Summary
Wir präsentieren ein mikrofluidisches System für Hochdurchsatzstudien an komplexen Lebensmaschinen, das aus 1500 Kultureinheiten, einer Reihe verbesserter Peristaltikpumpen und einem Mischmodul vor Ort besteht. Der mikrofluidische Chip ermöglicht die Analyse der hochkomplexen und dynamischen Mikro-Umgebungsbedingungen in vivo.
Abstract
Die Nachahmung von in vivo-Umweltbedingungen ist entscheidend für In-vitro-Studien an komplexen Lebensmaschinen. Aktuelle Techniken, die auf lebende Zellen und Organe abzielen, sind jedoch entweder sehr teuer, wie Robotik, oder es fehlt an Nanolitervolumen und Millisekunden-Zeitgenauigkeit bei der Flüssigkeitsmanipulation. Wir präsentieren hierdas Design und die Herstellung eines mikrofluidischen Systems, das aus 1.500 Kultureinheiten, einer Reihe verbesserter peristaltischer Pumpen und einem Mischmodul vor Ort besteht. Um die Kapazitäten des mikrofluidischen Geräts zu demonstrieren, werden neuronale Stammzellkugeln (NSC) im vorgeschlagenen System beibehalten. Wir haben beobachtet, dass die runden konforme Konformation gut erhalten bleibt, wenn die NSC-Kugel CXCL in Tag 1 und EGF in Tag 2 ausgesetzt ist. Die Variation der Eingangsreihenfolge von 6 Medikamenten bewirkt morphologische Veränderungen der NSC-Sphäre und des ausdrucksrepräsentativen Markers für NSC-Stammheit (d. h. Hes5 und Dcx). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass dynamische und komplexe Umgebungsbedingungen große Auswirkungen auf die NSC-Differenzierung und Selbsterneuerung haben, und das vorgeschlagene mikrofluidische Gerät ist eine geeignete Plattform für Hochdurchsatzstudien an den komplexen Lebensmaschinen.
Introduction
Hohe Durchsatztechniken sind entscheidend für biomedizinische und klinische Studien. Durch die parallele Durchführung von Millionen chemischer, genetischer oder lebender Zell- und Organoidtests können Forscher schnell Gene identifizieren, die einen biomolekularen Pfad modulieren, und den sequenziellen Medikamenteneinsatz an die spezifischen Bedürfnisse anpassen. Robotik1 und mikrofluidische Chips in Kombination mit einem Gerätesteuerungsprogramm ermöglichen die Automatisierung komplexer experimenteller Verfahren, die zell-/gewebemanipulation, Flüssigkeitshandhabung, Bildgebung und Datenverarbeitung/-steuerung2,3umfassen. Daher können Hunderte und Tausende von experimentellen Bedingungen auf einem einzigen Chip aufrechterhalten werden, nach dem gewünschten Durchsatz4,5.
In diesem Protokoll beschrieben wir das Design- und Herstellungsverfahren eines mikrofluidischen Geräts, das aus 1500 Kultureinheiten, einer Reihe verbesserter peristaltischer Pumpen und einem Mischmodul vor Ort besteht. Die 2-stufige Zellkulturkammer verhindert unnötiges Scheren während des mittleren Austauschs, was eine ungestörte Kulturumgebung für die langfristige Live-Zell-Bildgebung sicherstellt. Die Studien zeigen, dass das vorgeschlagene mikrofluidische Gerät eine geeignete Plattform für Hochdurchsatzstudien an komplexen Lebensmaschinen ist. Darüber hinaus ermöglichen die fortschrittlichen Eigenschaften des mikrofluidischen Chips die automatisierte Rekonstitution hochkomplexer und dynamischer Mikroumweltbedingungen in vivo, wie die ständig wechselnden Zytokin- und Ligandenzusammensetzungen6,7, deren Fertigstellung Monate für konventionelle Plattformen wie 96-Well-Platten dauert.
