Işık tabakası bazlı floresan mikroskopisi gelişim biyolojisinde en değerli araçtır. Karşılaştırmalı çalışmalarda önemli bir konu ortam değişkenliğidir. Protokolümüz, birden fazla örneğin eşzamanlı canlı görüntülenmesi için deneysel bir çerçeveyi açıklar ve bu nedenle bu sorunu pro-aktif olarak ele alıp gidermektedir.
Işık tabakası bazlı floresan mikroskopisi, karmaşık süreçleri biyolojik olarak ilgili birden fazla ölçekte incelemek için verimli çözümler sunar. Numunenin üç boyutlu bütünlüğünü korumak için özel olarak tasarlanmış ve genellikle numune rotasyonu özelliğine sahip numune odası bazlı kurulumlar, gelişimsel biyolojide en iyi seçimdir. Örneğin, meyve sineği Drosophila melanogaster ve kırmızı un böceği Tribolium castaneum’untüm embriyonik morfogenezini belgelemek için kullanılmıştır. Bununla birlikte, mevcut birçok canlı görüntüleme protokolü tek embriyolar için sadece deneysel çerçeveler sağlar. Özellikle karşılaştırmalı çalışmalar için, bu tür yaklaşımlar sakıncalıdır, çünkü ardışık olarak görüntülenmiş örnekler ortam varyansı tarafından etkilenir. Ayrıca, bu, belirli bir süre içinde test edilebilen numune sayısını sınırlar. Numune odası tabanlı kurulumlarda verimi artıran ve böylece tüm numuneler için benzer ortam koşulları sağlayan eşzamanlı canlı görüntüleme için deneysel bir çerçeve sunuyoruz. İlk olarak, ışık tabakası floresan mikroskopları için bir kalibrasyon kılavuzu sunuyoruz. İkincisi, birden fazla embriyo için örnek rotasyonu ile uyumlu bir montaj yöntemi öneriyoruz. Üçüncü olarak, drosophilaörnek üç boyutlu canlı görüntüleme veri kümeleri sağlar Floresan etiketli çekirdekleri ile üç transgenik çizgi yan yana, yanı sıra Tribolium, hangi aynı transgene taşıyan üç transgenik alt çizginin performansını karşılaştırırız, ancak farklı genomik konumlarda. Protokolümüz, sıralı canlı görüntülemede her zaman mevcut olan ortam farkını pro-aktif olarak ele aldığı için karşılaştırmalı çalışmalar için özel olarak tasarlanmıştır. Bu, özellikle, örneğin nakavt deneylerinden kaynaklanan anormal fenotiplerin nicel analizleri ve karakterizasyonu için önemlidir. Ayrıca, ışık tabakası floresan mikroskoplarına erişim sınırlı olduğunda son derece uygun olan genel verimi arttırır. Son olarak, önerilen montaj yöntemi, temel olarak optimizasyon çabası olmadan diğer böcek türleri ve zebra balığı gibi diğer model organizmalar için uyarlanabilir.
Floresan mikroskopi, yaşam bilimlerinde, özellikle hücre ve gelişim biyolojisinde en temel görüntüleme tekniklerinden biridir. 1990’larınortalarından beri üç boyutlu floresan görüntüleme için son teknoloji ürünü olan konfokal floresan mikroskoplar 1’de, florofor ekscitasyonu ve emisyon ışığı algılama için aynı lens kullanılır. Aydınlatma lazer ışını, aydınlatma/algılama ekseni boyunca tüm floroforları heyecanlandırır ve ilgili odak dışı sinyal bir iğne deliği tarafından algılanmadan önce ayırt edilir. Bu nedenle, her iki boyutlu görüntü için, tüm örnek aydınlatılır. Sonuç olarak, her üç boyutlu görüntü için, yani, mekansal olarak ardışık iki boyutlu görüntüler yığını, tüm örnek birkaç düzine ila birkaç yüz kez aydınlatılır2, bu da fotobleaching ve fototoksikliği teşvik eder3.
