المجهر الفلوري القائم على الورقة الخفيفة هو الأداة الأكثر قيمة في علم الأحياء التنموي. ومن القضايا الرئيسية في الدراسات المقارنة التباين المحيط. يصف بروتوكولنا إطارا تجريبيا للتصوير الحي المتزامن لعينات متعددة ، وبالتالي ، يعالج هذه المشكلة بشكل نشط.
يوفر المجهر الفلوري القائم على الورق الخفيف حلولا فعالة لدراسة العمليات المعقدة على نطاقات متعددة ذات صلة بيولوجيا. نماذج الأجهزة القائمة على غرفة، والتي تم تصميمها خصيصا للحفاظ على سلامة ثلاثية الأبعاد للعينة وعادة ما ميزة دوران العينة، هي الخيار الأفضل في علم الأحياء التنموية. على سبيل المثال ، تم استخدامها لتوثيق التكوين الجنيني الكامل لذبابة الفاكهة Drosophila melanogaster وخنفساء الدقيق الأحمر Tribolium castaneum. ومع ذلك، فإن العديد من بروتوكولات التصوير الحي المتاحة توفر أطرا تجريبية فقط للأجنة المفردة. خاصة بالنسبة للدراسات المقارنة ، فإن مثل هذه النهج غير مريحة ، لأن العينات المصورة بالتتابع تتأثر بالتباين المحيط. علاوة على ذلك ، يحد هذا من عدد العينات التي يمكن فحصها في غضون وقت معين. نحن نقدم إطارا تجريبيا للتصوير الحي المتزامن الذي يزيد من الإنتاجية في الأجهزة القائمة على غرفة العينة وبالتالي يضمن ظروفا محيطة مماثلة لجميع العينات. أولا، نحن نقدم إرشادات المعايرة للمجاهر الفلورية ذات الورقة الخفيفة. ثانيا، نقترح طريقة تركيب للأجنة المتعددة التي تتوافق مع دوران العينة. ثالثا، نحن نقدم نموذجية ثلاثية الأبعاد مجموعات بيانات التصوير الحي من Drosophila، والتي نحن الجمع بين ثلاثة خطوط المعدلة وراثيا مع نواة المسمى fluorescently، وكذلك من Tribolium، والتي نقارن أداء ثلاثة خطوط فرعية المعدلة وراثيا التي تحمل نفس الجين، ولكن في مواقع الجينوم المختلفة. تم تصميم بروتوكولنا خصيصا للدراسات المقارنة لأنه يعالج بشكل نشط التباين المحيط ، والذي يكون موجودا دائما في التصوير الحي التسلسلي. وهذا مهم بشكل خاص للتحليلات الكمية وتوصيف الأنماط الظاهرية الشاذة، والتي تنتج على سبيل المثال، عن تجارب خروج المغلوب. علاوة على ذلك ، فإنه يزيد من الإنتاجية الإجمالية ، والتي هي مريحة للغاية عندما يكون الوصول إلى مجاهر مضان الصفائح الخفيفة محدودا. وأخيرا، يمكن تكييف طريقة التركيب المقترحة لأنواع الحشرات الأخرى والكائنات الحية النموذجية الأخرى، مثل سمك الحمار الوحشي، مع عدم بذل أي جهد للتحسين.
يعد الفحص المجهري الفلوري أحد أهم تقنيات التصوير في علوم الحياة، وخاصة في بيولوجيا الخلايا والتطور. في المجاهر الفلورية confocal1، والتي هي دولة من بين الفن للتصوير الفلوري ثلاثي الأبعاد منذ منتصف 1990s ، وتستخدم نفس العدسة لإثارة الفلوروفور والكشف عن ضوء الانبعاثات. شعاع ليزر الإضاءة يثير جميع الفلوروفور على طول محور الإضاءة / الكشف ويتم التمييز بين إشارة خارج التركيز المعنية قبل الكشف عن طريق ثقب. وبالتالي ، لكل صورة ثنائية الأبعاد ، يتم إضاءة العينة بأكملها. وبالتالي ، لكل صورة ثلاثية الأبعاد ، أي كومة من الصور ثنائية الأبعاد المتتالية مكانيا ، يتم إضاءة العينة بأكملها عدة عشرات إلى بضع مئات من المرات2، مما يعزز photobleaching والسمية الضوئية3.
