Agrobacterium-Mediert genetisk transformasjon, transgen produksjon, og dens anvendelse for studiet av mannlig reproduktiv utvikling i ris
Summary
Dette arbeidet beskriver bruken av CRISPR-Cas9 genomredigeringsteknologi for å slå ned endogene genet OsABCG15 etterfulgt av en modifisert Agrobacterium-medierttransformasjonsprotokoll for å produsere en stabil mannssteril linje i ris.
Abstract
Mannlig sterilitet er en viktig agronomisk egenskap for hybrid frøproduksjon som vanligvis er preget av funksjonelle defekter i mannlige reproduktive organer / gametes. Nylige fremskritt innen CRISPR-Cas9 genomredigeringsteknologi gir høy redigeringseffekt og tidsbesparende knockoutmutasjoner av endogene kandidatgener på bestemte steder. I tillegg er Agrobacterium-mediert genetisk transformasjon av ris også en viktig metode for genmodifisering, som har blitt mye vedtatt av mange offentlige og private laboratorier. I denne studien brukte vi CRISPR-Cas9 genomredigeringsverktøy og genererte vellykket tre mannlige sterile mutantlinjer ved målrettet genomredigering av OsABCG15 i en japonica-sort. Vi brukte en modifisert Agrobacterium-mediert ris transformasjon metode som kan gi gode midler for genetisk emasculation for hybrid frø produksjon i ris. Transgene planter kan oppnås innen 2–3 måneder, og homozygøse transformanter ble screenet ved å genotyping ved hjelp av PCR-forsterkning og Sanger-sekvensering. Grunnleggende fenotypisk karakterisering av den mannlige sterile homozygous linjen ble utført ved mikroskopisk observasjon av ris mannlige reproduktive organer, pollen levedyktighet analyse av jod kaliumjodid (I2-KI) farging semi-tynn tverrsnitt av utviklende anthers.
Introduction
Ris er den viktigste matavlingen, spesielt i utviklingsland, og representerer en stiftmat for over halvparten av verdens befolkning. Samlet sett øker etterspørselen etter riskorn og forventes å øke 50% innen 2030 og 100% innen 20501,,2. Fremtidige forbedringer i risutbyttet må kapitalisere på ulike molekylære og genetiske ressurser som gjør ris til en utmerket modell for monocotyledonous planteforskning. Disse inkluderer et effektivt transformasjonssystem, avansert molekylært kart og offentlig tilgjengelig database med uttrykte sekvenskoder, som har blitt generert over mangeår 3,,4. En strategi for å forbedre avlingsutbyttet er hybridfrøproduksjon 5,et sentralt element som er evnen til å manipulere mannlig fruktbarhet. Forstå molekylær kontroll av mannlig fruktbarhet i kornavlinger kan bidra til å oversette viktig kunnskap til praktiske teknikker for å forbedre hybrid frø produksjon og forbedre avling produktivitet6,,7.
Genetisk transformasjon er et viktig verktøy for grunnleggende forskning og kommersielt landbruk siden det muliggjør innføring av fremmede gener eller manipulering av endogene gener i avlingsplanter, og resulterer i generering av genmodifiserte linjer. En passende transformasjonsprotokoll kan bidra til å akselerere genetiske og molekylærbiologistudier for grunnleggende forståelse av genregulering8. I bakterier foregår genetisk transformasjon naturlig; men i planter utføres det kunstig ved hjelp av molekylærbiologiteknikker 9,10. Agrobacterium tumefaciens er en jordbåren, Gram-negativ bakterie som forårsaker krone gallesykdom i planter ved å overføre T-DNA, en region av sin Ti plasmid, inn i plantecellen via et type IV sekresjonssystem11,12. I planter anses A. tumefaciens-mediert transformasjon som en utbredt metode for genmodifisering fordi det fører til stabil og lav kopinummerintegrasjon av T-DNA i vertsgenomet13. Transgen ris ble først generert gjennom Agrobacterium-mediert gentransformasjon på midten av 1990-tallet i japonica sorti14. Ved hjelp av denne protokollen ble flere transgene linjer oppnådd i løpet av en periode på 4 måneder med en transformasjonseffektivitet på 10%-30%. Studien indikerte at det er to kritiske skritt for vellykket transformasjon: en er induksjon av embryogen callus fra modne frø og en annen er tillegg av acetosyringone, en fenolisk forbindelse, til bakteriekulturen under samtidig dyrking, noe som gir høyere transformasjonseffektivitet iplanter 14,15. Denne protokollen har blitt mye brukt med mindre endringer i japonica16,,17,,18,,19 samt andre sorter som indica20,,21,,22,,23 og tropisk japonica24,25. Faktisk bruker over 80% av artiklene som beskriver ristransformasjon Agrobacterium-mediert gentransformasjon som et verktøy13. Til dags dato har flere genetiske transformasjonsprotokoller blitt utviklet ved hjelp av risfrø som startmateriale for callus induksjon16,17,18,19. Imidlertid er svært lite kjent om unge blomsterstand som explants for callus produksjon. Samlet sett er det viktig å etablere en rask, reproduserbar og effektiv gentransformasjons- og regenereringsprotokoll for funksjonell genomikk og studier på avlingsforbedring.
