Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Återkommande Escherichia coli urinvägsinfektion utlöst av Gardnerella vaginalis urinblåsans exponering hos möss

Published: December 4, 2020 doi: 10.3791/61967
Automatic Translation
1,2,6, 3,7, 1,2,4,8, 2,5
1Department of Molecular Microbiology, Washington University School of Medicine in Saint Louis, 2Center for Women’s Infectious Disease Research, Washington University School of Medicine in Saint Louis, 3Center for Cellular Imaging, Washington University School of Medicine in Saint Louis, 4Department of Obstetrics and Gynecology, Washington University School of Medicine in Saint Louis, 5Department of Pediatrics, Washington University School of Medicine in Saint Louis, 6Fred Hutchinson Cancer Research Center, 7TESCAN USA, Inc., 8University of California San Diego

Summary

En musmodell av uropatogen E. coli (UPEC) transuretral ympning för att etablera latenta intracellulära blåsreservoarer och efterföljande blåsexponering för G. vaginalis för att inducera återkommande UPEC UTI visas. Det demonstreras också uppräkning av bakterier, urincytologi och in situ-blåsfixering och bearbetning för svepelektronmikroskopi.

Abstract

Återkommande urinvägsinfektioner (rUTI) orsakade av uropatogen Escherichia coli (UPEC) är vanliga och kostsamma. Tidigare artiklar som beskriver modeller av UVI hos han- och honmöss har illustrerat procedurerna för bakteriell ympning och uppräkning i urin och vävnader. Under en initial urinvägsinfektion hos C57BL/6-möss etablerar UPEC latenta reservoarer inuti blåstepitelceller som kvarstår efter clearance av UPEC-bakteriuri. Denna modell bygger på dessa studier för att undersöka rUTI orsakad av uppkomsten av UPEC inifrån latenta blåsreservoarer. Den urogenitala bakterien Gardnerella vaginalis används som utlösare av rUTI i denna modell eftersom den ofta förekommer i kvinnors urogenitala kanaler, särskilt i samband med vaginal dysbios som har associerats med UTI. Dessutom beskrivs en metod för in situ-blåsfixering följt av svepelektronmikroskopi (SEM) -analys av blåsvävnad, med potentiell tillämpning på andra studier som involverar urinblåsan.

Introduction

Urinvägsinfektioner (UTI) innebär en betydande sjukvårdsbörda över hela världen och påverkar livskvaliteten för miljontals människor varje år, särskilt kvinnor1. Uropatogen Escherichia coli (UPEC) är den vanligaste orsaken till UTI1. Många patienter (cirka 20-30%) som utvecklar UTI kommer att uppleva en återkommande UTI (rUTI) inom 6 månader trots antibiotikamedierad clearance av den initiala infektionen2. Tyvärr lider så många som 5% av premenopausala kvinnor av 3 eller fler rUTI varje år 3,4. Sekventiella episoder av rUTI kan orsakas av persistens av samma UPEC-stam från indexfallet 5,6,7,8. Data från mänskliga prover och musmodeller tyder på att rUTI med samma stam kan orsakas av UPEC som bor i vilande reservoarer i urinblåsan. Hos människa påvisades UPEC i epitelceller och blåsbiopsier hos patienter med UTI 9,10,11,12,13. Studier på C57BL/6-möss har visat att vissa stammar av UPEC kan etablera vilande intracellulära reservoarer i urinblåsan, vilket detekteras genom fluorescensmikroskopi och genom homogenisering och odling av blåsvävnad, som bibehålls i månader efter upplösning av bakteriuri 14,15,16. Behandling av urinblåsan med medel som inducerar exfoliering av blåsepitelet (urotel), t.ex. protaminsulfat17 eller kitosan18, utlöser uppkomsten av UPEC från reservoarer för att orsaka rUTI. Dessa data tyder på att hos kvinnor som hyser UPEC-reservoarer från en tidigare infektion kan exponeringar för urinblåsan som leder till urotelial exfoliering utlösa rUTI.

Det finns allt fler bevis för att den vaginala mikrobiotan bidrar till urinvägsinfektion19,20. Gardnerella vaginalis är en frekvent medlem av både vaginal och urin mikrobiota 21,22,23,24,25,26,27,28,29. I slidan är närvaron av höga nivåer av G. vaginalis associerad med en mikrobiell dysbios som kallas bakteriell vaginos (BV), som drabbar ~ 30% av kvinnorna 30,31,32. Kvinnor med BV löper en högre risk att uppleva UVI jämfört med kvinnor med en vaginal gemenskap domineras av Lactobacillus 33,34,35,36,37. I musmodeller orsakar G. vaginalis epitelial exfoliering både i slidan38 och i urinblåsan39. I C57BL/6-möss som hyser UPEC-blåsreservoarer resulterar två sekventiella blåsexponeringar för G. vaginalis - men inte för PBS - i återuppkomst av UPEC från reservoarer för att orsaka UPEC rUTI. Uppkomsten framgår av uppkomsten av UPEC-titrar i urinen från möss som tidigare hade löst UPEC-bakteriuri och en efterföljande minskning av UPEC-blåshomogenattitrar vid avlivning jämfört med PBS-exponerade kontrolldjur39. Intressant nog finns det inte en varaktig kolonisering av G. vaginalis i urinblåsan. I de allra flesta fall är två korta exponeringar, var och en med mindre än 12 (h) livskraftig G. vaginalis i urinen, tillräckliga för att framkalla urotelial exfoliering och främja rUTI.

Detta protokoll beskriver en musmodell av rUTI orsakad av UPEC som bor i intracellulära blåsreservoarer, med användning av G. vaginalis blåsinokulering för att utlösa återfall. Framstegen som uppnås med denna modell är att G. vaginalis är en kliniskt relevant biologisk utlösare av rUTI jämfört med tidigare använda kemiska medel. Vidare möjliggör den relativt kortlivade överlevnaden av G. vaginalis i musens urinvägar undersökning av effekterna av övergående mikrobiella exponeringar på urotel, vilket kan inträffa efter sexuell aktivitet. Förutom att beskriva rUTI-modellen beskriver detta protokoll också metoder för urincytologi och in situ-urinblåsfixering och avbildning av urotelet genom svepelektronmikroskopi (SEM).

