Summary
本論文では、マウスの脂質代謝を評価するための3つの簡進性の高いアッセイを提供する。
Abstract
脂質代謝の評価は代謝機能の基礎であり、生体内代謝研究に不可欠と考えられています。脂質は、その合成と代謝に関与する多くの経路を持つ多くの異なる分子のクラスです。.栄養と肥満の研究のための脂質止まりの評価の出発点が必要です。本論文では、習得にほとんど専門知識や実践を必要とし、マウスの脂質代謝異常をスクリーニングするためにほとんどの研究室で適応させることができる3つの簡単でアクセス可能な方法について説明します。これらの方法は、(1)経口脂質耐性試験を通じた食事脂質取扱能力に対する栄養学的脂質処理能力に対する(2)の市販キットを用いたいくつかの断食血清脂質分子を測定し、(3)医薬化合物CL316,243、マウスにおける反応を評価する。これらの方法を合わせて、マウスにおける脂質処理能力の概要を提供する。
Introduction
炭水化物と脂質は、エネルギー代謝の 2 つの主要な基質です。.異常な脂質代謝は、II型糖尿病、心血管疾患、脂肪肝疾患、癌を含む多くのヒト疾患をもたらす。食事脂質は、主にトリグリセリドが腸内を通ってリンパ系に吸収され、心臓近くのクロミクロンの静脈循環に入る1。脂質は血流中のリポタンパク質粒子によって運ばれ、そこで脂肪酸部分は筋肉および脂肪組織2などの末梢器官におけるリポタンパク質リパーゼの作用によって遊離される。残りのコレステロールが豊富な残骸粒子は肝臓3によってクリアされる。マウスは、脂質代謝を研究する研究モデルとして研究室で広く使用されています。包括的な遺伝的ツールセットが利用可能で、比較的短い繁殖サイクルで、脂質がどのように吸収され、合成され、代謝されるのかを研究するための強力なモデルです。
脂質代謝の複雑さのために、高度なリピドミクス研究または同位体トレーサー研究は、通常、脂質種または脂質関連代謝フラックスおよび運命のコレクションを定量化するために使用される。これは、特殊な機器や専門知識を持たない研究者にとって大きな課題を生み出します。本論文では、技術的に挑戦的な技術を用いる前に、初期テストとして役立つ3つのアッセイを紹介する。これらはマウスの非末端手順であり、脂質処理能力の潜在的な違いを特定し、影響を受けるプロセスを絞り込むのに非常に有用です。
まず、断食血清脂質分子を測定することは、マウスの全体的な脂質プロファイルを確認するのに役立ちます。マウスは、食後に多くの脂質種が上昇し、増加の程度が食事の組成によって強く影響を受けるので、断食する必要があります。総コレステロール、トリグリセリド、非エステル化脂肪酸(NEFA)を含む多くの脂質分子は、吸光度を読み取ることができる市販キットやプレートリーダーを用いて測定することができる。
第二に、脂質耐性の経口検査は、脂質処理能力を吸収および代謝の正味の効果として評価する。経口投与された脂質は、トリグリセリド濃度の循環(1~2時間)のスパイクを引き起こし、その後、血清中性脂肪レベルは基底レベル(4〜6時間)に戻る。このアッセイは、マウスが外因性脂質をどの程度うまく処理できるかに関する情報を提供します。心臓、肝臓、および褐色脂肪組織はトリグリセリドの活性消費者であり、白い脂肪組織はそれをエネルギーリザーブとして保存する。これらの関数の変更は、テスト結果の違いにつながります。
最後に, 保存された脂質を動員する脂肪分解を促進することは、減量のための可能な戦略と考えられています。.脂肪組織におけるβ3-アドレナリン受容体シグナル伝達経路は脂肪細胞脂肪分解において重要な役割を果たし、ヒト遺伝学は肥満と相関するβ3アドレナリン受容体におけるTrp64Argの機能喪失多型Trp64Argを同定した。CL 316,243は、特異的かつ強力なβ3-アドレナリン受容体アゴニストで、脂肪組織脂肪分解およびグリセロールの放出を刺激する。CL 316,243に対するマウスの反応の評価は、化合物の有効性の開発、改善、および理解に関する貴重な情報を提供することができる。
総称して、これらの試験は、マウスの脂質代謝状態の変化の初期画面として使用することができる。それらは器械および試薬のアクセス性のために選ばれる。これらのアッセイから得られた結果により、研究者は動物の代謝適合性の全体像を形成し、より洗練されたターゲットを絞ったアプローチを決定することができます。
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Protocol
動物は、ベイラー医科大学(BCM)の施設動物ケアと使用委員会によって承認された動物ケアと実験プロトコルに従って標準化された条件で収容されています。動物は標準的または特別な食事、水のアドリビタムを与えられ、12時間の昼/夜のサイクルで保たれます。