De siste årene har utviklingen av CRISPR-Cas9-teknologi resultert i en presis genomredigeringsmekanisme for å forstå genfunksjonen og levere agronomisk viktige forbedringer forplanteavl 26,27. CRISPR gir også et betydelig løfte om manipulering av mannlig reproduktiv utvikling og hybridproduksjon. I denne studien benyttet vi et genutslagssystem ved hjelp av CRISPR-Cas9-teknologi og opprettet det til en effektiv risgentransformasjonsprotokoll ved hjelp av unge blomsterstander som explants, og dermed skape stabile mannlige sterile linjer for studiet av reproduktiv utvikling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kunstige geniske mannlige sterile mutanter genereres tradisjonelt av tilfeldig fysisk, kjemisk eller biologisk mutagenese. Selv om dette er kraftige teknikker, klarer deres tilfeldige natur ikke å kapitalisere på den enorme mengden moderne genomisk kunnskap som har potensial til å levere skreddersydde forbedringer i molekylær avl32. CRISPR-Cas9-systemet har blitt mye brukt i planter på grunn av sine enkle og rimelige midler for å manipulere og redigere DNA29,</su…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å anerkjenne Xiaofei Chen for å gi de unge ris blomsterstander og hjelp til å gjøre risvev kultur medium. Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (31900611).
Materials
| 1-Naphthaleneacetic acid | Sigma-Aldrich | N0640 | |
| 2，4-Dichlorophenoxyacetic Acid | Sigma-Aldrich | D7299 | |
| 6-Benzylaminopurine (6-BA) | Sigma-Aldrich | B3408 | |
| Acetosyringone | Sigma-Aldrich | D134406 | |
| Agar | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10000561 | |
| Ammonium sulfate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10002918 | |
| Aneurine hydrochloride | Sigma-Aldrich | T4625 | |
| Anhydrous ethanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10009218 | |
| Bacteriological peptone | Sangon Biotech | A100636 | |
| Beef extract | Sangon Biotech | A600114 | |
| Boric acid | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10004808 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 20011160 | |
| Casein acid hydrolysate | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | C184 | |
| Cobalt(Ⅱ) chloride hexahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10007216 | |
| Copper(Ⅱ) sulfate pentahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10008218 | |
| D(+)-Glucose anhydrous | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 63005518 | |
| D-sorbitol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 63011037 | |
| EDTA, Disodium Salt, Dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| EOS Digital SLR and Compact System Cameras | Canon | EOS 700D | |
| Formaldehyde | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010018 | |
| Fully Automated Rotary Microtome | Leica Biosystems | Leica RM 2265 | |
| Glacial acetic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10000208 | |
| Glycine | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 62011516 | |
| Hygromycin | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | H370 | |
| Inositol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 63007738 | |
| Iodine | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10011517 | |
| Iron(Ⅱ) sulfate heptahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10012116 | |
| Kanamycine | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | K378 | |
| Kinetin | Sigma-Aldrich | K0753 | |
| L-Arginine | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 62004034 | |
| L-Aspartic acid | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 62004736 | |
| L-Glutamine | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | G229 | |
| L-proline | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | P698 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10013018 | |
| Manganese sulfate monohydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10013418 | |
| Microscopes | NIKON | Eclipse 80i | |
| MS | Phytotech | M519 | |
| Nicotinic acid | Sigma-Aldrich | N0765 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| Potassium chloride | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10016308 | |
| Potassium dihydrogen phosphate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10017608 | |
| Potassium iodide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10017160 | |
| Potassium nitrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 1001721933 | |
| Pyridoxine Hydrochloride (B6) | Sigma-Aldrich | 47862 | |
| Rifampicin | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | R501 | |
| Sodium hydroxide | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019718 | |
| Sodium molybdate dihydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019816 | |
| Stereo microscopes | Leica Microsystems | Leica M205 A | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10021418 | |
| Technovit embedding Kits 7100 | Heraeus Teknovi, Germany | 14653 | |
| Timentin | Beijing XMJ Scientific Co., Ltd | T869 | |
| Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Water bath for paraffin sections | Leica Biosystems | Leica HI1210 | |
| Yeast extract | Sangon Biotech | A515245 | |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10024018 |
Referências
- Izawa, T., Shimamoto, K. Becoming a model plant: The importance of rice to plant science. Trends in Plant Science. 1 (3), 95-99 (1996).
- Shimamoto, K., Kyozuka, J. Rice as a model for comparative genomics of plants. Annual Review of Plant Biology. 53 (1), 399-419 (2002).
- Selva, C., et al. Hybrid breeding in wheat: how shaping floral biology can offer new perspectives. Functional Plant Biology. 47 (8), 675-694 (2020).
