JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Imunologia e Infecção

Échantillonnage et traitement du brossage nasal à l’aide de la vidéomicroscopie ciliaire numérique à grande vitesse – Adaptation à la pandémie de COVID-19

Published: November 07, 2020
doi:
10.3791/61949
, , , , , , , , ,
1Pneumology laboratory, I3 Group, GIGA Research Center,University of Liège, 2Department of ENT,University Hospital of Liège, 3Department for Occupational Safety and Health, Biosafety and Biosecurity Unit,University of Liège, 4Division of Respirology, Department of Pediatrics,University of British Columbia and British Columbia Children’s Hospital, 5Division of Cardiology, Department of Pediatrics,University Hospital of Liège, 6Department of Pneumology,University Hospital of Liège, 7Division of Respirology, Department of Pediatrics,University Hospital of Liège

Summary

Pour garantir une analyse fonctionnelle ciliaire réussie et de haute qualité pour le diagnostic de la DCP, une méthode précise et minutieuse d’échantillonnage et de traitement de l’épithélium respiratoire est essentielle. Afin de continuer à fournir des services de diagnostic de la DCP pendant la pandémie de COVID-19, le protocole de vidéomicroscopie ciliaire a été mis à jour pour inclure des mesures appropriées de contrôle des infections.

Abstract

La dyskinésie ciliaire primitive (DCP) est une ciliopathie mobile génétique, entraînant une maladie otosinopulmonaire importante. Le diagnostic de la DCP est souvent manqué ou retardé en raison de défis liés aux différentes modalités de diagnostic. La vidéomicroscopie ciliaire, utilisant la vidéomicroscopie numérique à grande vitesse (DHSV), l’un des outils de diagnostic de la DCP, est considérée comme la méthode optimale pour effectuer une analyse fonctionnelle ciliaire (CFA), comprenant l’analyse de la fréquence des battements ciliaires (CBF) et du diagramme de battement (CBP). Cependant, le DHSV ne dispose pas de procédures opérationnelles normalisées et publiées pour le traitement et l’analyse des échantillons. Il utilise également l’épithélium respiratoire vivant, un problème important de contrôle des infections pendant la pandémie de COVID-19. Afin de continuer à fournir un service de diagnostic pendant cette crise sanitaire, le protocole de vidéomicroscopie ciliaire a été adapté pour inclure des mesures adéquates de contrôle des infections.

Nous décrivons ici un protocole révisé pour l’échantillonnage et le traitement en laboratoire des échantillons respiratoires ciliés, en soulignant les adaptations apportées pour se conformer aux mesures de contrôle des infections COVID-19. Les résultats représentatifs de l’ACF provenant d’échantillons de brossage nasal obtenus chez 16 sujets sains, traités et analysés conformément à ce protocole, sont décrits. Nous illustrons également l’importance d’obtenir et de traiter des bandelettes ciliées épithéliales de qualité optimale, car les échantillons ne répondant pas aux critères de sélection de la qualité permettent maintenant la CFA, ce qui peut diminuer la fiabilité diagnostique et l’efficacité de cette technique.

Introduction

La dyskinésie ciliaire primitive (PCD) est une ciliopathie motile hétérogène héréditaire, dans laquelle les cils respiratoires sont stationnaires, lents ou dyskinétiques, entraînant une altération de la clairance mucociliaire et une maladie oto-sino-pulmonaire chronique 1,2,3,4. Les manifestations cliniques de la DCP sont la toux grasse chronique et la congestion nasale chronique débutant dès la petite enfance, les infections récurrentes ou chroniques des voies respiratoires supérieures et inférieures entraînant une bronchectasie, ainsi que l’otite moyenne et la sinusite récurrentes ou chroniques 5,6,7. Environ la moitié des patients atteints de DCP présentent des défauts de latéralité d’organe tels que situs inversus ou situs ambiguus. Certains patients présentent également des problèmes d’infertilité dus au sperme immotile chez les hommes et aux cils immotiles dans les trompes de Fallope chez les femmes 1,2,8. La DCP est rare, mais sa prévalence est difficile à définir et varie de 1:10 000 à 1:20 000 9,10. Cependant, la prévalence réelle de la DCP est considérée comme plus élevée en raison des difficultés de diagnostic et de l’absence de suspicion clinique. Les symptômes de la DCP imitent les manifestations respiratoires courantes d’autres affections respiratoires aiguës ou chroniques, et les difficultés diagnostiques liées à la confirmation du diagnostic sont bien connues, ce qui entraîne un traitement et un suivi inadéquats 2,5,9,11.

