Aislamiento, proliferación y diferenciación de células madre derivadas de tejido adiposo de macaco rhesus
Summary
En este artículo, describimos el aislamiento de células madre derivadas de tejido adiposo derivadas de macaco rhesus (ADSC) utilizando un protocolo de digestión enzimática de tejidos. A continuación, describimos la proliferación de ADSC que incluye el desprendimiento celular, el conteo y el recubrimiento. Por último, la diferenciación de ADSC se describe utilizando agentes inductores adipogénicos específicos. Además, describimos técnicas de tinción para confirmar la diferenciación.
Abstract
El tejido adiposo proporciona una fuente rica y accesible de células madre multipotentes, que son capaces de autorrenovarse. Estas células madre derivadas de tejido adiposo (ADSC) proporcionan un sistema celular ex vivo consistente que es funcionalmente similar al de los adipocitos in vivo. El uso de ADSC en la investigación biomédica permite la investigación celular de la regulación metabólica y la función del tejido adiposo. La diferenciación ADSC es necesaria para la expansión adecuada de los adipocitos, y la diferenciación subóptima es un mecanismo importante de la disfunción adiposa. Comprender los cambios en la diferenciación de ADSC es crucial para comprender el desarrollo de la disfunción metabólica y la enfermedad. Los protocolos descritos en este manuscrito, cuando se siguen, producirán adipocitos maduros que pueden usarse para varias pruebas funcionales in vitro para evaluar la función metabólica de ADSC, que incluyen, entre otros, ensayos que miden la absorción de glucosa, lipólisis, lipogénesis y secreción. Los macacos Rhesus (Macaca mulatta) son fisiológica, anatómica y evolutivamente similares a los humanos y, como tales, sus tejidos y células se han utilizado ampliamente en la investigación biomédica y para el desarrollo de tratamientos. Aquí, describimos el aislamiento de ADSC utilizando tejido adiposo subcutáneo y omental fresco obtenido de macacos rhesus de 4 a 9 años de edad. Las muestras de tejido adiposo se digieren enzimáticamente en colagenasa seguida de filtración y centrifugación para aislar las ADSC de la fracción vascular estromal . Las ADSC aisladas proliferan en medios estromales seguidas de aproximadamente 14-21 días de diferenciación utilizando un cóctel de 0,5 μg/ml de dexametasona, 0,5 mM de isobutilmetilxantina y 50 μM de indometacina en medios estromales. Los adipocitos maduros se observan aproximadamente a los 14 días de diferenciación. En este manuscrito, describimos protocolos para el aislamiento, proliferación y diferenciación de ADSC in vitro. Aunque nos hemos centrado en las ADSC del tejido adiposo del macaco rhesus, estos protocolos se pueden utilizar para el tejido adiposo obtenido de otros animales con ajustes mínimos.
Introduction
El tejido adiposo está compuesto por una mezcla heterogénea de células, predominantemente adipocitos maduros y una fracción vascular estromal que incluye fibroblastos, células inmunes y células madre derivadas de tejido adiposo (ADSC)1,2,3. Las ADSC primarias pueden aislarse directamente del tejido adiposo blanco y estimularse para diferenciarse en adipocitos, cartílagos o células óseas4. Las ADSC exhiben características clásicas de células madre, como el mantenimiento de la multipotencia in vitro y la autorrenovación; y son adherentes al plástico en cultivo 5,6. Las ADSC son de importante interés para el uso en medicina regenerativa debido a su multipotencia y capacidad de ser fácilmente cosechadas en grandes cantidades utilizando técnicas no invasivas7. La diferenciación adipogénica de las ADSC produce células que imitan funcionalmente los adipocitos maduros, incluida la acumulación de lípidos, la captación de glucosa estimulada por insulina, la lipólisis y la secreción de adipocinas8. Su parecido con los adipocitos maduros ha llevado al uso generalizado de ADSC para la investigación fisiológica de las características celulares y la función metabólica de los adipocitos. Cada vez hay más evidencias que apoyan la idea de que el desarrollo de disfunciones metabólicas y trastornos se origina a nivel celular o tisular 9,10,11,12. Se requiere una diferenciación óptima de ADSC para una expansión suficiente del tejido adiposo, una función adecuada de los adipocitos y una regulación metabólica efectiva13.