1. 断食血清脂質の測定
- マウスを午後5時以降に新しいケージに移し、水への自由なアクセスで速く、一晩(実験前に約16時間の断食で)一晩の断食は、マウスの胃腸管の完全な空を保証します。
注:マウスは断食中に便を食べるので、食物の撤退は十分に断食されていることを保証できません。 - 翌朝、尻尾でマウスをつかみ、表面に置きます。マウスの尻尾を軽く引き戻し、マウスをリカーナに配置します。マウスを呼吸させながらマウスの動きを再訓練するために、鼻の拘束を置きます。鼻の拘束のつまみを締めます。胸の動きを監視して、動物が正常に呼吸していることを確認し、マウスが拘束者に費やす時間を最小限に抑えます。
- 遊離マウスの尾静脈に表面的な切開(ニック)を作り、切開から25μLの血液を、マウスを拘束することなくガラス毛細血管(毛細管の約1/3を充填)に引き込みます。マイクロ遠心チューブに素早く血液を吹き込みます。
- スタイプティックパウダーを使用して出血を止め、ケージ内の飼料を補充し、マウスにストレスの兆候がないことを確認します。
- すべてのマウスの血液離脱を完了します。
- 室温で1時間妨げなままにして血液を凝固させる。冷蔵されたベンチトップマイクロ遠心分離機で4°Cで2,000 x gの凝固した血液サンプルを10分間回転させ、上清(血清)を分析に移します。
注:血清は、分析まで数週間–20 °Cで保存することができます。長期保存の場合は、血清を-70°Cに保ちます。 - メーカーが提供するプロトコルを使用して、各脂質代謝物を分析します。
2. 経口脂質耐性試験
- 午後5時以降、翌日に与えられる脂質内容積の計算のためにマウスを秤量する。次に、マウスを新しいケージに移し、一晩(16時間)速くします。
- 翌朝、1つのケージに収容されたマウスの尾をマークし、その後の出血ステップでそれらを識別するのに役立ちます。
- 尾静脈にニックを作り、切開から15μLの血液をガラス毛細血管に引き込み(毛細管の約1/5を充填)、T = 0血清のマイクロ遠心チューブに素早く血液を吹き込みます。
注:マウスに過剰な出血がない限り、アッセイ中に出血を止める必要はありません。 - ガバジマウスは、18Gガビンギ針を1グラム当たり15μlの割合で使用し、前断食体重を用いた20%の脂質内である。1分で各マウスをスタックします。
注:動物の重量を量り、適切なギャバジ針のサイズを決定します。一般的に、18ゲージのガバジ針はマウス>25gに適しており、20〜22ゲージのガバジ針はより小さな動物に適しているであろう。マウスを擦り付け、肩の上の皮膚をつかんで動物の頭を所定の位置に保持します。口の中に針を入れ、食道に達するまで、上口蓋に沿って穏やかに進みます。チューブは抵抗なしで通過する必要があります。適切な深さに達すると、脂質内をゆっくりと投与することができる。イントラリピッドを管理した後、針の挿入時に同じ角度に従って針を静かに取り除きます。ケージに動物を戻し、呼吸や他の苦痛の兆候を監視します。
注:経口ギャバジや尾出血の技術で経験の浅い研究者は、2分以上の時間で各マウスを積み重ねることができます。 - T= 1、2、3、4、5、および6時間で血液を引き出す:尾出血を介してマウス1個あたり15μLの血液(1/5毛細血管)を引き出し、すぐにマイクロ遠心管に血液を吹き込みます。
- マイクロ遠心分離機で10分間室温で2,000 x gで血液サンプルを回転させます。浮遊脂肪層を含む上清を、貯蔵用のPCRチューブに移します。上清は、分析まで数週間–20°Cで保存することができます。
注:上清はプラズマでなければなりません。一部のサンプルが遠心分離の時点で既に凝固している場合、トリグリセリド測定には影響しません。 - 最後の採血後、スタイプティックパウダーを使って出血を止め、ケージ内の飼料を補充し、マウスが極端なストレスの兆候を示さないことを確認します。
- トリグリセリド標準の2μLをロードし、96ウェルプレートに上清を収集しました。
- トリグリセリド試薬を200μL加え、37°Cでプレートを5分間インキュベートして色を現します。
- 実験室の版の読者の参照波長の500 nmの吸光度を測定し、サンプルの濃度を計算する。
3. β3 アドレナリン受容体アゴニスト CL 316,243 刺激リポリシスアッセイ
- CL 316,243を無菌生理食物で5mg/mL(50x)のストック溶液として調製し、使用するまで-20°Cで保存します。
- 午前中、マウスの重量を量って、実験に必要な希釈CL 316,243溶液の量を計算する。マウスは、1 mg/kg体重の最終投与のために、希釈されたCL 316,243の体重1グラム当たり10 μLを受け取ります。