Detta protokoll för G. vaginalis-inducerad återkommande UPEC UTI använder UPEC-stam UTI89 med en kanamycinresistenskassett (UTI89kanR)40. Inte alla stammar av UPEC som testades kunde bilda intracellulära bakteriesamhällen under det akuta infektionsstadiet hos möss41 och det är ännu inte känt om alla stammar av UPEC har förmågan att bilda latenta intracellulära reservoarer. Reservoarbildning bör bekräftas före användning av andra UPEC-stammar i modellen. Detta protokoll använder ett spontant streptomycinresistent G. vaginalis-isolat , JCP8151BSmR38. Induktion av rUTI av JCP8151BSmR kräver två sekventiella G. vaginalis-inokuleringar , givet antingen 12 timmar eller 7 dagar (d) med39 mellanrum. Huruvida andra G. vaginalis-stammar inducerar exfoliering och/eller UPEC rUTI återstår att bestämma med denna modell. Det är viktigt att använda UPEC- och G. vaginalis-stammar med känd antibiotikaresistens (såsom kanamycin eller spektinomycin för UPEC och streptomycin för G. vaginalis) eftersom antibiotika kan läggas till agarplattor för att förhindra tillväxt av endogen musmikrobiota som annars kan störa uppräkningen av kolonibildande enheter (CFU) för att övervaka infektion. Detta är särskilt viktigt för odling av urinprover, eftersom musurin ofta innehåller andra bakterier som kan växa över på odlingsplattor utan antibiotika. Ursprunget till dessa endogena bakterier i musurin är okänt men återspeglar sannolikt periuretrala och urogenitala bakterier som plockas upp under urinuppsamlingen.

G. vaginalis är en fakultativ anaerob bakterie och därför beskriver detta protokoll växande G. vaginalis JCP8151BSmR i en anaerob kammare. Om en anaerob kammare inte är tillgänglig kan andra metoder för att upprätthålla anaeroba tillväxtförhållanden (t.ex. en GasPak-påse i en lufttät behållare) användas. Alternativt kommer vissa stammar av G. vaginalis (inklusive JCP8151BSmR) att växa i en standard vävnadsodlingsinkubator (5% CO2). Precis som användning av andra G. vaginalis-stammar än JCP8151BSmR kräver testning för att säkerställa att bakterierna beter sig på samma sätt i denna modell, kräver förändrade tillväxtförhållanden empirisk bestämning av ideala varaktigheter för odling (på plattor och i vätska) och optisk densitet (OD) 600 ekvivalenter för att uppnå önskade livskraftiga inokulumkoncentrationer. Dessutom är det inte känt om tillväxtförhållanden påverkar patobiologin hos G. vaginalis.

Slutligen, när man överväger om man ska använda denna modell, bör forskare vara medvetna om att det kan kräva ett större antal djur per grupp än typiska UTI-musmodeller. Detta beror delvis på att induktion av rUTI kräver att mössen löser UPEC-bakteriuri som orsakas av den initiala infektionen i urinblåsan. Således ingår inte någon mus som misslyckas med att rensa bakteriuri (en fenotyp som vanligtvis indikerar pågående njurinfektion) i rUTI-fasen av protokollet. Antalet möss som behövs för att driva dessa studier påverkas också av graden av "spontan" UPEC-uppkomst i urinen (12-14% i genomsnitt). Slutligen har olika musstammar olika benägenheter att utveckla kronisk bakteriuri kontra intracellulär reservoarbildning42,43. Om andra musstammar än C57BL/6 används i denna modell måste det bekräftas att djuren utvecklar vilande UPEC intracellulära reservoarer.

Protocol

Washington University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) godkände alla musinfektioner och procedurer som en del av protokollnummer 20170081, som löpte ut 06/09/2020, och 20-0031, som löper ut 03/18/2023. Övergripande vård av djuren överensstämde med The Guide for the Care and Use of Laboratory Animals från National Research Council och USDA Animal Care Resource Guide. Eutanasiprocedurer överensstämmer med AVMA-riktlinjerna för eutanasi av djur: 2020-utgåvan.

Figure 1
Figur 1. Schematisk för musmodell. Tidslinjen markeras för att återspegla faserna eller procedurerna för modellen som beskrivs i protokollet. Fas 1 (orange): Etablering av intracellulära UPEC-reservoarer. Möss inokuleras transuretralt med UPEC och urinprover samlas in och övervakas för clearance av bakteriuri. Endast möss som rensar bakteriuri fortsätter till de efterföljande faserna. Fas 2 (grön): Urinblåsans exponering för G. vaginalis. Möss inokuleras transuretralt med G. vaginalis två gånger. Tiden mellan de två sekventiella exponeringarna är antingen 12 timmar (övre panelen) eller 1 vecka (wk; nedre panelen), beroende på önskad nedströmsanalys. Fas 3 (gul): UPEC rUTI. Urin samlas in dagligen efter G. vaginalis exponering och övervakas för UPEC bakteriuri. Dessutom kan blåsor och njurar samlas in vid den experimentella slutpunkten för att mäta UPEC-vävnadstitrar. I 1 wk-exponeringsmodellen återspeglas G. vaginalis-inducerad uppkomst av UPEC från intracellulära reservoarer och efterföljande clearance från urinvägarna också i en minskning av UPEC-blåsvävnadstitrar (jämfört med PBS-exponerade möss, se figur 3D). Denna minskning av blåstiter var inte tydlig i 12-timmars exponeringsmodellen, förmodligen för att mer tid krävs för att tillräcklig reservoaruppkomst och clearance ska inträffa för att avsevärt minska vävnadstitrar. Procedur A: Urincytologi utförs vanligtvis 1 dpi (eller till och med tidigare) under fas 1 för att undersöka akut UPEC-infektion och under fas 3 för att bedöma urinens PMN-innehåll, vilket korrelerar med UPEC-uppkomst. Urinprover som samlats in vid andra tidpunkter kan analyseras på liknande sätt. Förfarande B: Blåsskanningselektronmikroskopi (SEM) för att undersöka urotelial exfoliering utförs vanligtvis i 12-h-modellen vid 3 h efter den andra G. vaginalis-exponeringen (15 h efter administrering av den första exponeringen vid tidpunkt 0). Andra tidpunkter kan också bedömas, såsom 6-24 timmar efter UPEC-ympning som visas i fas 1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