منذ ما يقرب من عشرين عاما ، ظهرت التكنولوجيا المستندة إلى ورقة الضوء4 كبديل واعد للتصوير الفلوري ثلاثي الأبعاد ، وبالتالي أصبحت أداة قيمة في علم الأحياء التنموي5. وفي هذا النهج، يتم فصل الإضاءة والكشف. تستخدم عدسة الإضاءة لتوليد ورقة ضوئية بعمق لا يتجاوز بضعة ميكرومترات داخل المستوى البؤري لعدسة الكشف المرتبة عموديا. وبالتالي ، لكل صورة ثنائية الأبعاد ، يتم إضاءة حجم مستو رفيع فقط حول المستوى البؤري. وبالتالي ، لكل صورة ثلاثية الأبعاد ، يتم إضاءة العينة بأكملها مرة واحدة فقط ، مما يقلل بقوة من الbleaching الضوئي والسمية الضوئية6. ولهذا السبب، توفر المجاهر الفلورية ذات الصفائح الخفيفة حلولا فعالة لدراسة العمليات المعقدة على نطاقات متعددة ذات صلة بيولوجيا، وبالتالي فهي ذات قيمة خاصة في البيولوجيا التنموية، حيث يجب تحليل عينات كبيرة مثل عدة ملليمترات على المستوى دون الخلوي.
تاريخيا، وقد LSFMs عينة على أساس غرفة7،8. في هذه الاجهزة، عادة ما يتم ترتيب الإضاءة (س) والكشف (ض) محاور عموديا على محور الجاذبية (ص). غرف العينة توفر حرية تجريبية وافرة. أولا، أنها توفر قدرات التخزين المؤقت التصوير كبيرة، والتي بدورها يخفف من استخدام نظام التشوه للسيطرة على البيئة، على سبيل المثال، للحفاظ على درجة حرارة محددة9 أو لتطبيق الضغوطات الكيميائية الحيوية. علاوة على ذلك ، فإنها تدعم أساليب التركيب المخصصة10 المصممة لتلبية الاحتياجات التجريبية ذات الصلة مع الحفاظ على الأبعاد الثلاثة ، في بعض الحالاتالديناميكية 11، سلامة العينة. بالإضافة إلى ذلك، عادة ما تكون مجهزة نماذج غرفة القائم على وظيفة دوران التي تستخدم لتدور العينات حول محور ص وبالتالي صورة لهم على طول اثنين، أربعة أو أكثر من الاتجاهات. وبما أن أجنة الكائنات النموذجية الشائعة الاستخدام هي، في سياق المجهر، فإن التصوير الكبير نسبيا والمتعاقب على طول محاور الجسم البطنية الظهرية والجانبية و/أو الأمامية الخلفية يوفر تمثيلا أكثر شمولا. وهذا يسمح على سبيل المثال، تتبع طويل الأجل للخلايا التي تتحرك على طول مسارات الهجرة ثلاثية الأبعاد المعقدة12،13.
وقد تم تطبيق المجهر المضان على أساس ورقة الضوء على نطاق واسع لدراسة التكوين المورفوجيني الجنيني من الميلانوغاستر Drosophila، وكلاهما بشكل منهجي14،15 وكذلك مع التركيز بشكل خاص على الجوانب الفيزيائية الحيوية للتنمية. على سبيل المثال، تم استخدامه لجمع بيانات مورفوجينية عالية الدقة من أجل الكشف عن وجود صلة ميكانيكية حيوية بين إندورفينيشن إندوديرم وتمديد المحور أثناء استطالة الفرقة الجرثومية16 وبالإضافة إلى ذلك لربط التدفق الخلوي المعقد بأنماط توليد القوة أثناء التجويف17. كما تم دمجها مع تقنيات أخرى حديثة ، على سبيل المثال ، optogenetics للتحقيق في تنظيم إشارات WNT أثناء النقش الأمامي الخلفي في البشرة18.