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Protocol
1. Mikrofluidische Chips Design
- Entwerfen Sie den mikrofluidischen Multiplexer, der aus 18 Einlässe besteht, die jeweils über ein einzelnes Ventil und eine Peristaltikpumpe gesteuert werden. Um das durch den Pumpzyklus angetriebene Flüssigkeitsvolumen zu erhöhen, müssen die Peristaltikpumpe aus 3 Steuerkanälen bestehen, die absichtlich auf 200 m erweitert wurden, und 10 angeschlossenen Durchflussleitungen.
- Gestalten Sie die scherfreie Kulturkammer. Die Replikation der 2-stufigen Kultureinheit besteht aus einer unteren Zellkulturkammer (400 x 400 x 150 m) und einer höheren Pufferschicht (400 x 400 x 75 m), die unerwünschte Scherbelastung der Zellen während des mittleren Austauschs verhindert(Abbildung 1).
- Entwerfen Sie Funktionen mit hohem Durchsatz. Duplizieren Sie die Kultureinheit, um ein 30 x 50 Matrix-Layout zu bilden, das eine Fläche von ca. 7 cm x 5 cm größe einnimmt.
2. Chipherstellung und Betrieb
- Herstellung des Replikgusses mittels UV-Lithographie
HINWEIS: Die Replik Formteile wurden auf Silizium-Wafer nach dem Standard-Photolithographie-Protokoll8hergestellt.- Fertigung der Kanalstrukturen
- Spinning Photoresist: Spincoat 5 ml der SU-8 3025 negativer Photoresist auf einem Siliziumwafer bei 500 U/min für 10 s und 3000 U/min für 30 s.
- Soft Backen: Den Wafer bei 65 °C für 2 min und dann 10 min auf eine Kochplatte legen und 10 min abkühlen lassen, auf Raumtemperatur abkühlen.
- Ausrichtung und Aushärtung: Befestigen Sie den Wafer und die Maske am Halter des Aligners und schalten Sie die Lichtquelle für 18 s ein, um den belichteten Photowiderstand zu heilen.
- Pre-Post-Exposition backen: Den Wafer bei 110°C/h von der Raumtemperatur auf 95°C hochfahren und mindestens 40 min bis zum Entfernen aufbewahren.
- Entwickeln: Tauchen Sie den Wafer in die entwicklungsorientierte Lösung (SU-8-Entwickler) und agitieren Sie ihn für 2,5 min, um redundanten Photowiderstand abzuwaschen und die 25 m hohe Kanalstruktur zu erhalten.
- Hart backen: Den Wafer mit glasier Petrischale bedecken und bei 65 °C 2 min backen, dann bei 120 °C/h auf 160°C hochfahren und 3 Stunden aufbewahren.
- Herstellung der Zellkulturkammer mit der Pufferschicht
- Verwenden Sie die Parameter von Schritt 2.1.1.1, um die Schicht 7 ml des SU-8 3075 negativen Photoresists auf dem obigen Wafer zu drehen.
- Soft backen (beschrieben in Schritt 2.1.1.2) den Wafer und ändern Sie die Maske, um gut mit Markern auf dem Wafer auszurichten. Schalten Sie dann die Lichtquelle für 24 s ein, um den exponierten Photowiderstand zu heilen.
- Tauchen Sie den Wafer in die sich entwickelnde Lösung (SU-8-Entwickler) ein und bewegen Sie ihn 4 Minuten und 40 Sekunden lang, um redundanten Photoresist abzuwaschen und eine 75 m hohe Schichtstruktur zu erhalten, die um die 25 m hohe Kanalstruktur herum gefertigt wurde. Hartes Backen (beschrieben in Schritt 2.1.1.6) der Wafer, um die komplexe Struktur stärker zu machen.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.1.2.1-2.1.2.3, um eine 75 m hohe Kammerstruktur herzustellen, die sich auf der Schichtstruktur stapelt.
- Herstellung der Ventilstrukturen
- Mit dem Parameter Schritt 2.1.1.1 zu drehen Schicht 5 ml der AZ 50x positive Photoresist auf dem oben wafer.
