronomiquement importantes pour la sélection végétale26,27. CRISPR offre également des promesses considérables pour la manipulation du développement reproducteur masculin et de la production hybride. Dans cette étude, nous avons utilisé un système de knock-out de gène utilisant la technologie CRISPR-Cas9 et l’avons couplé à un protocole efficace de transformation de gène de riz utilisant de jeunes inflorescences comme explants, créant ainsi des lignes stériles mâles stables pour l’étude du développement reproducteur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les mutants stériles mâles géniques artificiels sont traditionnellement générés par une mutagenèse physique, chimique ou biologique aléatoire. Bien qu’il s’agit de techniques puissantes, leur nature aléatoire ne parvient pas à tirer parti de la grande quantité de connaissances génomiques modernes qui a le potentiel d’apporter des améliorations sur mesure dans la reproduction moléculaire32. Le système CRISPR-Cas9 a été largement utilisé dans les plantes en raison de ses moye…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier Xiaofei Chen d’avoir fourni les jeunes inflorescences de riz et d’avoir aidé à faire de la culture des tissus de riz un milieu. Ce travail a été soutenu par la National Natural Science Foundation of China (31900611).
Materials
| 1-Naphthaleneacetic acid | Sigma-Aldrich | N0640 | |
| 2，4-Dichlorophenoxyacetic Acid | Sigma-Aldrich | D7299 | |
| 6-Benzylaminopurine (6-BA) | Sigma-Aldrich | B3408 | |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
| Agar | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10000561 | |
| Ammonium sulfate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10002918 | |
| Aneurine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T4625 | |
| Anhydrous ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10009218 | |
| Bacteriological peptone | Sangon Biotech | A100636 | |
| Beef extract | Sangon Biotech | A600114 | |
| Boric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10004808 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 20011160 | |
| Casein acid hydrolysate | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | C184 | |
| Cobalt(Ⅱ) chloride hexahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10007216 | |
| Copper(Ⅱ) sulfate pentahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10008218 | |
| D(+)-Glucose anhydrous | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 63005518 | |
| D-sorbitol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 63011037 | |
| EDTA, Disodium Salt, Dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| EOS Digital SLR and Compact System Cameras | Canon | EOS 700D | |
| Formaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010018 | |
| Fully Automated Rotary Microtome | Leica Biosystems | Leica RM 2265 | |
| Glacial acetic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10000208 | |
| Glycine | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 62011516 | |
| Hygromycin | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | H370 | |
| Inositol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 63007738 | |
| Iodine | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10011517 | |
| Iron(Ⅱ) sulfate heptahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10012116 | |
| Kanamycine | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | K378 | |
| Kinetin | Sigma-Aldrich | K0753 | |
| L-Arginine | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 62004034 | |
| L-Aspartic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 62004736 | |
| L-Glutamine | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | G229 | |
| L-proline | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | P698 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10013018 | |
| Manganese sulfate monohydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10013418 | |
| Microscopes | NIKON | Eclipse 80i | |
| MS | Phytotech | M519 | |
| Nicotinic acid | Sigma-Aldrich | N0765 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| Potassium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10016308 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10017608 | |
| Potassium iodide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10017160 | |
| Potassium nitrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 1001721933 | |
| Pyridoxine Hydrochloride (B6) | Sigma-Aldrich | 47862 | |
| Rifampicin | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | R501 | |
| Sodium hydroxide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019718 | |
| Sodium molybdate dihydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019816 | |
| Stereo microscopes | Leica Microsystems | Leica M205 A | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10021418 | |
| Technovit embedding Kits 7100 | Heraeus Teknovi, Germany | 14653 | |
| Timentin | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | T869 | |
| Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Water bath for paraffin sections | Leica Biosystems | Leica HI1210 | |
| Yeast extract | Sangon Biotech | A515245 | |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10024018 |
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