- マウスを水への自由なアクセスを持つ新しいケージに移し、4時間速くします。
- 生理液を使用して50xストックから十分な1x CL 316,243ソリューションを作ります。1x CL 316,243溶液の最終濃度は0.1 mg/mLです。対照処置群には生理的な処置を使用する。
- 出血のステップの間に容易に識別するために同じケージに収容されたマウスの尾をマークします。
- 尾静脈にニックを作り、切開から15μLの血液をガラス毛細血管(毛細管の約1/5を充填)に引き込み、T = 0サンプルのマイクロ遠心チューブに素早く血液を吹き込みます。
注:マウスに過剰な出血がない限り、アッセイ中に出血を止める必要はありません。 - 希釈したCL 316,243溶液(または実験に含まれる場合は制御)を10μL/g体重の体積で腹腔内に注入します。1分で各マウスをスタックします。60分間の実験ごとに最大5匹のマウス、または2人のチームには10匹のマウスを使用します。
- T= 5、15、30、60分で血液を引き出す:尾出血を介してマウスあたり15μLの血液(1/5毛細血管)を引き出す。
- 最後の採血後、スタイプティックパウダーを使って出血を止め、ケージ内の飼料を補充し、マウスが極端なストレスの兆候を示さないことを確認します。
- 冷蔵マイクロ遠心分離機で5分間、4°Cで2,000 x gで血液サンプルを回す。上清をPCRチューブに移して保存します。上清は分析まで数週間–20°Cで貯えることができる。
- 2x連続希釈グリセロール標準(0.156、0.312、0.625、1.25、および2.5 mg/mlトリオレーヌ相当濃度)の1μLをロードし、96ウェルプレートに上清を集めます。100 μLのフリーグリセロール試薬を加え、37°Cでプレートを5分間インキュベートさせて発色させます。
- 実験室用プレートリーダーを用いて540nmで吸光度を測定し、試料の濃度を計算します。
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Representative Results
我々は、各アッセイがマウスの脂質代謝に関する貴重な情報を提供することを3つの抜粋で示す。C57BL/6J雄マウスは、8週齢から8週間の高脂肪食(HFD)摂食に挑戦し、総コレステロール値が有意に上昇したのに対し、血清トリグリセライドとNEFAは有意に上昇しなかった(表1)、血液中のトリグリセリドおよびNEFAは主に食物脂肪チャレンジによって調節されないことを示唆している。マウスの第2コホートでは、C57BL6のC57BL/6JおよびC57BL6/Nサブストレインを8週間、8週齢から始めてHFDに供給した。彼らの血清中性脂肪濃度は、経口脂質中の挑戦後に比較された。結果は、6Nと6Jのサブストレインの顕著な違いを示し、6Jは脂質内投与後の血清中のトリグリセリドレベルにおいて有意に高いピークを有し、吸収の強化またははるかに遅いトリグリセリドクリアランスを示す(図1)。最後に、正常なチャウ(NC)で供給された8週齢の雄C57BL/6Jマウスについては、単一のCL 316,243治療(1mg/kg体重)が血清グリセロールの有意な増加につながった。しかし、1mg/kg体重CL 316,243を1週間用いたマウスの毎日の腹腔内前処理は、CL 316,243に対する鈍い反応を導き、それらのマウスにおけるCL 3116,263に対する耐性の発達を示唆した(図2)。
| 血清パラメータ | NC | HFD | P 値 |
| コレステロール (mg/dL) | 132.7±10.3 | 202.3±8.4 | 0.0002 |
| トリグリセリド (mg/dL) | 91.7±9.1 | 79.3±4.5 | 0.26 |
| 非エステル化脂肪酸(mmol/L) | 1.47±0.12 | 1.48±0.08 | 0.73 |
表1:正常チャウ(NC)または高脂肪食(HFD)で8週間食べさせるマウスの脂質種の断食。 データは、SEM. N = 6 ± NC グループの平均値として表され、HFD グループの場合は n = 12 として表されます。 P-valueは、両側の学生の t-testを用いて決定した。