1. Upprätta UPEC vilande intracellulära reservoarer hos möss

  1. Förbered urinkatetrar (se 44,45,46,47 för videor av detta steg).
    1. Gänga 30 Gauge nålar med en längd av PE10-slang som sträcker sig från nålbasen till flera mm bortom nålspetsen. Var försiktig så att du inte punkterar slangen med nålspetsen. Alternativt kan du använda pediatriska intravenösa kanyler46.
    2. Placera beredda katetrar i en petriskål och sterilisera med UV-ljus i minst 30 minuter. Byt ut petriskålslocket och säkra för förvaring tills det behövs.
  2. Förbered UPEC-inokulum (dag -3 till 0)
    1. Dag -3: Streak UTI89kanR från -80 °C frysfond på en Luria-Bertani (LB) agarplatta. Inkubera platta vid 37 °C i 18-24 timmar.
      OBS: Det är inte nödvändigt att tillsätta kanamycin till inokulumtillväxtmediet eftersom kanamycinresistensen är stabilt integrerad i UTI89kanR.
    2. Dag -2: Inokulera 20 ml LB-buljong i en steril 125 ml kolv med en enda koloni av UTI89kanR. Använd inte en mindre kolv eftersom denna odlingsmetod är viktig för att inducera uttryck av UPEC typ 1 pilus som är nödvändig för vidhäftning av urinblåsan.
    3. Inkubera statiskt (utan att skaka) vid 37 °C i 18-24 timmar. Tillsätt inte antibiotika till tillväxtmediet. Använd endast färska kolonier på LB-plattor (18-24 h gamla) för att starta flytande kulturer.
    4. Dag -1: Subkultur UTI89kanR genom att avlägsna 20 μL kultur (snurra försiktigt kolven för att återsuspendera sedimenterade bakterier) och tillsätt till 20 ml färsk LB-buljong i en steril 125 ml kolv. Inkubera som i steg 2, med undantag för en fast varaktighet på 18 timmar. Tillsätt inte antibiotika till tillväxtmediet.
    5. Dag 0: Överför hela kulturen till ett 50 ml rör och snurra vid 3200 × g i en bordscentrifug i 10 minuter till pelletsbakterier. Aspirera supernatant och återsuspendera bakteriepelleten i 10 ml PBS.
    6. Tillsätt 100 μL av den koncentrerade bakteriesuspensionen från steg 4 till 900 μL PBS i en kyvett och bestäm den optiska densiteten vid 600 nm (OD600) med hjälp av en spektrofotometer som har tömts med PBS. Multiplicera spektrofotometervärdet med 10 (för att ta hänsyn till utspädningen) för att bestämma OD600 för suspensionen (OD-suspension).
    7. För att uppnå den önskade inokulumkoncentrationen på 1 x 107 CFU i 50 μL, späd (eller koncentrera) UTI89kanR-suspensionen med följande ekvation, där den önskadeOD-inokulatet är 0,35 (värdet kan variera för andra UPEC-stammar) och Y är den volym inokulum som krävs (100 μL per mus för att möjliggöra extra för att eliminera bubblor och fylla katetrarna):
      X ml xOD-suspension = Y ml xOD-inokulum
      Om till exempelOD-upphängningsvärdet är 4,7 och 5 ml inokulum krävs:
      X ml × 4,7 = 5 × 0,35
      X = (5 × 0,35) / 4,7
      X = 0,372 ml
      Tillsätt därför 372 μl bakteriesuspension för att göra 5 ml (slutlig volym)
    8. Använd en flerkanalig pipett för att göra 1:10 seriella utspädningar av inokulatet ut till 10-6 i steril PBS i en 96-brunnsplatta. Placera fem 10 μL replikat av alla 6 utspädningarna på en LB- och LB+kan-platta, låt fläckarna torka och inkubera vid 37 °C över natten. LB-plattan utan antibiotika används för att säkerställa att inokulatet inte förorenades av en annan organism (vilket skulle visas som en ytterligare kolonimorfologi som inte finns på kan-antibiotikavalsplattan). Båda platttyperna ska ge samma resultat.
      OBS: Plattorna ska få torka på bänkskivan i en dag före användning så att de absorberar den pläterade vätskan utan att fläckar samlas.
    9. Räkna det totala antalet kolonier på alla ställen i utspädningen med urskiljbara kolonier och använd värdet för att beräkna den faktiska inokulumdosen som används i varje experiment. Lita inte bara på OD600-värdena .
  3. Inokulera UTI89kanR i blåsorna på sövda honmöss (dag 0)
    OBS: Videoinspelningar av denna procedur har publicerats tidigare44,46. Se dessa papper för en mer grundlig beskrivning. Se avsnitt 5 i detta protokoll för mer information om muskateterisering.
    1. Bedöva möss med isofluraninhalation enligt IACUC-godkända metoder.
    2. I väntan på att möss ska bli sövda fyller du tuberkulinsprutan med UTI89 kanR-inokulum och fäster sedan en beredd kateter. Tryck ner kolven för att tömma luft från katetern och dutta sedan katetern i sterilt kirurgiskt smörjmedel.
    3. Placera musen på ryggen och bekräfta bedövning genom att klämma fast musens fotplatta och observera frånvaron av en reflex eller ett svar. Lokalisera urinblåsan (känns som en ärta i underlivet) mellan pekfingrarna på varje hand. Uttryck urin genom att flytta fingrarna mot varandra för att applicera ett försiktigt klämtryck på urinblåsan.
    4. Sätt in katetern genom musens urinrör i urinblåsan och leverera långsamt 50 μl inokulum.
    5. Vänta några sekunder och ta sedan försiktigt bort katetern genom att dra rakt ut. Sätt tillbaka musen i buret och övervaka tills den återhämtar sig från anestesi.
    6. Upprepa steg 1.3.1 - 1.3.5 med ytterligare möss, byt kateter mellan varje bur (5 möss). Om så önskas kan samma procedur användas för att inokulera en kontrollgrupp av möss med PBS, till exempel för att visa en annan stam av G. vaginalis elicits rUTI (över spontan / bakgrundsnivå).

2. Övervakning av clearance av UPEC-bakteriuri (dag 1 till 28)

OBS: Video av urinuppsamlingsproceduren har publicerats tidigare44.

  1. Samla urin (minst 10 μl) från alla möss genom palpation av urinblåsan enligt beskrivningen44 vid 1 d efter infektion och varje vecka i 4 wk (7, 14, 21 och 28 d efter infektion). Urin bör odlas inom några timmar efter insamling för att övervaka UPEC-infektion. Förvara urinen vid 4 °C tills den är pläterad. Urin kan också användas för cytologi (se avsnitt 4). Ibland om blåsan är mycket inflammerad kan 10 μL urin inte erhållas; i detta fall kan PBS tillsättas upp till 10 μL, men urinbakteriella titer- och cytologipoängen måste justeras i enlighet därmed (t.ex. om endast 5 μL urin samlas in och 5 μL PBS tillsätts, multiplicera titrar och poäng med 2).
  2. Med en flerkanalig pipett gör du 1:10 seriella utspädningar till 10-6 i steril PBS i en 96-brunnsplatta. Använd en P10 flerkanalspipett för att upptäcka 10 μl av alla 6 utspädningar från kolumn 1 i vertikal riktning på vänster kant på en LB-platta som innehåller den relevanta antibiotiska urvalsmarkören. Kassera tips.
  3. Upprepa plätering med de återstående proverna (kolumn 2, sedan kolumn 3, etc.). En enda platta rymmer 5 prover sida vid sida. Detta ger en platta med en 5 × 6-punktsmatris, med ökande utspädningar uppifrån och ner och ökande provnummer från vänster till höger (figur 2A).
  4. Låt fläckarna torka på bänkskivan och inkubera sedan vid 37 °C över natten. Nästa dag räknar du antalet kolonier på den minst utspädda plats där kolonierna är distinkta (figur 2B) och använder detta tal för att beräkna CFU / ml:
    Antal kolonier i enstaka urinfläck × utspädningsfaktor × 100 = CFU/ml urin
  5. Plotta UTI89kanR-urintiter med hjälp av grafprogramvara (figur 2C). Identifiera möss som inte har någon detekterbar UTI89kanR i urinen vid 28 d (~ 65-80% av C57BL / 6 möss). Dessa möss har vilande intracellulära reservoarer och används i den efterföljande experimentfasen för att undersöka induktion av återkommande UTI. De med bakterier i urinen vid 28 d ingår inte i de efterföljande stegen.