ومع ذلك، فإن دراسة نوع واحد فقط لا يوفر رؤى حول تطور التنمية. لفهم تكوين الأجنة في السياق النباتي ، تم إجراء أبحاث مكثفة مع كائنات نموذج الحشرات البديلة. واحدة من الأنواع الأكثر شمولا التحقيق هو خنفساء الدقيق الأحمر Tribolium كاستانيوم، وهي آفة الحبوب المخزنة ذات الصلة اقتصاديا19، والتي تم أيضا تصويرها بشكل منهجي مع تكوين المورفوجين الجنيني مع LSFM20. يختلف التكوين الجنيني لهذين النوعين بشكل ملحوظ في عدة جوانب ، على سبيل المثال ، وضع التقسيم21، وكذلك تكوين وتدهور الأغشية الجنينية22. وقد تم بالفعل تحليل هذا الجانب الأخير على نطاق واسع باستخدام LSFMs. على سبيل المثال، فقد ثبت أن سيروسا، وهو نسيج خارج الجنين الذي يغلف ويحمي جنين تريبوليوم من المخاطر المختلفة للجزء الأفضل من تكوين الجنين23،24، يعمل أيضا ك “سائق” مورفوجيني لعملية الانسحاب الخاصة به أثناء الإغلاق الظهري25. علاوة على ذلك ، فقد ثبت أنه خلال gastrulation ، لا تزال منطقة معينة من blastoderm راسية في الغشاء الهوتيلي من أجل إنشاء حركات الأنسجة غير المتماثلة26 ، وبعد هذه الملاحظة ، أن سيولة الأنسجة الإقليمية تسمح للخلايا بمغادرة حافة سيروسا بشكل متسلسل أثناء إغلاق نافذة serosa27.
في جميع Drosophila– والدراسات المرتبطة Triboliumالمذكورة أعلاه، وقد استخدمت عينات LSFMs القائمة على غرفة. في معظم, وسجلت الأجنة على طول اتجاهات متعددة باستخدام وظيفة دوران العينة. على الرغم من أن لم يذكر صراحة, يمكن افتراض أن تم تسجيلها بشكل فردي، وبالتالي مستقلة عن بعضها البعض في مقايسات التصوير الحية متتابعة, مماثلة لعملنا السابق على Tribolium20,28. وفي بعض السيناريوهات، يكون هذا النهج مقبولا، ولكن على وجه الخصوص في النهج المقارنة الكمية، يمكن أن يشوه التباين المحيط النتائج. على سبيل المثال ، كان من المعروف منذ فترة طويلة أن سرعة نمو الحشرات تعتمد على درجة الحرارة29، ولكن دراسة أحدث تشير إلى أنه في Drosophila، قد تؤثر درجة الحرارة أيضا على تركيز المورفوجينات30. وبالتالي، إذا كان ينبغي تحديد خصائص معينة لنشأة الجنين، مثل النسب الدينامية ومعدلات التقسيم وسرعات الهجرة للخلايا، على وجه التحديد، يلزم تكرار كاف دون تباين محيط. وهذا يقلل من الانحرافات المعيارية والأخطاء المعيارية، والتي بدورها تسهل التجاور مع غيرها، حتى مجرد ظروف تجريبية متباينة هامشيا.
ومع ذلك، تم تصميم نموذج LSFMs المستندة إلى غرفة أساسا لمحتوى عالي بدلا من المقايسات الإنتاجية العالية. على عكس المجاهر confocal ، والتي عادة ما تكون مجهزة بآليات المشبك الموحدة لشرائح المجهر ، وأطباق بيتري ولوحات الآبار ، تستخدم جميع أجهزة LSFMs القائمة على غرفة العينة تقريبا آليات المشبك المستندة إلى الأسطوانات. وتهدف هذه الآليات لأصحاب العينة حسب الطلب التي هي التناوب متوافقة وكذلك غير الغازية10، ولكن عادة لا صمم لأكثر من عينة واحدة20،31،32. ويتناول إطار التصوير الحي المتزامن لأجنة أو أكثر، حيث لا تتعرض مزايا الأجهزة القائمة على غرفة العينة للخطر، مسألة التباين المحيط وبالتالي زيادة قيمة LSFMs للدراسات المقارنة.