図1:経口脂質チャレンジ後のC57BL/6サブストレインの血清トリグリセリドの差を示す結果の一例。データは、グループごとにSEM.N= 5±平均値として表されます。 P-valueは、各時点で両側のスチューデントの t-testを用いて決定した。* p < .05, ** p < .01. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:1週間のCL 316,243処置後のC57BL/6JマウスにおけるCL316,243治療に対する耐性の発達を実証した結果の一例。データは、グループごとにSEM.N= 5±平均値として表されます。P-valueは、各時点で両側のスチューデントのt-testを用いて決定した。** p < .01.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
3つのアッセイは、いくつかの重要な考慮事項を持つラボで堅牢に機能を記述しました。一晩断食は、断食血清脂質レベルおよび経口脂質耐性試験を決定するために必要とされる。経口脂質耐性試験では、特に1時間と2時間の時点で、脂肪層の形成を最小限に抑えるために室温で血液を回す必要があります。この脂肪層が形成された場合、この脂肪層を捨てないようにすることが重要です。脂質層で上清を移動し、トリグリセリドの決定のためにそれらを一緒に混合するように穏やかにピペットを確認してください。
断食血清脂質レベルの解釈
断食はマウス7の総コレステロール値を下げることが示されているが、一方、慢性的に高脂肪分の食事は総コレステロール値8を増加させる。コレステロールには、高密度リポタンパク質-コレステロール(HDL-C)と低密度リポタンパク質コレステロール(LDL-C)の2つの主要なタイプがあります。HDL-Cは、ヒトにおいて「良い」脂質とみなされます。それはコレステロールを運び、システムから洗い流される肝臓にそれを運ぶ。LDL-Csは、ヒト血清中のコレステロールの大部分を占め、動脈に蓄積し、主要な動脈疾患につながる可能性があります。しかし、マウスは重要な酵素を欠いている、コレステリルエステル転写タンパク質(CETP)9、HDLとapoB-リポタンパク質10との間でエステル化したコレステロールに対するトリグリセリドの交換を媒介する。これは、マウスに全く異なるリポタンパク質粒子プロファイルを与え、HDLが主な種である。その結果、総血清コレステロール値の変化は、主にHDL-Cレベルの変化を反映する。
マウスとヒトの両方で、高い血清トリグリセリドレベルは低グレードの炎症を増加させ、心機能11、12を損なう可能性がある。しかし、HFDは血清中性トリグリセリドレベルを増加させません。遺伝的要因は、代謝条件13よりも血清トリグリセリドレベルにおいて支配的な役割を果たす可能性がある。血液中のNEFAは、多くの臓器によって熱心に吸収され利用され、インスリンおよび摂食によって抑制され、エピネフリン14によって増加することができる。HFDの供給は血清NEFAレベルを変えない、ホルモンの手がかりが血清NEFAレベルの調節を支配することを示唆する。
口腔脂質クリアランス試験の解釈
経口投与された脂質は、腸内上皮細胞によって吸収され、血流中のリポタンパク質粒子に運ばれ、そこで末梢器官によって遊離され、使用される。リポプロテインリパーゼ活性の変化,末梢組織トリグリセリドの取り込み,酸化は血清トリグリセリドレベルのダイナミクスに影響を与えます。例えば、褐色およびベージュの脂肪細胞は熱産生のために脂肪酸を熱心に酸化する。冷たい暴露は、褐色およびベージュの脂肪細胞活性を有意に増加させ、トリグリセリド15の血漿クリアランスを加速する。この論文15に示すように、経口脂質内耐性クリアランス試験は、トリグリセリド代謝に対する冷た暴露の影響を評価するために極めて重要であった。
脂肪組織脂肪分解を標的とする化合物の評価
脂肪多項起の活性化は、交感神経系、内分泌因子、および様々な代謝産物によって伝達される。多くの化合物は、脂肪組織脂肪分解16、17を促進するために製薬会社によって開発に入れられてきた。マウスなどの前臨床動物モデルにおけるその有効性を評価することは、開発プロセスを促進するために重要です。ここでは、β3-アドレナリン受容体アゴニストCL 316,243を使用して、マウスが化合物にどのように反応するかを評価する方法と、マウスが異なる代謝状態で化合物に対して異なるレベルの感受性を示すかどうかを評価する例として使用します。例示的な結果に見られるように、CL 316,243の繰り返し使用は、マウスにおける治療に脱感作を引き起こした。CL 316,243 を使用して、急性治療に対するマウスの反応を評価する方法を説明しました。さらに重要なことに、この概念と設計は、脂肪組織脂質代謝を標的とする他の分子に容易に適用することができる。
制限
いくつかの選択された脂質種は、マウスの脂質代謝に関する限られた情報を提供します。尾部出血から入手可能な血清量が少ないため、このプロトコルは総コレステロールのみを測定し、これらのアッセイが大量の血液を必要とするため、HDL-CおよびLDL-Cを区別しません。マウスはCETPを欠く方法でユニークであるため、総コレステロールは良好な近似であり、マウスのHDL-Cは健康的な脂質プロファイルを示さないので、異なるリポタンパク質粒子でコレステロールを区別することによって得られる追加情報は制限される。