3. Urinblåsans exponering för G. vaginalis

  1. Tilldela möss till exponeringsgrupper (dag 29). Det primära målet med detta steg är att undvika att ha alla möss med mer långvarig bakteriuri tillsammans i samma exponeringsgrupp, eftersom det är okänt om detta påverkar sannolikheten för rUTI.
    1. Med hjälp av urin-CFU-data (figur 2D) kategoriserar du mössen baserat på den tidpunkt då UTI89kanR-bakteriuri inte längre var detekterbar (figur 2E).
    2. Randomisera mössen från varje kategori till antingen G. vaginalis eller PBS inokuleringsgrupper; t.ex. hälften av mössen som rensade före dag 7 får G. vaginalis och hälften får PBS; hälften av mössen som rensade mellan dag 8 och 14 kommer att få G. vaginalis och hälften kommer att få PBS, etc. (som i figur 2E).
  2. Förbered G. vaginalis inokulum (alla steg utförs i en anaerob kammare)
    OBS: Ideala odlingsinkubationstider varierar mellan olika stammar av G. vaginalis, med vissa stammar som går in i den stationära fasen och till och med börjar dö snabbare än andra. Detta är särskilt viktigt med tanke på att dödade G. vaginalis (JCP8151B) inte kunde utlösa rUTI39. Således bör inkubationstiderna bestämmas empiriskt för en given stam innan experiment utförs på möss. Det är okänt om andra/alla stammar av G. vaginalis kommer att utlösa samma effekter i denna modell.
    1. Streak G. vaginalis stam från -80 ° C fryslager på en NYCIII-platta (utan antibiotika). Inkubera plattan vid 37 °C anaerobt i 24 timmar.
    2. I den anaeroba kammaren inokulerar du 5 ml anaerobt NYCIII-medium med en 1 μL slinga av celler (en enda koloni är otillräcklig) från NYCIII-plattan och inkuberar kultur statiskt vid 37 ° C under anaeroba förhållanden i 18 timmar. Inkludera inte antibiotika i tillväxtmediet.
  3. Bestäm OD600 av kulturen med hjälp av en spektrofotometer.
    1. Centrifugera en definierad volym (X) kultur vid 9600 × g i 1 min och aspirera media. Beräkna volymen (Y) av PBS för att suspendera pelleten igen för att uppnå önskad inokulum OD för att uppnå 108 CFU i 50 μL med hjälp av följande ekvation:
      X ml ×OD-kultur = Y ml ×OD-inokulumlösning för Y
      Y = (X ml ×OD-kultur) /OD-inokulum
      OBS:OD-inokulatet för JCP8151BSmR är 5 men detta måste bestämmas empiriskt för andra G. vaginalis-stammar . Till exempel, om man snurrar 3 ml av en JCP8151BSmR över natten flytande kultur medOD-kultur = 2,0: Y = (3 ml × 2,0) / 5,0; därför återsuspendera pellets i 1,2 ml PBS
    2. Resuspendera bakteriepelleten i PBS till önskad koncentration. Späd ut inokulumet seriellt (som beskrivs i CFU-pläteringsprotokollet ovan) för att bestämma den faktiska inokulumdosen som har använts i varje experiment. Lita inte bara på OD-värdena.
  4. På dag 29-31 efter UPEC-ympning, inokulera bedövade möss med G. vaginalis eller PBS enligt beskrivningen i steg 1.3 ovan. En PBS-kontrollgrupp är nödvändig, eftersom kateterisering av urinblåsan möjligen kan inducera skador och urotelial exfoliering som kan framkalla en viss grad av UPEC-reservoaråterkomst. PBS-inokulerade möss fungerar därför som den kontroll som G. vaginalis-inokulerade möss jämförs med.
    OBS: Den slutliga UPEC-bakteriuribestämningen vid 28 d kräver inkubation över natten av CFU-plattan. Därför är det tidigaste detta steg kan utföras 29 dagar efter den första UPEC-ympningen. Vid behov kan exponeringen ges så sent som dag 31. Forskare bör vara konsekventa mellan experimenten.
  5. Upprepa inokulumpreparatet för att administrera en andra G. vaginalis (eller PBS-kontroll) ympning vid önskad tidpunkt, såsom 12 h eller 1 wk efter den första inokuleringen. En andra exponering är nödvändig eftersom en enda ympning med G. vaginalis inte resulterar i signifikant UPEC-uppkomst39.

4. Övervakning av återkommande UTI vid UPEC

  1. Samla urin från möss vid önskade tidpunkter efter varje G. vaginalis-ympning (1, 2 och 3 d efter ympning rekommenderas).
    1. Seriellt utspädd och platt urin på selektiva plattor (t.ex. LB + kanamycin) för att bestämma UTI89kanR CFU / ml. Om så önskas kan urinutspädningar också pläteras på selektiva plattor (t.ex. NYCIII + 1 mg / ml streptomycin) för att bestämma G. vaginalis CFU / ml. Emellertid, G. vaginalis JCP8151BSmR rensades från urinen hos de flesta möss med 12 h 39. Därför skulle tidigare tidpunkter vara nödvändiga för att upptäcka G. vaginalis hos de flesta möss.
  2. Vid den experimentella slutpunkten (t.ex. 3 d efter den andra G. vaginalis-inokuleringen), offra mössen enligt godkända metoder (t.ex. cervikal dislokation under isoflurananestesi eller CO2-inandning) och samla blåsor och njurar för CFU-uppräkning, som beskrivits tidigare 44,46.

5. Urin cytologi

OBS: Denna procedur kan utföras när som helst vid vilken tidpunkt visualisering av cellerna och / eller bakterierna som finns i urinen önskas. Som anges i figur 1 utförs urincytologi vanligtvis vid 1 dpi (eller till och med tidigare) under fas 1 för att undersöka akut UPEC-infektion och under fas 3 för att bedöma förekomsten av polymorfonukleära (PMN) celler i uriner som visar UPEC-uppkomst.