- Soft backen (beschrieben in Schritt 2.1.1.2) den Wafer und machen die Maske gut mit Markern auf dem Wafer ausgerichtet, dann halten Sie die Lichtquelle für 20 s und sofort für 30 s. Wiederholen Sie den Lichtein-/Aus-Vorgang in 5 Kreisen, um den belichteten Photowiderstand zu heilen.
- Tauchen Sie den Wafer auf den passenden Entwickler und rühren Sie ihn für ca. 8 min, um redundanten Photoresist abzuwaschen und die runden Ventile zu erhalten, die sich mit den Steuerkanälen überlappen, um eine gute Verbindung zu gewährleisten. Hart backen (beschrieben in Schritt 2.1.1.6) der gemusterte Wafer, um das ganze Modell stärker zu machen.
- Fertigung der Kanalstrukturen
- Mikrofluidische Chipproduktion mit weicher Lithographie
- Behandeln Sie die gemusterten und leeren Siliziumwafer mit Rimethylchlorosilane für 15 min.
- Bereiten Sie 3 Portionen PDMS-Gel (10:1 Monomer/Katalysatorverhältnis) vor, die 50 g Durchflussschicht, 20 g Kontrollschicht 2 bzw. 20 g Membran entsprechen.
- 50 g PDMS-Gel auf den gemusterten Siliziumwafer gießen und 1-2 Stunden in der Vakuumkammer bei -0,85 MPa entgasen, um die Durchflussschicht zu kopieren.
- Die 2 Portionen von 20 g PDMS entgasen und auf dem gemusterten Wafer und einem leeren Siliziumwafer bei 2000-2800 U/min für 30 s drehen, um eine Kontrollschicht und Membranschicht vorzubereiten.
- Die PDMS-bedeckten Wafer für 60 min bei 80 °C zur Inkubation in den Lüftungsofen geben.
- Richten Und verkleben Sie die verschiedenen Schichten durch kundenspezifische optische Vorrichtung (Zoom in 100x) und Plasmaätzmaschine. Dann halten Sie es in einem Lüftungsofen für 2 Stunden bei 80 °C, um die Bindung des Chips zu verbessern.
- Stanzen Sie die Einlasslöcher auf den Chip, und kleben Sie ihn dann vor Gebrauch auf einen PDMS-beschichteten Coverslip und werden vor Gebrauch mindestens 12 Stunden bei 80 °C ausgehärtet.
- Chipbetrieb
- Verbinden Sie miniaturpneumatische Magnetventile mit der Steuerschicht des Chips und öffnen Sie die angepasste grafische MatLAB-Benutzeroberfläche8, um den Schalter zu verbinden und zu steuern.
- Stellen Sie die Schließdrücke von Push-up PDMS Membranventilen auf 25 psi ein.
- Bieten Sie dynamisch wechselnde kombinatorische/sequenzielle Eingänge an bestimmte Kammern(Abbildung 2d) durch rechtzeitiges Einschalten der Ventile.
3. Erzeugung dynamischer Eingänge in zellulären Mikroumgebungen
- Chipbehandlung und Zellbeladung
- Halten Sie die Standardkulturbedingungen (37 °C, 5%CO2) mindestens 5 Stunden am Mikroskop aufrecht.
- Füllen Sie den Chip mit einem Beschichtungsmedium (d. h. in der ANMERKUNG erwähnt) und inkubieren Sie ihn unter den Standardkulturbedingungen (beschrieben in Schritt 3.1.1) für mindestens eine Stunde.
- Spülen Sie den Chip durch phosphatgepufferte Saline (PBS) oder Zellkulturmedium (Dulbecco es Modified Eagle es medium, DMEM), um eine gesunde Kulturumgebung aufzubauen.
- Ernten Sie Zellen mit einer Koninfluenzanz von 80 % und setzen Sie die Zellen mithilfe von Kulturmedien (DMEM) mit einer Dichte von 106/ml wieder aus. Dann laden Sie Zellen in den Chip, indem Sie die zellhaltige Lösung unter Druck setzt.