Neredeyse yirmi yıl önce, ışık tabakası tabanlı teknoloji4, üç boyutlu floresan görüntüleme için umut verici bir alternatif olarak ortaya çıktı ve böylece gelişim biyolojisinde değerli bir araç haline geldi5. Bu yaklaşımda aydınlatma ve algılama ayrılmıştır. Aydınlatma lensi, dik olarak düzenlenmiş algılama lensinin odak düzleminde sadece birkaç mikrometre derinliğe sahip bir ışık tabakası oluşturmak için kullanılır. Bu nedenle, her iki boyutlu görüntü için, odak düzleminin etrafında yalnızca ince bir düzlemsel hacim yanar. Sonuç olarak, her üç boyutlu görüntü için, tüm örnek sadece bir kez aydınlatılır, bu da fotobleaching ve fototoksikliği kuvvetle azaltır6. Bu nedenle, ışık tabakası floresan mikroskopları (LSFM’ler) karmaşık süreçleri biyolojik olarak ilgili birden fazla ölçekte incelemek için etkili çözümler sunar ve bu nedenle, birkaç milimetre kadar büyük örneklerin hücre altı düzeyde analiz edilmesi gereken gelişim biyolojisinde özel bir değere sahiptir.
Tarihsel olarak, LSFM’ler örnek oda bazlıolmuştur 7,8. Bu kurulumlarda, aydınlatma (x) ve algılama (z) eksenleri genellikle yerçekimi eksenine (y) dik olarak düzenlenir. Örnek odalar geniş deneysel özgürlük sunar. İlk olarak, çevreyi kontrol etmek için, örneğin belirli bir sıcaklık9’u korumak veya biyokimyasal stresörler uygulamak için bir perfüzyon sisteminin kullanımını kolaylaştıran büyük görüntüleme tampon kapasiteleri sağlarlar. Ayrıca, numunenin üç boyutlu, bazı durumlarda dinamik11 , bütünlüğünü korurken ilgili deneysel ihtiyaçlara göre uyarlanmış özelleştirilmiş montaj yöntemleri10’udesteklerler. Ek olarak, numune odası tabanlı kurulumlar genellikle numuneleri y ekseni etrafında döndürmek ve böylece iki, dört veya daha fazla yön boyunca görüntülemek için kullanılan bir döndürme işlevi ile donatılmıştır. Yaygın olarak kullanılan model organizmaların embriyoları mikroskopi bağlamında, ventral-dorsal, lateral ve/veya ön-arka vücut eksenleri boyunca nispeten büyük, ardışık görüntüleme daha kapsamlı bir temsil sağlar. Bu, örneğin, karmaşık üç boyutlu geçiş yolları12,13boyunca hareket eden hücrelerin uzun süreliizlenmesinisağlar.
Işık tabakası bazlı floresan mikroskopi, Drosophila melanogasterembriyonik morfogenezini incelemek için hem sistematik olarak14,15 hem de gelişimin biyofizik yönlerine özel bir odakla kapsamlı bir şekilde uygulanmıştır. Örneğin, mikrop bandı uzaması16 ve daha fazla sırasında endoderm invaginasyonu ile eksen uzantısı arasında biyomekanik bir bağlantı tespit etmek için yüksek çözünürlüklü morfogenetik verileri toplamak için kullanıldı, karmaşık hücresel akışı gastrülasyon sırasında kuvvet oluşturma desenleri ile ilişkilendirmek için17. Ayrıca, epidermis18’dekiön-arka desenleme sırasında Wnt sinyalinin düzenlenmesini araştırmak için optogenetik gibi diğer son teknoloji tekniklerle birleştirilmiştir.