  1. Tillsätt 10 μL urin till 90 μL PBS i en cytofunnelkassett med bifogat filter och glid. (Den enklaste metoden är att använda återstoden av 1:10-utspädningarna från 96-brunnsplattan som används för urinodling; dessa prover kan användas upp till 24 timmar efter urinodling om de förvaras vid 4 °C). Placera kassetterna i cytocentrifugen och snurra vid 600-800 x g i 6 min med hög acceleration.
  2. Ta bort diabilder och låt torka över natten. Nästa dag, fläck med ett hematologifärgningssats (t.ex. Wrights, Giemsa, inklusive fixativ) enligt tillverkarens protokoll.
  3. Analysera bilderna med ljusmikroskopi för närvaron av PMN och epitelceller. Om så önskas kan dessa poängsättas med hjälp av ett kvalitativt poängmått baserat på överflödet av varje celltyp som finns i varje kraftfullt synfält (t.ex. 0 = ingen, 1 = få, 2 = måttlig, 3 = robust). Se till att individen som analyserar bilderna är blindad för experimentgrupperna för att minimera potentiell bias.

6. Avbildning av blåsor genom svepelektronmikroskopi

OBS: Denna procedur kan utföras när som helst vid vilken visualisering av urotelet önskas. Som anges i figur 1 (lila lådor) visualiseras UPEC-uroteliala interaktioner bäst mellan 6 h och 24 h efter UPEC-ympning under reservoarbildningsfasen, och urotelial exfoliering som utlöses av G. vaginalis visualiseras bäst mellan 3 h och 12 h efter den andra G. vaginalis-exponeringen .

  1. In situ blåsfixering
    1. Förbered fixeringsmedel omedelbart före urinblåsans skörd genom att tillsätta glutaraldehyd (2,5% slutlig) och paraformaldehyd (2% slutlig) i 0,15 M natriumkacodylatbuffert med 2 mMCaCl2 vid pH 7,4. Använd paraformaldehyd och glutaraldehyd från nyöppnade glasampuller, eftersom båda fixeringsmedlen oxiderar över tid i öppnade behållare.
      VARNING: Glutaraldehyd är giftigt, andningsirriterande och frätande; paraformaldehyd är brandfarligt, cancerframkallande, irriterande och reproduktivt toxin; natriumkacodylat är giftigt och cancerframkallande.
    2. För att göra 50 ml fixeringslösning, tillsätt 6,25 ml 16% paraformaldehyd, 2 ml 50% glutaraldehyd och 16,75 ml ultrarent vatten till 25 ml av en 0,3 M lösning av natriumkacodylat vid pH 7,4 med 4 mM CaCl2.
    3. Värm det beredda fixeringsmedlet till 37 °C innan det administreras till blåsorna.
    4. Fyll tuberkulinglidspetssprutan med fixeringsmedel och fäst en kateter i änden, avfasad mot motsatta sprutmarkeringar. Klipp av överskottsslangen 1-2 mm från nålens ände, var försiktig så att du inte exponerar nålspetsen. Vrid sprutan för att ta bort bubblor och tryck kolven till tom luft och fyll katetern med fixeringsmedel över ett mikrocentrifugrör för att samla upp eventuella fixeringsmedel för korrekt bortskaffande.
    5. Bedöva och offra musen med en godkänd metod (t.ex. cervikal dislokation under anestesi). Placera musen på dissekerande yta med benen säkrade (med gummiband eller stift). Öppna musens bäckenområde med pincett och en kirurgisk sax för att exponera blåsan. Tryck försiktigt undan det intilliggande fettet men lämna blåsan på plats.
    6. Håll sprutan med den dominerande handen med nålen pekande nedåt och nålfasningen och sprutmarkeringarna vända bort från dig. Doppa kateterspetsen i sterilt smörjmedel.
    7. Placera kateterspetsen vid urinrörsöppningen och håll bort sprutpipan placerad i 30-45° vinkel över muskroppen.
    8. Applicera nedåttryck med en mycket liten medurs rörelse med spetsen och sätt försiktigt in katetern i urinröret. När kateterspetsen kommer in i urinröret, gångjärn sprutan mot musens svans medan du fortsätter att skjuta katetern längre in i urinröret tills sprutröret är parallell med arbetsytan. Hela kateternålaxeln (exklusive basen) ska komma in i musen och placera kateterspetsen i blåsans lumen.
    9. Leverera långsamt 50-80 μL fixativ, vilket får urinblåsan att blåsa upp som en ballong. Håll katetern på plats och lyft sprutan något och luta spetsen uppåt.
    10. Med den andra handen öppnar du en hemostat och skjuter en spets under kateternålen vid urinrörets korsning. Stäng delvis hemostaten tills den bara kommer i kontakt med nålen.
    11. Skjut försiktigt ut kateternålen ur urinblåsan samtidigt som du klämmer fast och låser hemostaten helt för att förhindra förlust av fixeringsmedlet.
    12. Greppa hemostaten så att den är parallell med arbetsytan med blåsan vilande ovanpå. Lyft upp försiktigt och skär försiktigt under hemostaten (motsatt sida av blåsan) för att ta bort blåsan med hemostaten fortfarande fäst.
    13. Placera urinblåsan och fäst hemostat i ett Falcon-rör som innehåller uppvärmt fixeringsmedel. Se till att blåsan är helt nedsänkt i vätskan och inte pressad mot rörets väggar. Inkubera vid 4 °C i 24 timmar.
  2. Blåsbehandling och avbildning med svepelektronmikroskopi (SEM)
    1. Saaritera blåsan med ett rengjort, dubbelsidigt rakblad och gör ett andra snitt som tangerar hemostaten för att frigöra blåsan. Detta resulterar i 2 halvblåsans "koppar". Om det finns några kvarvarande fettkuddar på utsidan av urinblåsan, ta försiktigt bort dem.
    2. Skölj blåshalvorna tre gånger (10 min vardera) i natriumkacodylatbuffert (0,15 M, pH 7,4).
    3. Färga vävnaden med 1% osmiumtetroxid i 0,15 M kakodylatbuffert i 1 timme vid rumstemperatur. Osmium är känsligt för ljus; Utför därför detta steg med färgningskärlet inslaget i folie för att upprätthålla en mörk miljö.
      VARNING: Osmiumtetroxid är giftigt och frätande för huden. Gör detta steg i dragskåpet med handskar.
    4. Skölj blåshalvorna tre gånger (10 min vardera) i ultrarent vatten. Under dessa steg kan osmicated olja någon gång ses på ytan av vattnet. Aspirera eller transportera bort detta för att förhindra kontaminering under torkningsstegen.
    5. Dehydrera vävnader genom nedsänkning i en graderad etanolserie (50, 70, 90, 100 och 100%) i 10 minuter vardera.
    6. Torka den fasta vävnaden med en kritisk punkttork som utför 12 CO2-utbyten med den långsammaste hastigheten. Ställ in alla ytterligare inställningar på långsam, förutom ventilationssteget som är inställt på snabbt.
    7. Skär varje blåshalva igen med en ren dubbelsidig rakhyvel för att generera totalt 4 bitar för att minska provets krökning för effektivare beläggning, för att underlätta avbildning i SEM och för att exponera vävnad som kan ha krullats under torkning.
    8. Fäst blåsbitarna på en ledande kolhäftande flik på en aluminiumstubb och måla en liten mängd silverlim runt bottenkontakten med en tandpetare, var noga med att förhindra att överflödigt lim transporteras på blåsans inre yta.
    9. Använd en högvakuum sputter coater för att spruta belägga provstubbar med 6 nm iridium. Om proverna fortsätter att ladda, se till att en ledande väg målas till ytan med silverfärg och belägg med ytterligare 4 nm iridium.
    10. Avbilda proverna med ett svepelektronmikroskop. Även om förhållandena kan variera beroende på vilket mikroskop som används, fungerade en accelerationsspänning på 3 KeV med en strålström på 200 pA och ett arbetsavstånd på 12-13 mm bra på en Zeiss Merlin FE-SEM vid användning av Everhart-Thornley (SE2) elektrondetektor.