La vidéomicroscopie ciliaire, utilisant la vidéomicroscopie numérique à grande vitesse (DHSV), est l’un des outils de diagnostic de la DCP 4,8,12,13. Le DHSV est considéré comme la méthode optimale pour effectuer une analyse fonctionnelle ciliaire (CFA), comprenant l’analyse de la fréquence des battements ciliaires (CBF) et du diagramme de battement (CBP) 2,14,15,16. Le DHSV utilise un épithélium respiratoire vivant, généralement obtenu par brossage nasal13.

Compte tenu de l’épidémie actuelle de COVID-19, la confirmation d’un diagnostic de DCP est désormais encore plus importante, car les preuves suggèrent que la maladie respiratoire sous-jacente peut entraîner de pires résultats après une infection à COVID-19 17,18. Un service de diagnostic sûr et efficace de la DCP pendant la pandémie actuelle permettra également aux patients atteints de DCP confirmés de bénéficier de mesures de protection supplémentaires, par rapport à la population générale19.

La transmission de la COVID-19 se produit principalement par la propagation de gouttelettes20. Le potentiel élevé de transmission chez les patients asymptomatiques (ou peu symptomatiques) est suggéré par la charge virale élevée dans l’échantillon nasal20. De plus, si les particules virales deviennent aérosolisées, elles restent dans l’air pendant au moins 3 heures21. Par conséquent, les travailleurs de la santé respiratoire sont exposés à un réservoir élevé de charge virale lorsqu’ils prodiguent des soins cliniques et prélèvent des échantillons pour les techniques de diagnostic22. De plus, la manipulation d’échantillons respiratoires vivants expose le technicien à la contamination par la COVID-19. Alors que les recommandations de pratiques exemplaires pour les médecins respiratoires et les chirurgiens ORL qui soignent des patients atteints de COVID-19 sont mises en œuvre23, il y a un manque de recommandations pour effectuer le DHSV pendant la pandémie de COVID-19.

Afin de continuer à fournir un service de diagnostic de la DCP, tout en assurant la sécurité du travailleur de la santé (effectuant le prélèvement d’échantillons) et du technicien (effectuant le traitement des échantillons), le protocole de vidéomicroscopie ciliaire a dû être adapté pendant la pandémie de COVID-19. La technique de la vidéomicroscopie ciliaire est actuellement limitée au service de recherche et aux centres de diagnostic spécialisés, car le CFA nécessite une formation et une expérience approfondies. En outre, il existe actuellement un manque de normalisation et de procédures opérationnelles précises pour le traitement et l’analyse des échantillons à l’aide du DHSV 4,13.

L’objectif de cet article est de décrire les procédures opérationnelles normalisées pour le DHSV, en particulier les mesures de contrôle des infections et la sécurité lors de l’échantillonnage et du traitement de l’épithélium nasal vivant. Cela permettra de poursuivre le diagnostic et les soins de haute qualité de la DCP, malgré l’épidémie actuelle de COVID-19.

Protocol

L’approbation a été obtenue du comité d’éthique hospitalo-facultaire de Liège et du Département universitaire d’hygiène et de protection de la santé au travail. 1. Prélèvement d’épithélium cilié respiratoire Assurez-vous que les sujets sont exempts d’infection pendant au moins 4 à 6 semaines et exempts de médicaments nasaux et inhalés avant l’échantillonnage. Préparer la préparation M199 supplémentée : Supplément Cell Culture Medium 199 (M1…

Representative Results

Pour illustrer l’efficacité de la technique, nous présentons les résultats du CFA dans une série de 16 volontaires adultes en bonne santé (5 hommes, tranche d’âge 22-54 ans). Les échantillons de brossage nasal de 14 (4 hommes, tranche d’âge 24-54 ans) sur un total de 16 volontaires ont fourni suffisamment de bords épithéliaux appropriés qui répondaient aux critères de sélection nécessaires pour effectuer l’AFC. À partir de ces 14 échantillons de brossage nasal, un tota…