HINWEIS: Das Culieren verschiedener Zelllinien auf dem Chip erfordert ein entsprechendes Beschichtungsmedium, um die Zellkulturkammer zu behandeln. Typischerweise sind für Experimente mit 3T3-Fibroblasten und der anhaftenden Kultur der Henne alle Ventile, die die Kulturkammern steuern, offen, Zellen fließen in alle Kulturkammern innerhalb derselben Säule.
- Einrichtung für Live-Zell-Bildgebung mit hohem Durchsatz
HINWEIS: Für die Bildaufnahme wurden ein invertiertes Mikroskop mit einer automatisierten Translationsstufe und eine digitale Komplementär-Metall-Oxid-Halbleiterkamera (CMOS) verwendet. Die Bühnen- und Bildaufnahme wurde über die kundenspezifische Software gesteuert.- Visualisieren Sie die Matrix der Kulturkammern mit 10x Objektivlinse im hellen Feld, um die Positionskoordinaten jeder Kammer der 30 x 50-Kammermatrix zu bestätigen und zu definieren.
- Transformieren Sie die Objektivlinse in das 20x oder 40x, dann wählen Sie die Positionskoordinaten der gewünschten Kammer aus und die Translationsstufe bewegt sich nach der Bestätigung an die zugewiesene Position. Feinabstimmung der x, y, z Fokalebene, um ein optimales Bild zu erhalten.
- Optimal wurden die Lichtintensität, die Zeit verfügbar gemacht und andere abgebildete Parameter wurden für jeden Kanal individuell bestimmt (d. h. Lichtfeld- und Fluoreszenzbildgebung).
- Legen Sie das Intervall und die Dauer des Bildgebungszyklus fest, speichern Sie den Pfad, und starten Sie dann mit der Bildgebung.
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Representative Results
Die konventionelle On-Chip-Peristaltikpumpe wurde erstmals von Stephen Quake im Jahr 2000 beschrieben, mit der die Peristaltik nach dem Muster 101, 100, 110, 010, 011, 001 8,10betätigt wurde. Die Zahlen 0 und 1 zeigen "öffnen" und "schließen" der 3 horizontalen Steuerlinien an. Studien mit mehr als 3 Ventilen (z.B. fünf) wurden ebenfalls berichtet11. Obwohl die peristaltische Pumpe aus 3 Steuerleitungen und 3 Durchflusslinien Nanolitergenauigkeit bietet, ist die Transportgeschwindigkeit zu langsam, um 1.500 Kulturkammern zu versorgen. Um das Problem zu lösen, schließen wir mehr Durchflussleitungen (d. h. die 10 angeschlossenen Kanäle) ein, um das Flüssigkeitsvolumen pro Pumpzyklus zu erhöhen (d. h. 101, 100, 110, 010, 011, 001). So können die Nährstoffe und Medikamente effektiv in bestimmte Kammern geliefert werden. Die peristaltische Pumpe transportiert Flüssigkeitvolumen kann um 16x auf 50 Nanoliter pro Pumpzyklus erhöhen. Da das Array peristaltischer Pumpen über 3 angeschlossene Steuerkanäle gesteuert wird (Abbildung 1b), werden die Lösungen aus jedem Einlass gleichzeitig an den Chip geliefert und ermöglichen ein sofortiges Mischen. Kombinatorische und sequentielle Eingänge können daher durch rechtzeitiges Einschalten der mit verschiedenen Lösungen verbundenen Einlässe erzeugt werden. Mit der gleichen Methodik können auch dynamisch variierende Zytokin- und Ligandenkonzentrationen erzeugt werden. Beispielsweise können ausgewählte Kombinationen von 1, 0,9, 0,2, 0,05, 0,01 g/L und 4 Leerkulturmedien eine Sinuswellenschwankung (zwischen 0 und 0,5 g/L) in der Konzentration mit Schrittgrößen von 0,0005 bis 0,01 g/L erzeugen.