في بروتوكولنا، نقدم إطارا تجريبيا للتصوير الحي المقارن في عينات LSFMs القائمة على غرفة(الشكل 1A)حيث يتم استخدام محور ص كخيار ل “كومة” الأجنة. أولا، نحن نقدم مبادئ توجيهية للمعايرة الفلورية القائمة على الميكروسفيرات لآليات LSFMs القائمة على غرفة العينة، وهو أمر مهم بشكل خاص للأجهزة التي تفتقر إلى مساعد المعايرة. ثانيا، نحن نصف طريقة تركيب للأجنة متعددة على أساس حامل خيوط العنكبوت28 (الشكل 1B)التي تتوافق مع دوران العينة، وبالتالي يسمح التصوير المتزامن لعينات متعددة على طول اتجاهات متعددة(الشكل 1C). يتم محاذاة العديد من الأجنة فوق فيلم أغاروز رقيقة، وبعد إدراجها في غرفة العينة، انتقلت تباعا من خلال ورقة الضوء للحصول على صور ثلاثية الأبعاد. ثالثا، نحن نقدم ثلاث مجموعات بيانات تصوير حي مثالية ل Drosophila وكذلك لتريبوليوم. بالنسبة للأول ، فإننا نخلط بين الخطوط المعدلة وراثيا مع نواة تحمل علامة fluorescently. وبالنسبة لهذا الأخير، فإننا نقارن أداء الخطوط الفرعية المعدلة وراثيا التي تحمل نفس المتحولين جنسيا، ولكن في مواقع الجينوم المختلفة. وأخيرا، نناقش أهمية التوازي فيما يتعلق بالتصوير الحي المقارن والتباين المحيط33،ونناقش الحد الإنتاجي لإطارنا التجريبي ونقيم تكييف نهجنا مع الكائنات الحية النموذجية الأخرى.
واحدة من مجالات التطبيق الحصري ل LSFMs هو علم الأحياء التنموي. في هذا التخصص ، من المهم النظر إلى العينات الحية ، وإلا لا يمكن وصف العمليات المورفوجينية بطريقة ديناميكية. إطار تجريبي للتصوير الحي المتزامن في عينات LSFMs المستندة إلى غرفة ، كما هو موضح هنا ، مناسب لسببين رئيسيين.
?…
The authors have nothing to disclose.
نشكر إرنست ه. ك. ستيلزر على الفرصة المتاحة له لاستخدام موارده وكذلك تعليقاته القيمة فيما يتعلق بالمخطوطة، وأنيتا أندرل لدعمها التصوير الحي لتريبونيوم، وسفين بلاث للحصول على الدعم الفني، وكذلك إيلان ديفيس ونيكول غريغدر وجيرولد شوبيغر لتقاسم خطوط دروسوفيلا المعدلة وراثيا عبر مركز بلومينغتون للأسهم.
6-well plate | Orange Scientific | 4430500 | |
24-well plate | Orange Scientific | 4430300 | Only for live imaging involving Tribolium |
35-mm Ø Petri dish | Fisher Scientific | 153066 | Only for live imaging involving Drosophila. |
90-mm Ø Petri dish | Fisher Scientific | L9004575 | |
100-µm mesh size cell strainer | BD Biosciences | 352360 | |
250-µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-038 | Only for live imaging involving Tribolium |
300-µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-040 | Only for live imaging involving Tribolium |
710-µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-050 | Only for live imaging involving Tribolium |
800-µm mesh size sieve | VWR International | 200.025.222-051 | Only for live imaging involving Tribolium |
405 fine wheat flour | Demeter e.V. | SP061006 | Only for live imaging involving Tribolium |
commercially available Drosophila medium | Genesee Scientific | 66-115 | Only for live imaging involving Drosophila / Custom-made Drosophila medium may also be used |
fluorescent microspheres, 1.0 µm Ø | Thermo Fisher Scientific | T7282 | |
inactive dry yeast | Genesee Scientific | 62-108 | Only for live imaging involving Tribolium |
low-melt agarose | Carl Roth | 6351.2 | |
narrow vials | Genesee Scientific | 32-109 | Only for live imaging involving Drosophila |
small paint brush | VWR International | 149-2121 | |
sodium hypochlorite (NaOCl), ~12% active Cl | Carl Roth | 9062.3 | Caution: sodium hypochlorite is corrosive |
whole wheat flour | Demeter e.V. | SP061036 | Only for live imaging involving Tribolium / United Kingdom: wholemeal flour |
wide vials | Genesee Scientific | 32-110 | Only for live imaging involving Drosophila |