Isolamento, Proliferação e Diferenciação de Células-Tronco Derivadas de Adiposos de Macacos Rhesus
Summary
Neste artigo, descrevemos o isolamento de células-tronco derivadas de tecido adiposo (ADSCs) derivadas de macacos rhesus usando um protocolo de digestão de tecido enzimático. Em seguida, descrevemos a proliferação de ADSC, que inclui descolamento, contagem e chapeamento celular. Por fim, a diferenciação do ADSC é descrita usando agentes indutores adipogênicos específicos. Além disso, descrevemos técnicas de coloração para confirmar a diferenciação.
Abstract
O tecido adiposo fornece uma fonte rica e acessível de células-tronco multipotentes, que são capazes de se auto-renovar. Essas células-tronco derivadas de tecido adiposo (ADSCs) fornecem um sistema celular ex vivo consistente que é funcionalmente semelhante ao dos adipócitos in vivo. O uso de ADSCs em pesquisas biomédicas permite a investigação celular da regulação e função metabólica do tecido adiposo. A diferenciação ADSC é necessária para a expansão adequada dos adipócitos, e a diferenciação subótima é um dos principais mecanismos da disfunção adiposa. Compreender as mudanças na diferenciação da ADSC é crucial para entender o desenvolvimento de disfunção metabólica e doença. Os protocolos descritos neste manuscrito, quando seguidos, produzirão adipócitos maduros que podem ser usados para vários testes funcionais in vitro para avaliar a função metabólica da ADSC, incluindo, entre outros, ensaios que medem a captação de glicose, lipólise, lipogênese e secreção. Os macacos Rhesus (Macaca mulatta) são fisiologicamente, anatomicamente e evolutivamente semelhantes aos seres humanos e, como tal, seus tecidos e células têm sido amplamente utilizados em pesquisas biomédicas e para o desenvolvimento de tratamentos. Aqui, descrevemos o isolamento do ADSC usando tecido adiposo subcutâneo e omental fresco obtido de macacos rhesus de 4 a 9 anos de idade. Amostras de tecido adiposo são digeridas enzimaticamente em colagenase seguidas de filtração e centrifugação para isolar ADSCs da fração vascular estromal. ADSCs isolados são proliferados em meio estromal seguidos por aproximadamente 14-21 dias de diferenciação usando um coquetel de 0,5 μg/mL de dexametasona, 0,5 mM de isobutilmetilxantina e 50 μM de indometacina em meio estromal. Os adipócitos maduros são observados em aproximadamente 14 dias de diferenciação. Neste manuscrito, descrevemos protocolos para isolamento, proliferação e diferenciação de ADSC in vitro. Embora tenhamos nos concentrado em ADSCs do tecido adiposo de macacos rhesus, esses protocolos podem ser utilizados para tecido adiposo obtido de outros animais com ajustes mínimos.
Introduction
O tecido adiposo é composto por uma mistura heterogênea de células, adipócitos predominantemente maduros e uma fração vascular estromal, incluindo fibroblastos, células imunes e células-tronco derivadas de tecido adiposo (ADSCs)1,2,3. As ADSCs primárias podem ser isoladas diretamente do tecido adiposo branco e estimuladas a se diferenciar em adipócitos, cartilagens ou células ósseas4. Os ADSCs exibem características clássicas de células-tronco, como manutenção da multipotência in vitro e auto-renovação; e são aderentes ao plástico na cultura 5,6. Os ADSCs são de importante interesse para o uso em medicina regenerativa devido à sua multipotência e capacidade de serem facilmente colhidos em grandes quantidades utilizando técnicas não invasivas7. A diferenciação adipogênica de ADSCs produz células que imitam funcionalmente adipócitos maduros, incluindo acúmulo de lipídios, captação de glicose estimulada por insulina, lipólise e secreção de adipocinas8. Sua semelhança com adipócitos maduros levou ao uso generalizado de ADSCs para investigação fisiológica das características celulares e função metabólica dos adipócitos. Há evidências crescentes que apoiam a ideia de que o desenvolvimento de disfunção metabólica e distúrbios se origina no nível celular ou tecidual 9,10,11,12. A diferenciação ideal do ADSC é necessária para expansão suficiente do tecido adiposo, função adequada dos adipócitos e regulação metabólica efetiva13.