Representative Results

Efter inokulering är UPEC-titrar detekterbara i urinen (figur 2B). Underlåtenhet att plåta urinprover på selektiva medier som innehåller kanamycin kommer sannolikt att resultera i överväxt av endogen musmikrobiota som förorenar urinen. Nivån av UPEC-bakteriuri kommer sannolikt att vara hög dag 1 och kan öka under den första veckan innan den minskar vid senare tidpunkter (figur 2C). Cirka 65-80% av mössen kommer inte att ha någon detekterbar UPEC i urinen med 28 dpi (figur 2C, grön cirkel). Dessa möss kan användas i de efterföljande stegen i modellen. Möss som förblir bakteriuriska (figur 2C, röd ellips) bör elimineras från experimentet.

Två sekventiella G. vaginalis-exponeringar som ges 12 timmar (figur 3A) eller 1 wk från varandra (figur 3B) resulterar i uppkomsten av UPEC från intracellulära reservoarer för att orsaka återkommande bakteriuri. Både nivån av UPEC-bakteriuri (Mann-Whitney-test) och fraktionen av möss som visar UPEC rUTI (Fishers exakta test) är signifikant högre hos möss som utsätts för G. vaginalis jämfört med PBS-kontrollgruppen. Urincytologianalys detekterar PMN i urinen från G. vaginalis-exponerade möss som visade UPEC-uppkomst (figur 3C). I modellen med två exponeringar givna 1 wk från varandra är UPEC-titrar i blåsvävnad lägre hos G. vaginalis-exponerade möss jämfört med PBS (figur 3D), förmodligen på grund av uppkomsten av UPEC från reservoarer och efterföljande clearance.

Visualisering av in situ-fixerad blåsvävnad med SEM avslöjar stora ytliga paraplyurotelceller som kantar blåsytan hos kontrollmöss som endast utsätts för PBS (figur 4A). Urotelial exfoliering framgår av en förlust av ytliga paraplyceller, vilket avslöjar mindre underliggande övergångsepitelceller hos möss som utsätts för G. vaginalis (Figur 4B). Tidigt efter UPEC-ympning under etableringen av intracellulära reservoarer är UPEC synliga på urotel och filamentering ur exfolierande celler (Figur 4C).

Figure 2
Figur 2. Övervakning av UPEC-titrar i urinen under fas 1 (reservoarbildning). (A) Schematisk över kolonibildande enheter (CFU) plätering. (B) Representativ bild av UPEC-titrar i urinen på LB+kanamycin. Svarta cirklar indikerar urinprovfläckar som ska räknas för att beräkna CFU / ml. (C) Tidsförlopp för UPEC-bakteriuri hos C57BL/6-möss. Varje linje representerar en enskild mus som spårar UPEC-urintitrarna över tid. Prickad linje anger detektionsgränsen (1000 CFU / ml). Röd ellips indikerar fyra möss (av 20) som misslyckades med att lösa UPEC-bakteriuri och därför inte skulle användas för G. vaginalis-inducerad rUTI-modell. Omvänt indikerar grön cirkel möss som löste UPEC-bakteriuri och fortsatte till efterföljande faser. D) Tabell över data som används för att generera diagram i panel C. Gul, detekterbar CFU; grön, ingen CFU. (E) Randomisering av möss till exponeringsgrupper baserat på den tidpunkt då UPEC CFU inte längre detekterades i urinen ("Dag löst"). Musnumren i den vänstra kolumnen på panel D är samma musnummer som anges i panel E. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3. G. vaginalis utlöser UPEC rUTI. UPEC-titrar i urinen efter två sekventiella urinvägsexponeringar för PBS (cirklar) eller G. vaginalis (Gvag; kvadrater) med 12 timmars (A) eller 1 wk (B) mellanrum. Varje symbol representerar en enskild mus. Den högsta CFU / ml UPEC som detekteras från varje mus mellan 1-3 d efter den andra exponeringen plottas. Möss utan detekterbar bakteriuri plottas vid detektionsgränsen (prickad linje). (C) Urincytologianalys som visar UPEC (pilspetsar) och polymorfonukleära (PMN) celler (pilar). Skalstreck = 20 μm. (D) UPEC-titrar i blåsvävnader samlade 3 d efter två sekventiella urinvägsexponeringar med 1 wk mellanrum. Varje symbol representerar en annan mus och nollor ritas vid detekteringsgränsen (prickad linje). I A, B och D är lådorna vid den första och tredje kvartilen med medianen markerad och morrhår från min till max <. ** P < 0,01; P < 0,0001. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4. SEM-analys av blåsor fixerade på plats. Blåsor samlades in från möss 3 timmar efter två exponeringar (12 h från varandra) för PBS (A) eller G. vaginalis (C). Prickade linjer illustrerar en enda epitelcell i urinen, som är mindre i G. vaginalis-exponerade blåsor eftersom de stora ytliga cellerna har exfolierat bort och avslöjar det underliggande övergångsepitelet. (B) Urinblåsan uppsamlad 6 timmar efter initial ympning med UPEC, under fas 1 av modellen, som visar urotelial exfoliering och extracellulär UPEC. (D) Exempel på olösliga fettdroppar som finns på blåsans yta. Skalstängerna är 20 μm i huvudbilderna och 2 μm i insatsen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Det första kritiska steget i denna modell för att identifiera möss som inte har rensat UPEC-bakteriuri under den primära UTI-fasen. Dessa möss måste tas bort från experimentet eftersom de annars skulle förvirra hastigheten på UPEC-bakteriuri efter G. vaginalis exponering. Efter den första UPEC-ympningen bör urin samlas in varje vecka för att övervaka bakteriell clearance. Cirka 65-80% av C57BL / 6-möss kommer att rensa en UTI89kanR-infektion inom 4 veckor. Andra inavlade musstammar har olika benägenhet för UPEC-clearance42,43 och reservoarbildning och är därför kanske inte lämpliga för denna modell. Den andra kritiska punkten är att empiriska studier har fastställt att två sekventiella inokuleringar av G. vaginalis (antingen 12 h eller 1 wk från varandra) är nödvändiga för att utlösa signifikant reservoaruppkomst ovanför bakgrunden spontan uppkomst som uppträder hos kontrollmöss som endast utsätts för PBS. Andra tidsperioder mellan de två sekventiella exponeringarna har inte testats men kan ge liknande resultat. Det är viktigt att notera att en minskning av UPEC-blåstiter endast observerades i modellen där G. vaginalis-exponeringar gavs 1 wk isär39. Även om mer än två exponeringar kan administreras, tyder empiriska bevis på att upprepad kateterisering ensam ökar uppkomsten, vilket kan förvirra tolkningen av resultaten eller kräva ett större antal djur för att skilja skillnader mellan exponeringsgrupper och kontroller. Slutligen har in situ-blåsfixeringsmetoden flera kritiska steg. Viss skicklighet krävs för att säkerställa att fixeringsmedlet förblir inuti de klämda blåsorna. Tömda blåsor blir svårare att avbilda med SEM. Det är också viktigt att vara mycket försiktig när man ympar fixeringsmedlet i urinblåsan, eftersom skrapning av urotelium med den fixativinnehållande katetern kan inducera urotelial exfoliering oberoende av vad som utlöses av G. vaginalis. Alla koncentrationer som nämns i den fixativa cocktailen är slutliga koncentrationer. Felaktiga förhållanden av dessa kan resultera i otillräcklig fixering och svullnad eller krympning av cellerna. Fixeringsmedel bör värmas till fysiologiska temperaturer för att undvika temperaturchock i celler och vävnader. Uppvärmning ger också en liten förbättring av diffusionshastigheten för fixeringsmedel genom plasmamembran. Medan osmiumfärgning ofta kan utelämnas för prover som är förberedda för SEM-analys, är det ett viktigt steg i detta protokoll för att stabilisera lipider och förhindra sprickbildning av cellulära membran under kritisk punkttorkning.