Los protocolos descritos en este manuscrito son técnicas sencillas que utilizan equipos de laboratorio estándar y reactivos básicos. El manuscrito describe primero el protocolo para el aislamiento de ADSC primarias del tejido adiposo fresco mediante digestión mecánica y enzimática. A continuación, se describe el protocolo para la proliferación y el paso de ADSC en medio estromal. Por último, se describe el protocolo para la diferenciación adipogénica de ADSC. Después de la diferenciación, estas células se pueden utilizar para estudios para comprender mejor el metabolismo de los adipocitos y los mecanismos de disfunción. También se describen los protocolos para la confirmación de la diferenciación adipogénica y la detección de gotas lipídicas mediante tinción Oil Red O y boro-diprometeno (BODIPY). Los detalles de estos protocolos se centraron en las ADSC primarias aisladas del tejido adiposo omental fresco de macacos rhesus. Nosotros y otros hemos utilizado este protocolo para aislar con éxito ADSC de depósitos de tejidos adiposos subcutáneos y omentales de macacos rhesus14,15. Para la misma cantidad de tejido utilizado, hemos observado que el tejido adiposo subcutáneo es más denso, más resistente y produce menos células de la digestión en comparación con el tejido adiposo omental. Este protocolo también se ha utilizado para aislar ADSC de muestras adiposas humanas16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los protocolos de aislamiento, proliferación y diferenciación de ADSC son sencillos y reproducibles, pero requieren una técnica cuidadosa para garantizar un aislamiento adecuado, una expansión saludable y una diferenciación eficiente. Un entorno de trabajo estéril es fundamental para todos los experimentos de cultivo celular. Las bacterias u hongos pueden introducirse en cultivos celulares a través de herramientas, medios o entornos de trabajo contaminados. La contaminación por hongos está indicada por el crecim…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a Curtis Vande Stouwe por su asistencia técnica. La investigación subyacente al desarrollo de los protocolos fue apoyada por subvenciones del Instituto Nacional sobre el Abuso del Alcohol y el Alcoholismo (5P60AA009803-25, 5T32AA007577-20 y 1F31AA028459-01).
Materials
| 0.4 % trypan blue | Thermo-Fisher | 15250061 | |
| 1.5-ml microcentrifuge tube | Dot Scientific | 707-FTG | |
| 100 % isopropanol | Sigma-Aldrich | PX1838-P | |
| 100-mm cell culture dish | Corning | 430167 | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | |
| 50-mL plastic conical tube | Fisher Scientific | 50-465-232 | |
| 70-µm cell strainer | Corning | CLS431751 | |
| a-MEM | Thermo-Fisher | 12561056 | |
| Aluminum foil | Reynolds Wrap | ||
| BODIPY | Thermo-Fisher | D3922 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 05470 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Collagenase, Type I | Thermo-Fisher | 17100017 | |
| Dexamethasone-Water Soluble | Sigma-Aldrich | D2915 | |
| Dimethyl sulfoxide, DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Distilled water | Thermo-Fisher | 15230162 | |
| Fetal Bovine Serum, USDA-approved | Sigma-Aldrich | F0926 | |
| Fungizone/Amphotericin B (250 ug/mL) | Thermo-Fisher | 15290018 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo-Fisher | 14175095 | |
| Hemacytometer with cover slip | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | |
| Inverted light microscope | Nikon | DIAPHOT-TMD | |
| L-glutamine (200 mM) | Thermo-Fisher | 25030081 | |
| Laboratory rocker, 0.5 to 1.0 Hz | Reliable Scientific | Model 55 Rocking | |
| Neutral buffered formalin (10 %) | Pharmco | 8BUFF-FORM | |
| Oil Red O | Sigma-Aldrich | O0625 | |
| Paraformeldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo-Fisher | 15140122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo-Fisher | 10010023 | |
| Red blood cell (RBC) lysis buffer | Qiagen | 158904 | |
| Serological pipettes, 2 to 25 mL | Costar Stripettes | ||
| Standard humidified cell culture incubator, 37 °C, 5 % CO2 | Sanyo | MCO-17AIC | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo-Fisher | 25200056 |
Referências
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