Discussion

Cet article vise à fournir une procédure opérationnelle standard pour la CFA utilisant des échantillons de brossage nasal, avec des ajustements effectués pour des considérations appropriées de contrôle des infections pendant la pandémie de COVID-19. Le diagnostic de la DCP est difficile et nécessite actuellement un panel de tests diagnostiques différents, selon les recommandations internationales, y compris la mesure nasale de l’oxyde nitrique, la CFA à l’aide du DHSV, l’analyse ultrastructurale ciliair…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous tenons à remercier Jean-François Papon, Bruno Louis, Estelle Escudier et tous les membres de l’équipe du centre de diagnostic PCD de Paris-Est pour leur disponibilité et leur accueil chaleureux lors de la visite de leur centre de diagnostic PCD, et les nombreux échanges. Nous remercions également Robert Hirst et tous les membres de l’équipe du centre PCD de Leicester pour leur accueil, leur temps, leurs conseils et leur expertise.

Materials

15 mL conical tubes FisherScientific 352096 15 ml High-Clarity Polypropylene Conical Tube with lid
Amphotericin B LONZA 17-836E Antifungal solution
Blakesley-weil nasal forceps NOVO SURGICAL E7739-12 Used to hold the brush to perform the nasal brushing
Bronchial cytology brush CONMED 129 Used for nasal brushing
Cotton swab NUOVA APTACA 2150/SG Used for COVID-19 testing
Digitial high-speed videomicroscopy camera IDTeu Innovation in motion CrashCam Mini 1510
Glass slide ThermoScientific 12372098 Microscope slides used to create the visualization chamber
Heated Box IBIDI cells in focus 10918 Used to heat the sample
Inverted Light microscope Zeiss AXIO Vert.A1
Lens Heater TOKAI HIT TPiE-LH Used to heat the oil immersion lens
Medium 199 (M199), HEPES TermoFisher Scientific 12340030 Cell Culture Medium
Motion Studio X64 IDT Motion version 2.14.01 Software
Oil FischerScientific, Carl Zeiss 11825153
Rectangular cover slip VWR 631-0145 Used to cover the visualization chamber
Spacer (Ispacer) 0.25 mm Sunjinlab IS203 Used for the creation of the hermetic closed visualization chamber
Square cover slip VWR 631-0122 Used for the creation of lab-built open visualization chamber
Streptomycin/Penicillin FisherScientific, Gibco 11548876 Antiobiotics solution
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Chilvers, M. A., Rutman, A., O’Callaghan, C. Ciliary beat pattern is associated with specific ultrastructural defects in primary ciliary dyskinesia. Journal of Allergy Clinical Immunology. 112 (3), 518-524 (2003).
  2. Werner, C., Onnebrink, J. G., Omran, H. Diagnosis and management of primary ciliary dyskinesia. Cilia. , 1-9 (2015).
  3. Kempeneers, C., Chilvers, M. A. To beat, or not to beat, that is question! The spectrum of ciliopathies. Pediatric Pulmonology. 53 (8), 1122 (2018).
  4. Lucas, J. S., et al. European Respiratory Society guidelines for the diagnosis of primary ciliary dyskinesia. The European Respiratory Journal. 49 (1), (2017).
  5. Knowles, M. R., Zariwala, M., Leigh, M. Primary Ciliary Dyskinesia. Clinics in chest medicine. 37 (3), 449-461 (2016).
  6. Shapiro, A. J., et al. Diagnosis, monitoring, and treatment of primary ciliary dyskinesia: PCD foundation consensus recommendations based on state of the art review. Pediatric Pulmonology. , (2016).
  7. Fitzgerald, D. A., Shapiro, A. J. When to suspect primary ciliary dyskinesia in children. Paediatric Respiratory Reviews. , (2016).
  8. Shoemark, A., Dell, S., Shapiro, A., Lucas, J. S. ERS and ATS diagnostic guidelines for primary ciliary dyskinesia: similarities and differences in approach to diagnosis. European Respiratory Journal. 54 (3), (2019).
  9. Mirra, V., Werner, C., Santamaria, F. Primary ciliary dyskinesia: An update on clinical aspects, genetics, diagnosis, and future treatment strategies. Frontiers in Pediatrics. 5, 1-13 (2017).
  10. Ardura-Garcia, C., et al. Registries and collaborative studies for primary ciliary dyskinesia in Europe. European Respiratory Journal Open Research. 6 (2), (2020).