Detta protokoll kan modifieras för att testa andra UPEC- och / eller G. vaginalis-stammar för deras förmåga att bilda reservoarer respektive utlösa deras uppkomst. Andra experimentella faktorer kan också läggas till, såsom exponering för andra vaginala bakterier (t.ex. Lactobacillus crispatus PVAS100) eller värmedödad G. vaginalis, varav ingen visar patologi i denna modell39. När du väljer andra bakteriestammar att testa är det viktigt att visa konsekvent tillväxt så att en standard inokulumkoncentration kan användas i alla experiment. Tillväxten av JCP8151BSmR har optimerats i en anaerob kammare. Denna stam kan sannolikt odlas i ett anaerobt GasPak-system, men detta skulle kräva optimering för att säkerställa robust bakterietillväxt. Slutligen kan det vara möjligt att ändra tidpunkten för vissa steg i modellen. Till exempel kan urin samlas in vid tidigare tidpunkter under UPEC-reservoarbildningsfasen för att övervaka CFU eller värdsvar. En negativ effekt av att samla urinprover vid tidiga tidpunkter (3, 6, 12 hpi) på infektionens progression eller etablering av reservoarer har inte observerats i denna modell. Uppkomst av UPEC-reservoarer har rapporterats inträffa efter två JCP8151BSmR-doser som ges 12 timmar eller 1 wk, men andra tidsintervall har ännu inte testats. Det kan också vara möjligt att minska den totala tiden för modellen genom att minska UPEC-reservoarbildningsfasen till 2 veckor (snarare än 4 veckor), eftersom många av mössen rensar bakteriuri vid denna tidpunkt. Tidigare studier som undersökte UPEC-uppkomst efter blåsexponering för kemiska exfolieringsmedel använde en 1 eller 2 wk UPEC-reservoarbildningsfas17,18. Att minska tiden för UPEC-bakteriuriclearance kan dock leda till att fler djur måste avlivas från experimentet. Slutligen kan SEM-analys av blåsan utföras vid ytterligare tidpunkter för att observera varaktigheten av effekten av G. vaginalis på urotelet.

När det gäller felsökning finns det några viktiga överväganden specifikt med avseende på blåsans SEM-analys. Beroende på vilken musbakgrund som används och mängden inflammation närvarande, kommer vissa blåsor att presentera med mycket tunna väggar. Dessa blåsor tenderar att krulla mer under kritisk punkttorkning och kan resultera i en cowrie skalliknande form. Om detta inträffar är den bästa metoden att skära den skalformade blåsan i hälften längs det krullade gränssnittet och sedan en andra gång för att ta bort huvuddelen av den överhängande vävnaden. Skärning fungerar bäst med ett PTFE-belagt dubbelkantigt rakblad. Överflödigt fett kan ibland solubiliseras under osmiumfärgningsstegen. Detta kan resultera i oönskade olösliga fettdroppar som kanske inte tvättas bort under sköljnings- och uttorkningsstegen och som kan sätta sig på blåsytan under efterföljande torkning. Dessa droppar kan visas som antingen små sfärer eller skivliknande strukturer utspridda över provet (figur 4D). Detta kan mildras genom att se till att så mycket fettvävnad tas bort från runt urinblåsan som möjligt. Platina kan ersättas med iridiumbeläggning, men tjocklekarna bör hållas till ett minimum för att minska maskering av fina strukturella detaljer. Användning av ett roterande steg under beläggning rekommenderas starkt.