Für die Kultur der Primärzellen ist es entscheidend, eine stabile Mikroumgebung aufrechtzuerhalten. Scherspannung und Erschöpfung des konditionierten Mediums während des mittleren Austauschs beeinflussen das Zellverhalten und das Zellschicksal12. Um diese Probleme zu überwinden, entwerfen wir eine Pufferschicht, um unerwünschte Scherbelastungen der Zellen während des mittleren Austauschs zu verhindern (Abbildung 1c). Im Gegensatz zu den herkömmlichen Kultureinheiten sind die Hauptvorteile des Gerätes (d.h. ventilgesteuert) ihre Fähigkeit, vor Ort zu mischen, zu liefern und unabhängige Bedingungen zu warten. In Abbildung 2dhaben wir gezeigt, dass ein komplexes chinesisches Wort auf Chip durch präzise Lieferung von Flüssigkeiten an bestimmte Positionen und Die Aufrechterhaltung eines nicht betroffenen Zustands in einzelnen Kulturkammern auf Chip erzeugt werden kann. Die Fähigkeiten des aktiven Fluidgeräts beim Mischen vor Ort werden mit einem Videoclip veranschaulicht, der die sich dynamisch verändernden FITC-Konzentrationen in einer Kulturkammer zeigt (Abbildung 3c und Video 7:47-7:50), die durch die Steuerung der Pumprate von 2 unabhängigen peristaltischen Pumpen erreicht wird, die mit 2 Einlässe12verbunden sind. Die numerische Simulation legt nahe, dass, wenn das Medium von oben nach unten durch die Kulturkammern gerichtet wird, der Scherfluss schnell den unteren Rand der Kultur gut erreicht (Video 4:07-4:25). Die Scherkräfte können effektiv verhindert werden, wenn die Lösung von links nach rechts gerichtet wird. Selbst bei einer Eingangsgeschwindigkeit von 10 mm/s bleibt das zell- oder mikrometergroße Gewebe am unteren Rand der Kultureinheit ungestört.
Wie in Abbildung 3b(1) dargestellt, wird jeder Einlass durch ein anderes Ventil als die untere Peristaltikpumpe gesteuert. Wenn ein Medikament ausgewählt wird, um in bestimmte Kammern geliefert werden, ist der Mitlass mit dem Medikament verbunden ist offen und der Betrieb der Anordnung der peristaltischen Pumpe transportiert nur dieses Medikament. Für 2 oder mehrere Medikamente öffnen wir einfach die angeschlossenen Einlässe, um eine Mischung von Medikamenten bei gleichem Volumen zu erzeugen. Wir integrieren auch eine unabhängige peristatische Pumpe unabhängig vom Array (Abbildung 2g), die mit einer anderen Pumprate als das Array arbeiten und somit unterschiedliche Verdünnungen erzeugen könnte. Um die in vivo NSC dynamischen Umgebungsbedingungen nachzuahmen, wurden sequentielle und kombinatorische Bedingungen von 6 Liganden (d.h. Jagged, DLL, EGF, PACAP, CXCL, PDGF), die aus 720 und 56 verschiedenen Bedingungen besteht, mit dem Array von peristaltischen Pumpen erzeugt und an die dafür vorgesehenen Kammern geliefert. Im Detail können sequenzielle Bedingungen als Sij = "Ligand i" am Tag jund eine kombinatorische Bedingung als Ci = "Ligand i is present" dargestellt werden, wobei Ligand i = Jagged, DLL, EGF, PACAP, CXCL, PDGF und j=1,2,3,4,5,6. Reaktionen der NSC-Zellen und -Sphären wurden alle 2 Stunden während der Kultur und Stimulation aufgezeichnet.