Bununla birlikte, sadece bir türü incelemek, gelişimin evrimi hakkında fikir vermez. Filogenetik bağlamda embriyogenez anlamak için alternatif böcek modeli organizmalarla yoğun araştırmalar yapılmıştır. En kapsamlı olarak araştırılan türlerden biri kırmızı un böceği Tribolium castaneum, ekonomik olarak ilgili bir depolanmış tahıl zararlısı19Embriyonik morfogenez de LSFM20ile sistematik olarak görüntülenmiştir. Bu iki türün embriyonik morfogenezleri, segmentasyon modu21gibi çeşitli yönlerden ve ekstra embriyonik membranların oluşumu ve bozulması22. İkinci yön zaten LSFM’ler kullanılarak kapsamlı bir şekilde analiz edilmiştir. Örneğin, Tribolium embriyosunu embriyogenezinin daha iyi kısmı için çeşitli tehlikelerden koruyan ekstra embriyonik bir doku olan serosanın23,24, ayrıca dorsal kapatma sırasında kendi çekilme işlemi için morfogenetik “sürücü” görevi aldığı gösterilmiştir25. Ayrıca, gastrülasyon sırasında, blastoderm’in belirli bir bölgesinin asimetrik doku hareketleri oluşturmak için vitellin zarı bağlı kaldığı gösterilmiştir26 ve bu gözlemin ardından, bölgeselleştirilmiş doku akışkanlaştırması, hücrelerin serosa pencere kapanması sırasında sırayla serosa kenarından ayrılmasına izin verir27.
Yukarıda belirtilen tüm Drosophila– ve Triboliumile ilişkili çalışmalarda, örnek oda bazlı LSFM’ler kullanılmıştır. Çoğu zaman, embriyolar örnek dönüş fonksiyonu kullanılarak birden fazla yönde kaydedildi. Açıkça belirtilmemiş olsa da, Tribolium20,28‘deki önceki çalışmalarımıza benzer şekilde, sıralı canlı görüntüleme testlerinde tek tek ve böylece birbirlerinden bağımsız olarak kaydedildikleri varsayılabilir. Bazı senaryolarda, böyle bir yaklaşım kabul edilebilir, ancak özellikle nicel karşılaştırmalı yaklaşımlarda ortam varyansı sonuçları bozabilir. Örneğin, böceklerin gelişim hızının sıcaklığa bağlı olduğu uzun zamandır bilinmektedir29, ancak daha yeni bir çalışma drosophila‘da sıcaklığın morfojenlerin konsantrasyonu30‘ u da etkileyebileceğini göstermektedir. Sonuç olarak, embriyogenezin belirli özellikleri, örneğin hücrelerin dinamik oranları, bölünme oranları ve göç hızları tam olarak ölçülmelidir, ortam varyansı olmadan yeterli tekrarlar gereklidir. Bu, standart sapmaları ve standart hataları en aza indirir, bu da diğer, hatta marjinal olarak farklı deneysel koşullarla yan yana gelmeyi kolaylaştırır.
Ancak, örnek oda tabanlı LSFM’ler öncelikle yüksek aktarım hızı tahlilleri yerine yüksek içerik için tasarlanmıştır. Tipik olarak mikroskopi slaytları, Petri kapları ve kuyu plakaları için standart kelepçe mekanizmaları ile donatılmış konfokal mikroskopların aksine, neredeyse tüm numune odası tabanlı LSFM’ler silindir bazlı kelepçe mekanizmaları kullanır. Bu mekanizmalar, rotasyon uyumlu ve invaziv olmayan10olan özel yapım numune tutucular için tasarlanmıştır, ancak genellikle birden fazla örnek20,31,32için tasarlanmamıştır. Örnek oda bazlı kurulumların avantajlarından ödün verilmeyen iki veya daha fazla embriyonun eşzamanlı canlı görüntülenmesi için bir çerçeve, ortam farkı sorununu ele alarak karşılaştırmalı çalışmalar için LSFM’lerin değerini artırır.
