Samtidig levende bildebehandling av flere insektembryoer i prøvekammerbaserte lysarkfluorescensmikroskoper
Summary
Lysarkbasert fluorescensmikroskopi er det mest verdifulle verktøyet i utviklingsbiologi. Et stort problem i komparative studier er omgivelsesvariasjon. Vår protokoll beskriver et eksperimentelt rammeverk for samtidig levende bildebehandling av flere prøver og tar derfor opp dette problemet proaktivt.
Abstract
Lysplatebasert fluorescensmikroskopi tilbyr effektive løsninger for å studere komplekse prosesser på flere biologisk relevante skalaer. Prøvekammerbaserte oppsett, som er spesielt designet for å bevare prøvens tredimensjonale integritet og vanligvis har prøverotasjon, er det beste valget i utviklingsbiologi. For eksempel har de blitt brukt til å dokumentere hele embryonal morfogenese av fruktfluen Drosophila melanogaster og den røde melbillen Tribolium castaneum. Imidlertid gir mange tilgjengelige live bildeprotokoller bare eksperimentelle rammer for enkle embryoer. Spesielt for komparative studier er slike tilnærminger upraktiske, siden sekvensielt avbildet prøver påvirkes av omgivelsesvariasjon. Videre begrenser dette antall prøver som kan analyses innen en gitt tid. Vi tilbyr et eksperimentelt rammeverk for samtidig levende bildebehandling som øker gjennomstrømningen i prøvekammerbaserte oppsett og dermed sikrer lignende omgivelsesforhold for alle prøver. For det første gir vi en kalibreringsretningslinje for lysarkfluorescensmikroskoper. For det andre foreslår vi en monteringsmetode for flere embryoer som er kompatible med prøverotasjon. For det tredje gir vi eksemplariske tredimensjonale live imaging datasett av Drosophila, som vi sammenstiller tre transgene linjer med fluorescerende merket nuklei, samt tribolium, som vi sammenligner ytelsen til tre transgene underlinjer som bærer samme transgene, men på forskjellige genomiske steder. Vår protokoll er spesielt designet for komparative studier da den proaktivt adresserer omgivelsesvarians, som alltid er til stede i sekvensiell levende avbildning. Dette er spesielt viktig for kvantitative analyser og karakterisering av aberrasjonelle fenotyper, som for eksempel skyldes knockout-eksperimenter. Videre øker det den generelle gjennomstrømningen, noe som er svært praktisk når tilgangen til lysarkfluorescensmikroskop er begrenset. Til slutt kan den foreslåtte monteringsmetoden tilpasses andre insektarter og ytterligere modellorganismer, for eksempel sebrafisk, uten optimaliseringsinnsats.
Introduction
Fluorescensmikroskopi er en av de mest essensielle avbildningsteknikkene i biovitenskapen, spesielt i celle- og utviklingsbiologi. I konfekt fluorescensmikroskop1, som er toppmoderne for tredimensjonal fluorescensavbildning siden midten av 1990-tallet, brukes den samme linsen til fluorofordrivelse og utslippslysdeteksjon. Belysningslaserstrålen begeistrer alle fluoroforer langs belysnings-/deteksjonsaksen, og det respektive signalet utenfor fokus diskrimineres før det oppdages av et hull. Derfor, for hvert todimensjonalt bilde, er hele prøven opplyst. Følgelig, for hvert tredimensjonalt bilde, det vil si en stabel med romlig påfølgende todimensjonale bilder, blir hele prøven opplyst flere dusin til noen hundre ganger2, noe som fremmer fotobleaching og fototoksisitet3.
For nesten tjue år siden dukket lysarkbasert teknologi4 opp som et lovende alternativ for tredimensjonal fluorescensavbildning og ble dermed et verdifullt verktøy i utviklingsbiologi5. I denne tilnærmingen blir belysning og deteksjon avkoplet. Belysningslinsen brukes til å generere et lysark med en dybde på bare noen få mikrometer i fokusplanet til det vinkelrett arrangerte deteksjonslinsen. Derfor, for hvert todimensjonale bilde, lyser bare et tynt planmålvolum rundt fokusplanet. Følgelig, for hvert tredimensjonalt bilde, lyser hele prøven bare en gang, noe som sterkt reduserer fotobleaching og fototoksisitet6. Av denne grunn tilbyr lysarkfluorescensmikroskop (LSFMer) effektive løsninger for å studere komplekse prosesser på flere biologisk relevante skalaer og er derfor av særlig verdi i utviklingsbiologi, hvor prøver så store som flere millimeter må analyseres på subcellulært nivå.