NSC-Kugeln werden in der 400 x 400 x 400 m Zellkulturkammer(Abbildung 2e und Abbildung 4)gepflegt. Differenzierung und Stammheit (d.h. Selbsterneuerung) der Stammzellen werden durch die Expressionsebene von Dcx bzw. Hes5 dargestellt. Wir haben beobachtet, dass, wenn die NSC-Kugel CXCL in Tag 1 und EGF in Tag 2 ausgesetzt ist, die runde Konformation gut erhalten ist und die Kugelgröße offensichtlich zunimmt. NSCs mit hoherDcx-Expressionsstufe sterben am3. Tag ab, wenn EGF durch PACAP ersetzt wird, was auf Auswirkungen auf die differenzierten Zellen13,14,15,16hindeutet. Die Zellen beginnen, sich nach Stimulation durch DLL am4. Tag an der unbehandelten PDMS-Oberfläche zu heften und sich mit der Zugabe von PDGF am5. Tag und Jagged am6. Tag in einzelne Zellen zu dissoziieren. Änderungen in der Eingangsreihenfolge dieser 6 Liganden bringen einen unverwechselbaren NSC-Status (Abbildung 5). Beispielsweise variiert die Entwicklung von NSCs erheblich, wenn CXCL die Position mit PDGF entlang der Sequenz wechselt (Abbildung 5a und 5b). Diese Ergebnisse zeigen, dass die dynamischen unterschiedlichen Umweltbedingungen große Auswirkungen auf die Differenzierung und Selbsterneuerung von NSCs haben, was den Weg für die Entwicklung von Brain-on-Chip-Plattformen für biomedizinische Studien sowie klinische Anwendungen ebnet.
Abbildung 1:Design des mikrofluidischen Hochdurchsatzchips. a. Die verbesserte Peristaltikpumpe besteht aus mehreren Durchflusskanälen und verbreiterten Steuerkanälen, was zu einer Erhöhung des übertragenen Flüssigkeitsvolumens pro Pumpzyklus führt. b. Das Array peristaltischer Pumpen wird über 3 angeschlossene Steuerleitungen gesteuert. Daher kann die Einbeziehung verschiedener Einlässe zu programmierten Zeitpunkten kombinatorische, sequenzielle und dynamische unterschiedliche Eingangssignale erzeugen. c. Um unerwünschten Scherfluss zu verhindern, haben wir eine 2-stufige Kultureinheit entwickelt. Die Zellen werden am unteren Ende der unteren Ebene, die 150 m in der Tiefe ist, gehalten. d. Jede Kulturkammer ist mit 4 Kanälen verbunden, so dass die Lösung durch die Richtungen von oben nach unten und links nach rechts geleitet werden kann. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2:Herstellung des mikrofluidischen Hochdurchsatzchips. a. Mikrostrukturen von Steuerungs- und Strömungsschichten wurden zunächst auf Siliziumwafern gemustert, auf denen PDMS für die Replikation gegossen wird. b. Die Steuerungs-, Membran- und Strömungsschichten werden durch Plasmaätzen und thermische Verklebungen ausgerichtet und miteinander verbunden. c-f. Die erweiterten Eigenschaften des Chips werden mit grünen, blauen und gelben Lebensmittelfarbstoffen demonstriert. Wir zeigen, dass durch rechtzeitiges Einschalten der Ventile Lösungen der Nanolitergenauigkeit an die dafür vorgesehenen Kammern geliefert werden können. g. Das Array der peristaltischen Pumpen wird durch 3 angeschlossene Steuerleitungen (d.h. Control-1) und eine unabhängige peristaltische Pumpe gesteuert, die von anderen 3 Steuerleitungen (d.h. Control-2) gesteuert wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3:Ein Schaltplan, der das aktive Fluidgerät zeigt. Ein Schaltplan, der zeigt, dass (a) Zellen durch den Bypasskanal fließen; (b) Ventile steuern den Einlass und die Peristaltikpumpe; und (c) Zellen fließen in die Kulturkammern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Repräsentative Bilder der NSC-Sphäre bei der Stimulierung durch sequenzielle Arzneimitteleinwirkungen. Hellfeld (obere Reihe), Hes5-GFP (zweite Reihe), Dcx-Desred(dritte Reihe) Bilder zeigen, dass bei sequentieller Stimulation ein erheblicher Zelltod sowohl bei Dcx-highals auch bei Hes5-high Cells auftritt. Die Entstehung des dunklen Bereichs deutet auf den Tod von Stammzellen hin, die sich hauptsächlich in der Kernregion lokalisieren. Maßstabsleiste: 100 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5:Variationen