Protokolümüzde, embriyoları “istiflemek” için bir seçenek olarak y ekseninin kullanıldığı örnek oda bazlı LSFM’lerde (Şekil 1A)karşılaştırmalı canlı görüntüleme için deneysel bir çerçeve sunuyoruz. İlk olarak, özellikle kalibrasyon asistanı olmayan cihazlar için önemli olan numune odası tabanlı LSFM’ler için floresan mikrokürez bazlı kalibrasyon kılavuzu sunuyoruz. İkinci olarak, örümcek ağı tutucusu28 ‘e (Şekil 1B) dayanan ve numune rotasyonu ile uyumlu olan ve böylece birden fazla numunenin birden fazla yönde eşzamanlı görüntülenmesine izin veren birden fazla embriyo için bir montaj yöntemi açıklıyoruz (Şekil 1C). Birkaç embriyo ince bir agarose filminin üzerine hizalanır ve örnek odaya yerleştirildikten sonra, üç boyutlu görüntüler elde etmek için ışık tabakasında art arda hareket eder. Üçüncü olarak, Drosophila ve Triboliumiçin üç örnek canlı görüntüleme veri kümesi sunuyoruz. İlki için, transgenik çizgileri floresan etiketli çekirdeklerle yan yana alıyoruz. İkincisi için, aynı transgeneyi taşıyan transgene, ancak farklı genomik konumlarda transgene alt çizgilerinin performansını karşılaştırıyoruz. Son olarak, karşılaştırmalı canlı görüntüleme ve ortam varyansı ile paralelleşmenin önemini tartışıyoruz33Deneysel çerçevemizin aktarım hızı sınırını tartışıyor ve yaklaşımımızın diğer model organizmalara adaptasyonunu değerlendiriyoruz.
LSFM’lerin münhasır uygulama alanlarından biri gelişimsel biyolojidir. Bu disiplinde, canlı örneklere bakmak önemlidir, aksi takdirde morfogenetik süreçler dinamik bir şekilde tarif edilemez. Örnek oda bazlı LSFM’lerde eşzamanlı canlı görüntüleme için deneysel bir çerçeve, burada açıklandığı gibi, iki ana nedenden dolayı uygundur.
Sıralı canlı görüntülemede kaçınılmaz olan ortam varyansı pro-aktif olarak ele alınabiliyor. Böcek embriyosu ile ilişkili can…
The authors have nothing to disclose.
Ernst H. K. Stelzer’e, kaynaklarını kullanma fırsatının yanı sıra el yazması ile ilgili değerli yorumları için, Tribolium canlı görüntüleme desteği için Anita Anderl’e, teknik destek için Sven Plath’a ve Bloomington Stock Center aracılığıyla transgenik Drosophila hatlarını paylaştıkları için Ilan Davis, Nicole Grieder ve Gerold Schubiger’e teşekkür ederiz.
6-well plate | Orange Scientific | 4430500 | |
24-well plate | Orange Scientific | 4430300 | Only for live imaging involving Tribolium |
35-mm Ø Petri dish | Fisher Scientific | 153066 | Only for live imaging involving Drosophila. |
90-mm Ø Petri dish | Fisher Scientific | L9004575 | |
100-µm mesh size cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
250-µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-038 | Only for live imaging involving Tribolium |
300-µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-040 | Only for live imaging involving Tribolium |
710-µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-050 | Only for live imaging involving Tribolium |
800-µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-051 | Only for live imaging involving Tribolium |
405 fine wheat flour | Demeter e.V. | SP061006 | Only for live imaging involving Tribolium |
commercially available Drosophila medium | Genesee Scientific | 66-115 | Only for live imaging involving Drosophila / Custom-made Drosophila medium may also be used |
fluorescent microspheres, 1.0 µm Ø | Thermo Fisher Scientific | T7282 | |
inactive dry yeast | Genesee Scientific | 62-108 | Only for live imaging involving Tribolium |
low-melt agarose | Carl Roth | 6351.2 | |
narrow vials | Genesee Scientific | 32-109 | Only for live imaging involving Drosophila |
small paint brush | VWR International | 149-2121 | |
sodium hypochlorite (NaOCl), ~12% active Cl | Carl Roth | 9062.3 | Caution: sodium hypochlorite is corrosive |
whole wheat flour | Demeter e.V. | SP061036 | Only for live imaging involving Tribolium / United Kingdom: wholemeal flour |
wide vials | Genesee Scientific | 32-110 | Only for live imaging involving Drosophila |