Historisk sett har LSFMer vært utvalgskammerbaserte7,8. I disse oppsettene arrangeres belysningsaksene (x) og deteksjonsaksene (z) vanligvis vinkelrett på gravitasjonsaksen (y). Prøvekamre gir rikelig eksperimentell frihet. For det første gir de stor bildebufferkapasitet, noe som igjen letter bruken av et perfusjonssystem for å kontrollere miljøet, for eksempel for å opprettholde en bestemt temperatur9 eller for å bruke biokjemiske stressfaktorer. Videre støtter de tilpassede monteringsmetoder10 som er skreddersydd til de respektive eksperimentelle behovene, samtidig som de bevarer de tredimensjonale, i noen tilfeller dynamisk11, integriteten til prøven. I tillegg er prøvekammerbaserte oppsett vanligvis utstyrt med en rotasjonsfunksjon som brukes til å dreie prøvene rundt y-aksen og dermed bilde dem langs to, fire eller enda flere retninger. Siden embryoer av ofte brukte modellorganismer er, i sammenheng med mikroskopi, gir relativt stor, påfølgende avbildning langs ventral-dorsal, lateral og / eller fremre bakre kroppsakser en mer omfattende representasjon. Dette gjør det for eksempel mulig å spore celler som beveger seg langs komplekse tredimensjonale overføringsbaner12,13.
Lysarkbasert fluorescensmikroskopi har blitt brukt mye for å studere den embryonale morfogenesen til Drosophila melanogaster, både systematisk14,15 samt med et spesifikt fokus på de biofysiske aspektene ved utvikling. For eksempel ble den brukt til å samle høyoppløselige morfogenetiske data for å oppdage en biomekanisk kobling mellom endoderm invaginasjon og akseforlengelse under bakteriebåndforlengelse16 og videre for å relatere den komplekse cellulære strømmen med kraftgenereringsmønstre under gastrulation17. Det har også blitt kombinert med andre toppmoderne teknikker, for eksempel optogenetikk for å undersøke reguleringen av Wnt-signalering under fremre-bakre mønster i epidermis18.
Å studere bare en art gir imidlertid ikke innsikt i utviklingens utvikling. For å forstå embryogenese innenfor den fylogenetiske konteksten er det utført intensiv forskning med alternative insektmodellorganismer. En av de mest omfattende undersøkte artene er den røde melbillen Tribolium castaneum, et økonomisk relevant lagret korn19, hvis embryonal morfogenese også allerede er systematisk avbildet med LSFM20. Den embryonale morfogenesen til disse to artene varierer bemerkelsesverdig i flere aspekter, for eksempel segmenteringsmodus21, samt dannelse og nedbrytning av ekstra-embryonale membraner22. Sistnevnte aspekt er allerede grundig analysert ved hjelp av LSFMer. For eksempel har det vist seg at serosa, et ekstra embryonalt vev som omslutter og beskytter Tribolium-embryoet mot ulike farer for den bedre delen av embryogenesen23,24, fungerer også som den morfogenetiske “driveren” for sin egen abstinensprosess under dorsal lukking25. Videre har det blitt demonstrert at under gastrulation forblir en bestemt region av blastodermen forankret til vitellinemembranen for å skape asymmetriske vevsbevegelser26, og etter denne observasjonen tillater regionalisert vevsfluidisering celler å sekvensielt forlate serosakanten under serosa vinduslukking27.
I alle Drosophila– og Tribolium-tilknyttede studier som er nevnt ovenfor, har utvalgskammerbaserte LSFMer blitt brukt. I de fleste ble embryoene registrert langs flere retninger ved hjelp av prøverotasjonsfunksjonen. Selv om det ikke er uttrykkelig angitt, kan det antas at de har blitt registrert individuelt og dermed uavhengig av hverandre i sekvensielle levende bildeanalyser, som ligner vårt tidligere arbeid på Tribolium20,28. I visse scenarier er en slik tilnærming akseptabel, men spesielt i kvantitative komparative tilnærminger kan omgivelsesvariasjon forvrenge resultatene. For eksempel har det lenge vært kjent at insektens utviklingshastighet er temperaturavhengig29, men en nyere studie antyder videre at i Drosophilakan temperaturen også påvirke konsentrasjonen av morfogener30. Følgelig, hvis visse egenskaper ved embryogenese, for eksempel de dynamiske proporsjonene, divisjonsratene og migrasjonshastighetene til celler, bør kvantifiseres nøyaktig, er det nødvendig med tilstrekkelige repetisjoner uten omgivelsesvarians. Dette minimerer standardavvik og standardfeil, noe som igjen letter sammenstilling med andre, selv bare marginalt avvikende eksperimentelle forhold.