  11. Leigh, M. W., et al. Clinical features and associated likelihood of primary ciliary dyskinesia in children and adolescents. Annals of the American Thoracic Society. , (2016).
  12. Chilvers, M. A., O’Callaghan, C. Analysis of ciliary beat pattern and beat frequency using digital high speed imaging: comparison with the photomultiplier and photodiode methods. Thorax. 55 (4), 314-317 (2000).
  13. Kempeneers, C., Seaton, C., Garcia Espinosa, B., Chilvers, M. A. Ciliary functional analysis: Beating a path towards standardization. Pediatric Pulmonology. 54 (10), 1627-1638 (2019).
  14. Barbato, A., et al. Primary ciliary dyskinesia: a consensus statement on diagnostic and treatment approaches in children. The European respiratory journal. 34 (6), 1264-1276 (2009).
  15. Raidt, J., et al. Ciliary beat pattern and frequency in genetic variants of primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 44 (6), 1579-1588 (2014).
  16. Kempeneers, C., Seaton, C., Chilvers, M. A. Variation of Ciliary Beat Pattern in Three Different Beating Planes in Healthy Subjects. Chest. 151 (5), 993-1001 (2017).
  17. Götzinger, F., et al. COVID-19 in children and adolescents in Europe: a multinational, multicentre cohort study. The Lancet Child & Adolescent Health. , (2020).
  18. Yang, J., et al. Prevalence of comorbidities and its effects in coronavirus disease 2019 patients: A systematic review and meta-analysis. International Journal of Infectious Diseases. 94, 91-95 (2020).
  19. Brough, H. A., et al. Managing childhood allergies and immunodeficiencies during respiratory virus epidemics – The 2020 COVID-19 pandemic: A statement from the EAACI-section on pediatrics. Pediatric Allergy and Immunology. 31 (5), 442-448 (2020).
  20. Zou, L., et al. SARS-CoV-2 Viral Load in Upper Respiratory Specimens of Infected Patients. The New England journal of medicine. 382 (12), 1177-1179 (2020).
  21. van Doremalen, N., et al. Aerosol and Surface Stability of SARS-CoV-2 as Compared with SARS-CoV-1. The New England journal of medicine. 382 (16), 1564-1567 (2020).
  22. Tran, K., Cimon, K., Severn, M., Pessoa-Silva, C. L., Conly, J. Aerosol generating procedures and risk of transmission of acute respiratory infections to healthcare workers: a systematic review. PloS one. 7 (4), 35797 (2012).
  23. Van Gerven, L., et al. Personal protection and delivery of rhinologic and endoscopic skull base procedures during the COVID-19 outbreak. Rhinology. 58 (3), 289-294 (2020).
  24. Marty, F. M., Chen, K., Verrill, K. A. How to Obtain a Nasopharyngeal Swab Specimen. New England Journal of Medicine. 382 (22), 76 (2020).
  25. Petruzzi, G., et al. COVID-19: Nasal and oropharyngeal swab. Head & Neck. 42, (2020).
  26. George, A., Prince, M., Coulson, C. Safe nasendoscopy assisted procedure in the post-COVID-19 pandemic era. Clinical Otolaryngology. , (2020).
  27. Hirst, R. A., et al. Culture of primary ciliary dyskinesia epithelial cells at air-liquid interface can alter ciliary phenotype but remains a robust and informative diagnostic aid. PLoS ONE. 9 (2), (2014).
  28. Jorissen, M., Willems, T., Van der Schueren, B. Ciliary function analysis for the diagnosis of primary ciliary dyskinesia: advantages of ciliogenesis in culture. Acta oto-laryngologica. 120 (2), 291-295 (2000).
  29. Thomas, B., Rutman, A., O’Callaghan, C. Disrupted ciliated epithelium shows slower ciliary beat frequency and increased dyskinesia. European Respiratory Journal. 34 (2), 401-404 (2009).
  30. Chilvers, M. A., Rutman, A., O’Callaghan, C. Functional analysis of cilia and ciliated epithelial ultrastructure in healthy children and young adults. Thorax. 58 (4), 333-338 (2003).
  31. Stannard, W. A., Chilvers, M. A., Rutman, A. R., Williams, C. D., O’Callaghan, C. Diagnostic testing of patients suspected of primary ciliary dyskinesia. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 307-314 (2010).
  32. Boon, M., et al. Primary ciliary dyskinesia: critical evaluation of clinical symptoms and diagnosis in patients with normal and abnormal ultrastructure. Orphanet Journal of Rare Diseases. 9 (1), 11 (2014).