der NSC-Kugelkonformation, Dcx- und Hes5-Expressionsebene, wenn sie durch verschiedene sequenzielle Eingänge stimuliert werden. Es wird gezeigt, dass Variationen in der Eingangsreihenfolge von 6 Medikamenten Veränderungen im Gewebe, morphologischen und Expressionsniveau von Signalmolekülen verursachen, was die Empfindlichkeiten der NSC-Sphäre gegenüber den dynamischen Umgebungsbedingungen anzeigt. Die Eingabesequenzen: (a) DLL>> PACAP>> EGF>> CXCL>> PDGF>> Jagged, (b) DLL>> PACAP >> EGF >> PDGF >> CXCL >> Jagged, (c) DLL >> PACAP >> PDGF >> CXCL >> EGF >> DGT; DLL >> Maßstabsleiste: 100 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Verschiedene mikrofluidische Geräte wurden entwickelt, um Multiplex- und komplexe Experimentedurchzuführen 17,18,19,20. Beispielsweise können Mikrobrunnen aus einer Reihe von topologischen Aussparungen einzelne Zellen ohne den Einsatz externer Kraft einfangen, was vorteilhafte Zeichen wie geringe Stichprobengröße, Parallelisierung, geringere Materialkosten, schnellere Reaktion, hohe Empfindlichkeit21,22,23,24zeigt. Tröpfchen und Oberflächenspannung begrenzt Tröpfchen eliminieren die Notwendigkeit für Hilfshardware wie eine Mikropumpe, so dass der Transport von Tröpfchen kostengünstiger und umweltfreundlicher25,26. Flüssigkeitstropfen können leicht mit Mikropipetten oder Sprühdüsen auf der Oberfläche abgelagert werden, und nach den Experimenten können die Systeme leicht erfrischt und wiederverwendbar sein27,28. Die Slipchip-Technik ermöglicht Multiplexreaktionen ohne Einbeziehung integrierter Pumpen oder Ventile und damit benutzer- und herstellerfreundlich29,30. Diese Systeme stehen jedoch vor einer Reihe technischer Hürden, wie z. B. der Lagerung von Nanoliter-Lösungen in Mikrobrunnen, der Kontrolle der Luftfeuchtigkeit und den Einschränkungen paralleler Flüssigkeitsdosiertechnologien mit geringem Volumen.
In diesem Artikel haben wir ein Protokoll für biomedizinische Experimente mit hohem Durchsatz mit Live-Zell-Bildgebungssystem und einem maßgeschneiderten mikrofluidischen Gerät beschrieben. Die Verfahren der Chipherstellung einschließlich UV- und Softlithographie sowie Rüstparameter für die automatische Fluoreszenz-Bildgebung werden detailliert demonstriert. Die Ergebnisse zeigen, dass die fortgeschrittenen funktionellen Merkmale (d. h. die 2-stufige Kulturkammer und die verbesserte peristaltische Pumpe) des vorgeschlagenen mikrofluidischen Chips die zuvor gemeldeten Geräte übertreffen und die Notwendigkeit erfüllen, Tausende von parallelen Experimenten durchzuführen. Wir beschrieben auch die entscheidenden Parameter (z.B. die Aufrechterhaltung des konditionierten Mediums), die man sorgfältig kontrollieren sollte, um eine gesunde Umgebung für die Kultur der Primär- und Stammzellen zu erhalten.
Zellbasierte biomedizinische Experimente, die komplexe Protokolle und programmierte Zusatzstoffe enthalten, werden oft als zeitaufwändig und mühsam angesehen. Zum Beispiel, neben den Zellmanipulationsverfahren, kombinatorische Inputs von 6 Medikamenten mit stündlichem Nachfüllen erfordert mindestens 250 Pipettierschritte pro Stunde, und Wiederholung bis zum Ende des Experiments. Darüber hinaus erfordert die Modellierung dynamischer Umgebungsbedingungen in vivo eine rechtzeitige Zugabe von einem oder mehreren Zytokinen, Liganden und Medikamenten in Sekundengenauigkeit, was für manuelle Operationen unmöglich ist. Wir zeigen hierin, dass durch den Anschluss der Einlässe des Chips an mehrere Medikamente oder verschiedene Konzentrationen einzelner Medikamente, kombinatorische, sequentielle und dynamisch variierende Eingangssignale in den scherfreien Zellumgebungen erzeugt und aufrechterhalten werden können. Die morphologischen und chemischen Reaktionen von Zellen und Geweben, die in den parallel laufenden Kulturkammern gepflegt werden, können dann in Echtzeit mit der kommerziellen Mikroskopsoftware überwacht werden.