- Lippman, Z. B., Zamir, D. Heterosis: revisiting the magic. Trends in Genetics. 23 (2), 60-66 (2007).
- Zhang, D., Liang, W. Improving food security: using male fertility for hybrid seed breeding. Science. , 45-48 (2016).
- Masters, A., et al. Agrobacterium-Mediated Immature Embryo Transformation of Recalcitrant Maize Inbred Lines Using Morphogenic Genes. Journal of Visualized Experiments. (156), e60782 (2020).
- Laurenceau, R., et al. A type IV pilus mediates DNA binding during natural transformation in Streptococcus pneumoniae. PLoS Pathogens. 9 (6), 1003473 (2013).
- Tzfira, T., Citovsky, V. Agrobacterium-mediated genetic transformation of plants: biology and biotechnology. Current Opinion in Biotechnology. 17 (2), 147-154 (2006).
- Gelvin, S. B. Agrobacterium in the genomics age. Plant Physiology. 150 (4), 1665-1676 (2009).
- Lacroix, B., Citovsky, V. The roles of bacterial and host plant factors in Agrobacterium-mediated genetic transformation. International Journal of Developmental Biology. 57, 467-481 (2013).
- Hiei, Y., Komari, T. Agrobacterium-mediated transformation of rice using immature embryos or calli induced from mature seed. Nature Protocols. 3 (5), 824 (2008).
- Hiei, Y., Ohta, S., Komari, T., Kumashiro, T. Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA. The Plant Journal. 6 (2), 271-282 (1994).
- Hiei, Y., Komari, T., Kubo, T. Transformation of rice mediated by Agrobacterium tumefaciens. Plant Molecular Biology. 35 (1-2), 205-218 (1997).
- Nishimura, A., Aichi, I., Matsuoka, M. A protocol for Agrobacterium-mediated transformation in rice. Nature Protocols. 1 (6), 2796 (2006).
- Yara, A., et al. Production of transgenic japonica rice (Oryza sativa) cultivar, Taichung 65, by the Agrobacterium-mediated method. Plant Biotechnology. 18 (4), 305-310 (2001).
- Cho, S. K., et al. Efficient transformation of Korean rice cultivars (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens. Journal of Plant Biology. 41 (4), 262-268 (1998).
- Toki, S. Rapid and efficient Agrobacterium-mediated transformation in rice. Plant Molecular Biology Reporter. 15, 16-21 (1997).
- Zhang, J., Xu, R. j., Elliott, M. C., Chen, D. F. Agrobacterium-mediated transformation of elite indica and japonica rice cultivars. Molecular Biotechnology. 8 (3), 223-231 (1997).
- Aldemita, R. R., Hodges, T. K. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of japonica and indica rice varieties. Planta. 199 (4), 612-617 (1996).
- Rashid, H., Yokoi, S., Toriyama, K., Hinata, K. Transgenic plant production mediated by Agrobacterium in indica rice. Plant Cell Reports. 15 (10), 727-730 (1996).
- Sahoo, K. K., Tripathi, A. K., Pareek, A., Sopory, S. K., Singla-Pareek, S. L. An improved protocol for efficient transformation and regeneration of diverse indica rice cultivars. Plant Methods. 7 (1), 49 (2011).
- Rachmawati, D., Hosaka, T., Inoue, E., Anzai, H. Agrobacterium-mediated transformation of Javanica rice cv. Rojolele. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 68 (6), 1193-1200 (2004).
- Dong, J., Teng, W., Buchholz, W. G., Hall, T. C. Agrobacterium-mediated transformation of Javanica rice. Molecular Breeding. 2 (3), 267-276 (1996).
- Bortesi, L., Fischer, R. The CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and beyond. Biotechnology Advances. 33 (1), 41-52 (2015).
- Li, Q., et al. Development of japonica photo-sensitive genic male sterile rice lines by editing carbon starved anther using CRISPR/Cas9. Journal of Genetics and Genomics. 43 (6), 415 (2016).
- Qin, P., et al. ABCG15 encodes an ABC transporter protein, and is essential for Post-Meiotic anther and pollen exine development in rice. Plant and Cell Physiology. 54, (2013).
- Mao, Y., et al. Application of the CRISPR-Cas system for efficient genome engineering in plants. Molecular Plant. 6 (6), 2008-2011 (2013).
- Itoh, J. I., et al. Rice plant development: from zygote to spikelet. Plant and Cell Physiology. 46 (1), 23-47 (2005).
- Gawel, N. J., Jarret, R. L. A modified CTAB DNA extraction procedure forMusa andIpomoea. Plant Molecular Biology Reporter. 9 (3), 262-266 (1991).
- Wei, F. J., Droc, G., Guiderdoni, E., Hsing, Y. i. C. International Consortium of Rice Mutagenesis: resources and beyond. Rice. 6 (1), 39 (2013).
- Feng, Z., et al. Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cas system. Cell Research. 23 (10), 1229 (2013).