Eksempelkammerbaserte LSFMer er imidlertid primært utformet for høyt innhold i stedet for analyser med høy gjennomstrømning. I motsetning til konfektmikroskoper, som vanligvis er utstyrt med standardiserte klemmemekanismer for mikroskopiskred, Petri-retter og brønnplater, bruker nesten alle prøvekammerbaserte LSFMer sylinderbaserte klemmemekanismer. Disse mekanismene er beregnet på skreddersydde prøveholdere som er rotasjonskompatible så vel som ikke-invasive10, men vanligvis ikke designet for mer enn ett eksemplar20,31,32. Et rammeverk for samtidig levende avbildning av to eller flere embryoer, der fordelene ved prøvekammerbaserte oppsett ikke er kompromittert, løser problemet med omgivelsesvariasjon og øker dermed verdien av LSFMer for komparative studier.
I vår protokoll presenterer vi et eksperimentelt rammeverk for komparativ levende avbildning i prøvekammerbaserte LSFMer (figur 1A) der y-aksen brukes som et alternativ for å “stable” embryoer. For det første tilbyr vi en fluorescerende mikrosfærebasert kalibreringsretningslinje for prøvekammerbaserte LSFMer, noe som er spesielt viktig for instrumenter som mangler kalibreringsassistent. For det andre beskriver vi en monteringsmetode for flere embryoer basert på spindelvevholderen28 (figur 1B) som er kompatibel med prøverotasjon og dermed tillater samtidig avbildning av flere prøver langs flere retninger (Figur 1C). Flere embryoer er justert på toppen av en tynn agarosefilm, og etter innsetting i prøvekammeret beveget seg suksessivt gjennom lysarket for å skaffe tredimensjonale bilder. For det tredje tilbyr vi tre eksemplariske live bildedatasett for Drosophila så vel som for Tribolium. For førstnevnte sammenstiller vi transgene linjer med fluorescerende merket kjerner. For sistnevnte sammenligner vi ytelsen til transgene underlinjer som bærer samme transgene, men på forskjellige genomiske steder. Til slutt diskuterer vi viktigheten av parallellisering med hensyn til komparativ levende avbildning og omgivelsesvarians33, debattere gjennomstrømningsgrensen for vårt eksperimentelle rammeverk og evaluere tilpasning av vår tilnærming til andre modellorganismer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Et av de eksklusive bruksområdene til LSFMer er utviklingsbiologi. I denne disiplinen er det viktig å se på levende prøver, ellers kan morfogenetiske prosesser ikke beskrives på en dynamisk måte. Et eksperimentelt rammeverk for samtidig levende bildebehandling i prøvekammerbaserte LSFMer, som beskrevet her, er praktisk av to hovedårsaker.
Omgivelsesvariasjon, som er uunngåelig ved sekvensiell levende avbildning, kan håndteres proaktivt. I insekt embryo-assosiert levende avbildning se…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Ernst H. K. Stelzer for muligheten til å bruke sine ressurser så vel som hans verdifulle kommentarer angående manuskriptet, Anita Anderl for støtte med Tribolium live imaging, Sven Plath for teknisk støtte samt Ilan Davis, Nicole Grieder og Gerold Schubiger for å dele sine transgene Drosophila-linjer via Bloomington Stock Center.
Materials
| 6-well plate | Orange Scientific | 4430500 | |
| 24-well plate | Orange Scientific | 4430300 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 35-mm Ø Petri dish | Fisher Scientific | 153066 | Only for live imaging involving Drosophila. |
| 90-mm Ø Petri dish | Fisher Scientific | L9004575 | |
| 100-µm mesh size cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
| 250-µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-038 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 300-µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-040 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 710-µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-050 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 800-µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-051 | Only for live imaging involving Tribolium |
| 405 fine wheat flour | Demeter e.V. | SP061006 | Only for live imaging involving Tribolium |
| commercially available Drosophila medium | Genesee Scientific | 66-115 | Only for live imaging involving Drosophila / Custom-made Drosophila medium may also be used |
| fluorescent microspheres, 1.0 µm Ø | Thermo Fisher Scientific | T7282 | |
| inactive dry yeast | Genesee Scientific | 62-108 | Only for live imaging involving Tribolium |
| low-melt agarose | Carl Roth | 6351.2 | |
| narrow vials | Genesee Scientific | 32-109 | Only for live imaging involving Drosophila |
| small paint brush | VWR International | 149-2121 | |
| sodium hypochlorite (NaOCl), ~12% active Cl | Carl Roth | 9062.3 | Caution: sodium hypochlorite is corrosive |
| whole wheat flour | Demeter e.V. | SP061036 | Only for live imaging involving Tribolium / United Kingdom: wholemeal flour |
| wide vials | Genesee Scientific | 32-110 | Only for live imaging involving Drosophila |
Referências
- St Croix, C. M., Shand, S. H., Watkins, S. C. Confocal microscopy: comparisons, applications, and problems. Biotechniques. 39 (6), 2-5 (2005).
