Campionamento ed elaborazione della spazzolatura nasale mediante videomicroscopia ciliare digitale ad alta velocità – Adattamento alla pandemia COVID-19
Summary
Per garantire un’analisi funzionale ciliare di successo e di alta qualità per la diagnosi di PCD, è essenziale un metodo preciso e attento per il campionamento e il trattamento dell’epitelio respiratorio. Per continuare a fornire un servizio diagnostico PCD durante la pandemia COVID-19, il protocollo di videomicroscopia ciliare è stato aggiornato per includere adeguate misure di controllo delle infezioni.
Abstract
La discinesia ciliare primitiva (PCD) è una ciliopatia genetica mobile, che porta a una significativa malattia otosinopolmonare. La diagnosi di PCD è spesso mancata o ritardata a causa di sfide con diverse modalità diagnostiche. La videomicroscopia ciliare, che utilizza la videomicroscopia digitale ad alta velocità (DHSV), uno degli strumenti diagnostici per la PCD, è considerata il metodo ottimale per eseguire l’analisi funzionale ciliare (CFA), che comprende l’analisi della frequenza del battito ciliare (CBF) e del pattern di battito (CBP). Tuttavia, il DHSV manca di una procedura operativa standardizzata e pubblicata per l’elaborazione e l’analisi dei campioni. Utilizza anche l’epitelio respiratorio vivente, un significativo problema di controllo delle infezioni durante la pandemia di COVID-19. Per continuare a fornire un servizio diagnostico durante questa crisi sanitaria, il protocollo di videomicroscopia ciliare è stato adattato per includere adeguate misure di controllo delle infezioni.
Qui, descriviamo un protocollo rivisto per il campionamento e l’elaborazione di laboratorio di campioni respiratori ciliati, evidenziando gli adattamenti apportati per conformarsi alle misure di controllo delle infezioni COVID-19. Vengono descritti i risultati rappresentativi del CFA da campioni di spazzolatura nasale ottenuti da 16 soggetti sani, elaborati e analizzati secondo questo protocollo. Illustriamo anche l’importanza di ottenere e trattare strisce ciliate epiteliali di qualità ottimale, poiché i campioni che non soddisfano i criteri di selezione della qualità ora consentono CFA, riducendo potenzialmente l’affidabilità diagnostica e l’efficienza di questa tecnica.
Introduction
La discinesia ciliare primitiva (PCD) è una ciliopatia mobile eterogenea ereditaria, in cui le ciglia respiratorie sono stazionarie, lente o discineetiche, portando a compromissione della clearance mucociliare e malattia cronica oto-sino-polmonare 1,2,3,4. Le manifestazioni cliniche della PCD sono tosse umida cronica e congestione nasale cronica che inizia nella prima infanzia, infezioni ricorrenti o croniche del tratto respiratorio superiore e inferiore che portano a bronchiectasie e otite media e sinusite ricorrenti o croniche 5,6,7. Circa la metà dei pazienti con PCD presenta difetti di lateralità d’organo come situs inversus o situs ambiguus. Alcuni pazienti presentano anche problemi di infertilità dovuti allo sperma immobile negli uomini e alle ciglia immobili nelle tube di Falloppio nelle donne 1,2,8. La PCD è rara, ma la prevalenza è difficile da definire e varia da 1:10.000 a 1:20.000 9,10. Tuttavia, si ritiene che la reale prevalenza della PCD sia più elevata a causa delle difficoltà nella diagnosi e della mancanza di sospetto clinico. I sintomi della PCD imitano le manifestazioni respiratorie comuni di altre condizioni respiratorie acute o croniche e le sfide diagnostiche nel confermare la diagnosi sono ben note, portando a un trattamento e a un follow-up inadeguati 2,5,9,11.
La videomicroscopia ciliare, che utilizza la videomicroscopia digitale ad alta velocità (DHSV), è uno degli strumenti diagnostici per PCD 4,8,12,13. Il DHSV è considerato il metodo ottimale per eseguire l’analisi funzionale ciliare (CFA), comprendente l’analisi della frequenza del battito ciliare (CBF) e del pattern di battito (CBP) 2,14,15,16. DHSV utilizza epitelio respiratorio vivente, di solito ottenuto dalla spazzolatura nasale13.
Alla luce dell’attuale epidemia di COVID-19, la conferma di una diagnosi di PCD è ora ancora più importante in quanto l’evidenza suggerisce che la malattia respiratoria sottostante può portare a esiti peggiori dopo l’infezione da COVID-1917,18. Un servizio diagnostico di PCD sicuro ed efficiente durante l’attuale pandemia consentirà inoltre ai pazienti PCD confermati di beneficiare di misure protettive aggiuntive, rispetto alla popolazione generale19.