トリグリセリドレベルを含む血清脂質レベルは、通常、非常に動的な方法で作用する多くの器官による吸収および遠足の正味の効果である。結果を解釈するには、通常、1 つの変数を持つ実験用のセットアップが必要です。例示的な結果に示すように、C57BL/6JおよびC57BL/6NサブストレインのC57BL/6JとC57BL/6Nのサブストレインの間に脂質吸収または遠足に関する具体的な結論は作ることができない。しかし、引用された冷露試験15では、事前知識および時には仮定を使用して他の変数からの寄与を排除することができ、著者らは特定の組織にピン留めすることができ、褐色脂肪組織が強化されたトリグリセリドクリアランスに寄与することを発見した。
最後に、代謝は動的なプロセスです。脂質代謝経路における1つの代謝産物の変化は、全体の状態のスナップショットのみを提供する。流れを理解するには、同位体トレース技術を用いたより高度なフラックススタディが必要である。
要約すると、単純さは、このプロトコルのパワーと弱点の両方です。ここで提示する3つのアッセイは、特定の脂質代謝経路の研究のために設計されたものではなく、一般的な栄養および肥満研究における脂質代謝を評価するための初期スクリーニングまたは出発点を提供する。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この研究は、国立衛生研究所(NIH)、助成金R00-DK114498、および米国農務省(USDA)、助成金CRIS:3092-51000-062 Y.Z.によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20% Intralipid | Sigma Aldrich | I141 | |
| BD Slip Tip Sterile Syringes 1ml | Shaotong | B07F1KRMYN | |
| CL 316,243 Hydrate | Sigma-Aldrich | C5976 | |
| Curved Feeding Needles (18 Gauge) | Kent Scientific | FNC-18-2-2 | |
| Free Glycerol Reagent | Sigma Aldrich | F6428 | |
| Glycerol Standard Solution | Sigma | G7793 | |
| HR SERIES NEFA-HR(2)COLOR REAGENT A | Fujifilm Wako Diagnostics | 999-34691 | |
| HR SERIES NEFA-HR(2)COLOR REAGENT B | Fujifilm Wako Diagnostics | 991-34891 | |
| HR SERIES NEFA-HR(2)SOLVENT A | Fujifilm Wako Diagnostics | 995-34791 | |
| HR SERIES NEFA-HR(2)SOLVENT B | Fujifilm Wako Diagnostics | 993-35191 | |
| Matrix Plus Chemistry Reference Kit | Verichem | 9500 | |
| Micro Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-222-168 | |
| Microhematrocrit Capillary Tube, Not Heparanized | Fisher Scientific | 22-362-574 | |
| NEFA STANDARD SOLUTION | Fujifilm Wako Diagnostics | 276-76491 | |
| Phosphate Buffered Saline | Boston Bioproducts | BM-220 | |
| Thermo Scientific Triglycerides Reagent | Fisher Scientific | TR22421 | |
| Total Cholesterol Reagents | Thermo Scientifi | TR13421 |
References
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