- Jonkman, J., Brown, C. M. Any way you slice it-A comparison of confocal microscopy techniques. Journal of Biomolecular Techiques. 26 (2), 54-65 (2015).
- Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39, 1700003 (2017).
- Strobl, F., Schmitz, A., Stelzer, E. H. K. Improving your four-dimensional image: traveling through a decade of light-sheet-based fluorescence microscopy research. Nature Protocols. 12, 1103-1109 (2017).
- Weber, M., Huisken, J. Light sheet microscopy for real-time developmental biology. Current Opinion in Genetics and Development. 21, 566-572 (2011).
- Stelzer, E. H. K. Light-sheet fluorescence microscopy for quantitative biology. Nature Methods. 12, 23-26 (2015).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305, 1007-1009 (2004).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, 1065-1069 (2008).
- Strobl, F., Schmitz, A., Stelzer, E. H. K. Live imaging of Tribolium castaneum embryonic development using light-sheet-based fluorescence microscopy. Nature Protocols. 10, 1486-1507 (2015).
- Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nature Methods. 12, 30-34 (2015).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139, 3242-3247 (2012).
- Stegmaier, J., et al. Real-Time Three-dimensional cell segmentation in large-scale microscopy data of developing embryos. Developmental Cell. 36, 225-240 (2016).
- Wan, Y., et al. Single-cell reconstruction of emerging population activity in an entire developing circuit. Cell. 2, 355-372 (2019).
- Chhetri, R. K., et al. Whole-animal functional and developmental imaging with isotropic spatial resolution. Nature Methods. 12, 1171-1178 (2015).
- Royer, L. A., et al. Adaptive light-sheet microscopy for long-term, high-resolution imaging in living organisms. Nature Biotechnology. 34 (12), 1267-1278 (2016).
- Lye, C. M., et al. Mechanical coupling between endoderm invagination and axis extension in Drosophila. PLoS Biology. 13, 1002292 (2015).
- Streichan, S. J., Lefebvre, M. F., Noll, N., Wieschaus, E. F., Shraiman, B. I. Global morphogenetic flow is accurately predicted by the spatial distribution of myosin motors. Elife. 7, 27454 (2018).
- Kaur, P., Saunders, T. E., Tolwinski, N. S. Coupling optogenetics and light-sheet microscopy, a method to study Wnt signaling during embryogenesis. Science Reports. 7 (1), 16636 (2017).
- Richards, S., et al. The genome of the model beetle and pest Tribolium castaneum. Nature. 452, 949-955 (2008).
- Strobl, F., Stelzer, E. H. K. Non-invasive long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos. Development. 141, 2331-2338 (2014).
- El-Sherif, E., Averof, M., Brown, S. J. A segmentation clock operating in blastoderm and germband stages of Tribolium development. Development. 139 (23), 4341-4346 (2012).
- Schmidt-Ott, U., Kwan, C. W. Morphogenetic functions of extraembryonic membranes in insects. Current Opinion in Insect Science. 13, 86-92 (2016).
- Jacobs, C. G. C., Rezende, G. L., Lamers, G. E. M., vander Zee, M. The extraembryonic serosa protects the insect egg against desiccation. Proceedings in Biological Sciences. 280, 20131082 (2013).
- Jacobs, C. G. C., Spaink, H. P., vander Zee, M. The extraembryonic serosa is a frontier epithelium providing the insect egg with a full-range innate immune response. Elife. 3, 04111 (2014).
- Hilbrant, M., Horn, T., Koelzer, S., Panfilio, K. A. The beetle amnion and serosa functionally interact as apposed epithelia. Elife. 5, 13834 (2016).
- Münster, S., et al. Attachment of the blastoderm to the vitelline envelope affects gastrulation of insects. Nature. 568 (7752), 395-399 (2019).
- Jain, A., et al. Regionalized tissue fluidization by an actomyosin cable is required for epithelial gap closure during insect gastrulation. bioRxiv. , 744193 (2019).
- Strobl, F., Klees, S., Stelzer, E. H. K. Light sheet-based fluorescence microscopy of living or fixed and stained Tribolium castaneum embryos. Journal of Visualized Experiments. , e55629 (2017).