Os protocolos descritos neste manuscrito são técnicas simples que utilizam equipamentos de laboratório padrão e reagentes básicos. O manuscrito descreve primeiramente o protocolo para o isolamento de ADSCs primários do tecido adiposo fresco usando digestão mecânica e enzimática. A seguir, descreve-se o protocolo de proliferação e passagem de ADSCs em meio estromal. Por fim, descreve-se o protocolo de diferenciação adipogênica de ADSCs. Após a diferenciação, essas células podem ser usadas para estudos para entender melhor o metabolismo dos adipócitos e os mecanismos de disfunção. Os protocolos para confirmação da diferenciação adipogênica e detecção de gotículas lipídicas utilizando coloração Oil Red O e boro-dipirrometeno (BODIPY) também são descritos. Os detalhes desses protocolos se concentraram em ADSCs primários isolados do tecido adiposo omental fresco de macacos rhesus. Nós e outros temos utilizado esse protocolo para isolar com sucesso os ADSCs dos depósitos de tecido adiposo subcutâneo e omental de macacos rhesus14,15. Para a mesma quantidade de tecido utilizado, observamos que o tecido adiposo subcutâneo é mais denso, mais resistente e produz menos células da digestão em comparação com o tecido adiposo omental. Esse protocolo também tem sido utilizado para isolar ADSCs de amostras adiposas humanas16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os protocolos de isolamento, proliferação e diferenciação do ADSC são simples e reprodutíveis, mas exigem técnica cuidadosa para garantir isolamento adequado, expansão saudável e diferenciação eficiente. Um ambiente de trabalho estéril é fundamental para todos os experimentos de cultura de células. Bactérias ou fungos podem ser introduzidos em culturas de células através de ferramentas, meios ou ambientes de trabalho contaminados. A contaminação fúngica é indicada pelo crescimento de esporos na cultu…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer a Curtis Vande Stouwe por sua assistência técnica. A pesquisa subjacente ao desenvolvimento dos protocolos foi apoiada por doações do Instituto Nacional de Abuso de Álcool e Alcoolismo (5P60AA009803-25, 5T32AA007577-20 e 1F31AA028459-01).
Materials
| 0.4 % trypan blue | Thermo-Fisher | 15250061 | |
| 1.5-ml microcentrifuge tube | Dot Scientific | 707-FTG | |
| 100 % isopropanol | Sigma-Aldrich | PX1838-P | |
| 100-mm cell culture dish | Corning | 430167 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | |
| 50-mL plastic conical tube | Fisher Scientific | 50-465-232 | |
| 70-µm cell strainer | Corning | CLS431751 | |
| a-MEM | Thermo-Fisher | 12561056 | |
| Aluminum foil | Reynolds Wrap | ||
| BODIPY | Thermo-Fisher | D3922 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 05470 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Collagenase, Type I | Thermo-Fisher | 17100017 | |
| Dexamethasone-Water Soluble | Sigma-Aldrich | D2915 | |
| Dimethyl sulfoxide, DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Distilled water | Thermo-Fisher | 15230162 | |
| Fetal Bovine Serum, USDA-approved | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| Fungizone/Amphotericin B (250 ug/mL) | Thermo-Fisher | 15290018 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo-Fisher | 14175095 | |
| Hemacytometer with cover slip | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | |
| Inverted light microscope | Nikon | DIAPHOT-TMD | |
| L-glutamine (200 mM) | Thermo-Fisher | 25030081 | |
| Laboratory rocker, 0.5 to 1.0 Hz | Reliable Scientific | Model 55 Rocking | |
| Neutral buffered formalin (10 %) | Pharmco | 8BUFF-FORM | |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| Paraformeldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo-Fisher | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo-Fisher | 10010023 | |
| Red blood cell (RBC) lysis buffer | Qiagen | 158904 | |
| Serological pipettes, 2 to 25 mL | Costar Stripettes | ||
| Standard humidified cell culture incubator, 37 °C, 5 % CO2 | Sanyo | MCO-17AIC | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo-Fisher | 25200056 |
Referências
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