  33. Armengot, M., Milara, J., Mata, M., Carda, C., Cortijo, J. Cilia motility and structure in primary and secondary ciliary dyskinesia. American Journal of Rhinology & Allergy. 24 (3), 175-180 (2010).
  34. Papon, J. F., et al. Quantitative analysis of ciliary beating in primary ciliary dyskinesia: a pilot study. Orphanet Journal of Rare Diseases. 7 (1), 78 (2012).
  35. Wallmeier, J., et al. Mutations in CCNO and MCIDAS lead to a mucociliary clearance disorder due to reduced generation of multiple motile cilia. Molecular and Cellular Pediatrics. 2, 15 (2015).
  36. Boon, M., et al. MCIDAS mutations result in a mucociliary clearance disorder with reduced generation of multiple motile cilia. Nature Communications. 5 (6), 4418 (2014).
  37. Shapiro, A. J., et al. Diagnosis of Primary Ciliary Dyskinesia. An Official American Thoracic Society Clinical Practice Guideline. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 197 (12), 24-39 (2018).
  38. Rubbo, B., et al. Accuracy of high-speed video analysis to diagnose primary ciliary dyskinesia. Chest. (19), 30205 (2019).
  39. Horani, A., Ferkol, T. W. Advances in the Genetics of Primary Ciliary Dyskinesia. Chest. 154 (3), 645-652 (2018).
  40. MacCormick, J., Robb, I., Kovesi, T., Carpenter, B. Optimal biopsy techniques in the diagnosis of primary ciliary dyskinesia. The Journal of Otolaryngology. 31 (1), 13-17 (2002).
  41. Jackson, C. L., et al. Accuracy of diagnostic testing in primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 47 (3), 837-848 (2016).
  42. Jackson, C. L., Goggin, P. M., Lucas, J. S. Ciliary Beat Pattern Analysis Below 37°C May Increase Risk of Primary Ciliary Dyskinesia Misdiagnosis. Chest. 142 (2), 543-544 (2012).
  43. Green, A., Smallman, L. A., Logan, A. C., Drake-Lee, A. B. The effect of temperature on nasal ciliary beat frequency. Clinical otolaryngology and allied sciences. 20 (2), 178-180 (1995).
  44. Clary-Meinesz, C. F., Cosson, J., Huitorel, P., Blaive, B. Temperature effect on the ciliary beat frequency of human nasal and tracheal ciliated cells. Biology of the Cell. 76 (3), 335-338 (1992).
  45. Smith, C. M., et al. ciliaFA: a research tool for automated, high-throughput measurement of ciliary beat frequency using freely available software. Cilia. 1 (1), 14 (2012).
  46. Sisson, J. H., Stoner, J. a., Ammons, B. a., Wyatt, T. a. All-digital image capture and whole-field analysis of ciliary beat frequency. Journal of Microscopy. 211, 103-111 (2003).
  47. Blanchon, S., et al. Deep phenotyping, including quantitative ciliary beating parameters, and extensive genotyping in primary ciliary dyskinesia. Journal of Medical Genetics. , (2019).
  48. Feriani, L., et al. Assessing the Collective Dynamics of Motile Cilia in Cultures of Human Airway Cells by Multiscale DDM. Biophysical Journal. 113 (1), 109-119 (2017).
  49. Sears, P. R., Thompson, K., Knowles, M. R., Davis, C. W. Human airway ciliary dynamics. American Journal of Physiology – Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (3), 170-183 (2013).
  50. Quinn, S. P., et al. Automated identification of abnormal respiratory ciliary motion in nasal biopsies. Science translational medicine. 7 (299), (2015).

Tags

Keywords: Nasal BrushingDigital High-speed Ciliary VideomicroscopyPrimary Ciliary DyskinesiaCOVID-19Diagnostic TestSamplingProcessingInfection ControlSensitivitySpecificityElectron MicroscopyGenetic TestingWeil-Blakesley Nasal ForcepsEpithelial StripsGlass SlideSpacer
check_url/pt/61949?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Bricmont, N., Benchimol, L., Poirrier, A., Grignet, C., Seaton, C., Chilvers, M. A., Seghaye, M., Louis, R., Lefebvre, P., Kempeneers, C. Nasal Brushing Sampling and Processing Using Digital High Speed Ciliary Videomicroscopy – Adaptation for the COVID-19 Pandemic. J. Vis. Exp. (165), e61949, doi:10.3791/61949 (2020).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image