- Powsner, L. The effects of temperature on the durations of the developmental stages of Drosophila melanogaster. Physiological Zoology. 8, 474-520 (1935).
- Cheung, D., Ma, J. Probing the impact of temperature on molecular events in a developmental system. Science Reports. 5, 1-12 (2015).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light-sheet fluorescence microscopy (DSLM) of zebrafish and Drosophila embryonic development. Cold Spring Harbor Protocols. 2011, 1235-1243 (2011).
- Royer, L. A., Lemon, W. C., Chhetri, R. K., Keller, P. J. A practical guide to adaptive light-sheet microscopy. Nature Protocols. 13, 2462-2500 (2018).
- Mcdonald, J. H. . Handbook of Biological Statistics, 3rd edition. , (2013).
- Engelbrecht, C. J., Stelzer, E. H. Resolution enhancement in a light-sheet-based microscope (SPIM). Optics Letters. 31, 1477-1479 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
- Strobl, F., Anderl, A., Stelzer, E. H. A universal vector concept for a direct genotyping of transgenic organisms and a systematic creation of homozygous lines. Elife. 7, 31677 (2018).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2, 905-909 (2005).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5, 605-607 (2008).
- vander Zee, M., Berns, N., Roth, S. Distinct functions of the Tribolium zerknüllt genes in serosa specification and dorsal closure. Current Biology. 15, 624-636 (2005).
- Boothe, T., et al. A tunable refractive index matching medium for live imaging cells, tissues and model organisms. Elife. , 27240 (2017).
- Strobl, F., Stelzer, E. H. Long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos: principles, resources, scientific challenges and the comparative approach. Current Opinion in Insect Science. 18, 17-26 (2016).
- Sarrazin, A. F., Peel, A. D., Averof, M. A Segmentation Clock with Two-Segment Periodicity in Insects. Science. 336, 338-341 (2012).
- Macaya, C. C., Saavedra, P. E., Cepeda, R. E., Nuñez, V. A., Sarrazin, A. F. A Tribolium castaneum whole-embryo culture protocol for studying the molecular mechanisms and morphogenetic movements involved in insect development. Development Genes and Evolution. 226, 53-61 (2016).
- He, B., et al. An ancestral apical brain region contributes to the central complex under the control of foxQ2 in the beetle Tribolium. Elife. 8, 49065 (2019).
- Millery, P. B., et al. The song of the old mother: Reproductive senescence in female drosophila. Fly Austin. 8 (3), 127-129 (2014).
- Clarkson, R. M., Moule, A. J., Podlich, H. M. The shelf-life of sodium hypochlorite irrigating solutions. Australian Dental Journal. 46 (4), 269-276 (2001).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. . The Embryonic Development of Drosophila melanogaster, 2nd edition. , (1997).
- Brown, S. J., et al. The red flour beetle, Tribolium castaneum (Coleoptera): A model for studies of development and pest biology. Cold Spring Harbor Protocols. 4, (2009).
- Wu, Y., et al. Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 108 (43), 17708-17713 (2011).
- Kumar, A., et al. Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging. Nature Protocol. 9, 2555 (2014).
- McGorty, R., et al. Open-top selective plane illumination microscope for conventionally mounted specimens. Optics Express. 23, 16142-16153 (2015).
- Ponjavic, A., Ye, Y., Laue, E., Lee, S. F., Klenerman, D. Sensitive light-sheet microscopy in multiwell plates using an AFM cantilever. Biomedical Optics Express. 9 (12), 5863-5880 (2018).
- Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets. Nature Methods. 12, 481-483 (2015).
- Posnien, N., et al. RNAi in the red flour beetle (Tribolium). Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).
- Keller, P. J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2010, (2010).
- Pitrone, P. G., et al. OpenSPIM: an open-access light-sheet microscopy platform. Nature Methods. 10, 598-599 (2013).
- Ferrando-May, E., et al. Advanced light microscopy core facilities: Balancing service, science and career. Microscopy Research and Technique. 79 (6), 463-479 (2016).
- Caroti, F., et al. Decoupling from Yolk sac is required for extraembryonic tissue spreading in the scuttle fly megaselia abdita. Elife. , 34616 (2018).
- Nakamura, T., et al. Imaging of transgenic cricket embryos reveals cell movements consistent with a syncytial patterning mechanism. Current Biology. 20, 1641-1647 (2010).
- Donoughe, S., Kim, C., Extavour, C. G. High-throughput live-imaging of embryos in microwell arrays using a modular specimen mounting system. Biology Open. , (2018).
- Uribe, V., et al. In vivo analysis of cardiomyocyte proliferation during trabeculation. Development. 145 (14), 164194 (2018).