Mit steigendem Durchsatz von mikrofluidischen Geräten und automatisierter Datenerfassung während der Bioimaging kann das Live-Zell-Bildgebungssystem tausende Bilder pro Stunde erzeugen. So erzeugt der kontinuierliche Betrieb des 1500-Einheiten-Chips für eine Woche 252.000 Bilder. Es kann Monate dauern, die Evolution von Geweben und Zellpopulationen (z. B. expressionsniveau der fluoreszierend markierten Biomoleküle) auf Einzelzellebene manuell zu verfolgen. Mit einem kundenspezifischen MATLAB-Programm können die Massendaten automatisch sortiert, formatiert und analysiert werden. Spuren, die die Beweglichkeit, morphologische Merkmale und den Ausdrucksgrad von Signalmolekülen zeigen, können abgerufen werden (siehe Video), was menschliches Versagen vermeidet und viel Zeit spart.
Daher zeigt die hier gezeigte Methodik geeignete Protokolle für biomedizinische Experimente mit hohem Durchsatz mit automatisierter Zell- und Gewebemanipulation, fluoreszierender Bildgebung und Datenanalyse. Das Einschalten von Membranventilen bietet optimales Flüssigkeitsvolumen, Zeit und räumliche Auflösung, um die sich ständig verändernden und komplexen Umgebungsbedingungen für In-vitro-Wie ein Organ-on-Chip zu rekonstruieren. Obwohl das Protokoll im Vergleich zu den biomedizinischen Übergangsansätzen (z. B. manuelle Verfahren mit 96-Well-Platten) wesentlich komplexer ist, beschränkt sich das vorgestellte Protokoll und die Plattform nicht auf Studien zu Zell- und Gewebefunktionen. Das Screening von kombinatorischen und sequenziellen Medikamenteningaben kann es uns ermöglichen, Therapien für klinische Anwendungen zu entwickeln.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die Autoren würdigen die technische Unterstützung von Zhifeng Cheng von Chansn Instrument (China) LTD. Diese Arbeit wurde durch Stipendien unterstützt (National Natural Science Foundation of China,51927804).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2713 Loker Avenue West | Torrey pines scientific | ||
| AZ-50X | AZ Electronic Materials, Luxembourg | ||
| Chlorotrimethylsilane(TMCS) 92360-25mL | Sigma | ||
| CO2 Incubator HP151 | Heal Force | ||
| Desktop Hole Puncher for PDMS chips WH-CF-14 | Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd. | ||
| DMEM(L-glutamine, High Glucose, henol Red) | Invitrogen | ||
| Electronic Balance UTP-313 Max:600g, e:0.1g, d:0.01g | Shanghai Hochoice Apparatus Manufacturer Co.,LTD. | ||
| FBS | Sigma | ||
| Fibronection 0.25 mg/mL | Millipore, Austria | ||
| Glutamax 100x | Gibco | ||
| Heating Incubator BGG-9240A | Shanghai bluepard instruments Co.,Ltd. | ||
| Nikon Model Eclipse Ti2-E | Nikon | ||
| Pen/Strep 10 Units/mL Penicillin 10 ug/mL Streptomycin | Invitrogen | ||
| Plasma cleaner PDC-002 | Harrick Plasma | ||
| polydimethylsiloxane(PDMS) | Momentive | ||
| polylysine 0.01% | Sigma | ||
| Spin coater ARE-310 | Awatori Rentaro | ||
| Spin coater TDZ5-WS | Cence | ||
| Spin coater WH-SC-01 | Suzhou Wenhao Microfluidic Technology Co., Ltd. | ||
| SU-8 3025 | MicroChem, Westborough, MA, USA | ||
| SU-8 3075 | MicroChem, Westborough, MA, USA |
References
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