La trasmissione di COVID-19 avviene principalmente attraverso la diffusione delle goccioline20. L’alto potenziale di trasmissione da pazienti asintomatici (o minimamente sintomatici) è suggerito dall’elevata carica virale nel campione nasale20. Inoltre, se le particelle virali vengono aerosolizzate, rimangono nell’aria per almeno 3 ore21. Pertanto, gli operatori sanitari respiratori sono esposti a un elevato serbatoio di carica virale durante l’esecuzione di cure cliniche e raccolta di campioni per le tecniche diagnostiche22. Inoltre, la manipolazione di campioni respiratori viventi espone il tecnico alla contaminazione da COVID-19. Mentre le raccomandazioni sulle migliori pratiche per i medici respiratori e i chirurghi ORL che si prendono cura dei pazienti COVID-19 vengono implementate23, mancano raccomandazioni per l’esecuzione del DHSV durante la pandemia di COVID-19.
Al fine di continuare a fornire un servizio diagnostico PCD, garantendo al contempo la sicurezza dell’operatore sanitario (esecuzione della raccolta dei campioni) e del tecnico (esecuzione dell’elaborazione dei campioni), il protocollo di videomicroscopia ciliare ha dovuto essere adattato durante la pandemia di COVID-19. La tecnica della videomicroscopia ciliare è attualmente limitata ai servizi di ricerca e ai centri diagnostici specializzati, in quanto la CFA richiede una vasta formazione ed esperienza. Inoltre, attualmente, vi è una mancanza di standardizzazione e di una procedura operativa precisa per l’elaborazione e l’analisi dei campioni utilizzando DHSV 4,13.
Lo scopo di questo lavoro è quello di descrivere le procedure operative standard per il DHSV, con particolare riferimento alle misure di controllo delle infezioni e alla sicurezza durante il campionamento e il trattamento dell’epitelio nasale vivente. Ciò consentirà di continuare la diagnosi e l’assistenza alla PCD di alta qualità, nonostante l’attuale epidemia di COVID-19.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo documento mira a fornire una procedura operativa standard per CFA utilizzando campioni di spazzolatura nasale, con modifiche apportate per appropriate considerazioni sul controllo delle infezioni durante la pandemia COVID-19. La diagnosi di PCD è impegnativa e attualmente richiede un pannello di diversi test diagnostici, secondo le raccomandazioni internazionali, tra cui la misurazione dell’ossido nitrico nasale, CFA utilizzando DHSV, analisi ultrastrutturale ciliare mediante microscopia elettronica a trasmission…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare Jean-François Papon, Bruno Louis, Estelle Escudier e tutti i membri del team del centro diagnostico PCD di Paris-Est per la loro disponibilità e calorosa accoglienza durante la visita al loro centro diagnostico PCD e i numerosi scambi. Ringraziamo anche Robert Hirst e tutti i membri del team del centro PCD di Leicester per la loro accoglienza, il loro tempo, i consigli e la competenza.
Materials
| 15 mL conical tubes | FisherScientific | 352096 | 15 ml High-Clarity Polypropylene Conical Tube with lid |
| Amphotericin B | LONZA | 17-836E | Antifungal solution |
| Blakesley-weil nasal forceps | NOVO SURGICAL | E7739-12 | Used to hold the brush to perform the nasal brushing |
| Bronchial cytology brush | CONMED | 129 | Used for nasal brushing |
| Cotton swab | NUOVA APTACA | 2150/SG | Used for COVID-19 testing |
| Digitial high-speed videomicroscopy camera | IDTeu Innovation in motion | CrashCam Mini 1510 | |
| Glass slide | ThermoScientific | 12372098 | Microscope slides used to create the visualization chamber |
| Heated Box | IBIDI cells in focus | 10918 | Used to heat the sample |
| Inverted Light microscope | Zeiss | AXIO Vert.A1 | |
| Lens Heater | TOKAI HIT | TPiE-LH | Used to heat the oil immersion lens |
| Medium 199 (M199), HEPES | TermoFisher Scientific | 12340030 | Cell Culture Medium |
| Motion Studio X64 | IDT Motion | version 2.14.01 | Software |
| Oil | FischerScientific, Carl Zeiss | 11825153 | |
| Rectangular cover slip | VWR | 631-0145 | Used to cover the visualization chamber |
| Spacer (Ispacer) 0.25 mm | Sunjinlab | IS203 | Used for the creation of the hermetic closed visualization chamber |
| Square cover slip | VWR | 631-0122 | Used for the creation of lab-built open visualization chamber |
| Streptomycin/Penicillin | FisherScientific, Gibco | 11548876 | Antiobiotics solution |
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