En begränsning med denna modell är att den kräver ett stort antal möss. Endast 65-80% av C57BL /6-möss kommer att rensa sin UPEC-bakteriuri och vara lämplig för efterföljande G. vaginalis- eller PBS-ympning (se figur 2C). För att få 10-12 möss per grupp (G. vaginalis inokulering vs. PBS) bör ~ 30 möss initialt infekteras med UPEC. Vidare krävs sannolikt flera experiment för att uppnå de biologiska replikat som krävs för att detektera statistisk signifikans. När exponeringen gavs 1 wk från varandra inträffade UPEC-uppkomst hos 14% av mössen som exponerades för PBS (figur 3B). Att upptäcka en signifikant ökning av UPEC rUTI hos G. vaginalis-exponerade möss i förhållande till PBS-kontroller (drivs vid 0,8; alfa = 0,05 [ensidig]) kräver att man testar en kumulativ summa på minst 40 möss för varje exponeringsgrupp. Ett ytterligare övervägande är att dessa experiment är dyra och arbetsintensiva. Möss måste övervakas varje vecka för UPEC-clearance och det experimentella tidsförloppet är 4-5 wk beroende på om G. vaginalis ges två gånger inom en tidsram på 12 timmar eller två gånger 1 wk från varandra. SEM är arbetsintensivt och kan vara kostsamt, beroende på mikroskoptillgänglighet och serviceavgifter. Att förbereda hela blåsan för SEM ger rikligt med material för analys men nackdelen är att det kan vara tidskrävande att analysera varje blåsa. Således är det troligt att endast ett begränsat antal blåsor kan analyseras med SEM jämfört med det högre djurantalet som används för urin- och vävnadstitrar. Dessutom kräver högkvalitativa bilder av blåsans "koppar" böjda ytor skicklighet på grund av skuggor som kan hindra synligheten. Även om blåsan SEM är ett användbart verktyg för att visualisera urotelial exfoliering, är denna metod till stor del kvalitativ. Eftersom provet är fixerat i en rund form, och på grund av användningen av glutaraldehyd i fixeringsmedlet, är screening för fluorescerande uttryckande bakterier via ljusmikroskopi inte möjlig. Immunfärgning och kemiska färgämnen är oförenliga med denna process på grund av användningen av glutaraldehyd som kommer att tvärbinda de flesta antigener och osmium och som kommer att maskera antigenställen och mörka vävnaden. Som sagt, SEM-tekniken är användbar för parametrar som kan utvärderas kvantitativt utan användning av ytterligare sonder, såsom cellstorlek48,49.

Denna modell erbjuder flera fördelar utöver tidigare beskrivna metoder. Det möjliggör undersökning av mekanismer för UPEC rUTI orsakad av uppkomst från blåsreservoarer, i motsats till återinförande i blåsan från en extern källa. Andra modeller av rUTI på grund av uppkomst från blåsreservoarer använder kemiska medel (protaminsulfat eller kitosan) för att orsaka urotelial exfoliering 17,18, vilket inte skulle vara utlösare av rUTI hos kvinnor. G. vaginalis är en utbredd urogenital bakterie som har detekterats i urin som samlats in direkt från urinblåsan via kateterisering eller suprapubisk aspiration hos vissa kvinnor23,26. Detta faktum, tillsammans med den kända kopplingen mellan BV (där G. vaginalis växer över i slidan) och UTI, tyder på att G. vaginalis är en kliniskt trolig utlösare av rUTI. Slutligen bevarar in situ-blåsfixeringsmetoden blåsans ultrastruktur och begränsar skador, vilket säkerställer att blåsskikten inte separeras från varandra. Tidigare metoder för att visualisera urotelium har traditionellt fått användaren att aseptiskt skörda, bisekera, sträcka och fästa blåsan på en dissektionsbricka innan den förlängda urinblåsan sänks ner i fixativ48. Denna metod resulterar i ett mycket platt prov men säkerställer inte jämn eller naturlig sträckning av vävnaden och kan resultera i områden som är över och under sträckta (vilket resulterar i mycket skrynklig vävnad) och kan orsaka separation av blåsskiktet. Dessutom kan dessa fysiska manipuleringar av urinblåsan för att sträcka och stifta vävnaden orsaka skador, inklusive urotelial exfoliering. En annan metod är att sänka ner intakta blåsor i fixativ innan de bäddas in i paraffin och förvärvar tunna sektioner med en mikrotom. Tunna sektioner är ovärderliga för immunohistokemiska experiment för att undersöka bakterier och värdproteinlokalisering men en tunn sektion tillåter inte visualisering av den uroteliala ytan. Denna SEM-metod gör att ytan på hela blåsan kan undersökas på en gång.

Som beskrivits inkluderar framtida tillämpningar av denna modell testning av andra UPEC-stammar för att avgöra om de bildar intracellulära reservoarer och testning av andra G. vaginalis-stammar för att bedöma om de framkallar exfoliering och UPEC-uppkomst för att orsaka rUTI. Andra musstammar utöver C57BL/6-möss kan också testas, även om möss med hög benägenhet att utveckla kronisk cystit (såsom möss på C3H-bakgrunden) inte rekommenderas, eftersom för många möss skulle behöva avlivas från experimentet. En ytterligare fördel med C57BL/6-möss är att många genetiska knockout-stammar är kommersiellt tillgängliga. Sådana stammar ger möjlighet att förhöra de värdfaktorer som är involverade i reservoarbildning och / eller uppkomst.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några intressekonflikter relaterade till denna studie.

Acknowledgments

Författarna tackar Lynne Foster för tekniskt bistånd i infektionsexperiment, James Fitzpatrick vid Washington University Center for Celluar Imaging (WUCCI) för tillgång till SEM, Scott Hultgren för UTI89kanR UPEC-stammen och David Hunstad för kritisk läsning av manuskriptet.

Detta arbete stöddes av National Science Foundation (Graduate Research Fellowship till VPO #DGE - 1143954), av Center for Women's Infectious Disease Research vid Washington University School of Medicine (Pilot Research Award till NMG), av American Heart Association: #12POST12050583 (NMG) och #14POST20020011 (NMG) och av National Institutes of Health, NIAID: R01 AI114635 (ALL) och NIDDK: R21 DK092586 (ALL), P50 DK064540-11 (SJH, projekt II PI:ALL) och K01 DK110225-01A1 (NMG). Några av djurstudierna utfördes i en anläggning som stöds av NCRR-bidrag C06 RR015502. Washington University Center for Cellular Imaging (WUCCI; där SEM utfördes) och MSJ stöddes av Washington University School of Medicine, Children's Discovery Institute of Washington University och St. Louis Children's Hospital (CDI-CORE-2015-505), Foundation for Barnes-Jewish Hospital (3770) och National Institute for Neurological Disorders and Stroke (NS086741). Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera eller förberedelse av manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
30G x 1/2 needles BD 305106 for catheters
5 1/2" straight forcep hemostat McKesson 487377 in situ bladder fixation
ACE 600 Sputter coater Leica SEM sample processing
aluminum SEM stub Ted Pella 16111 SEM sample processing
Calcium chloride EMS 12340 in situ bladder fixation
conductive carbon adhesive tab  Ted Pella 16084-1 SEM sample processing
Conductive silver paint Ted Pella 16034 SEM sample processing
CPD 300 Critical Point Drier Leica SEM sample processing
Cytofunnel metal clip Simport M964B cytospun urinalysis
Ethanol EMS 15050 SEM sample processing
Glucose  Sigma G7528 for NYCIII G. vaginalis growth media
glutaraldehyde EMS 16320 in situ bladder fixation
Hema 3 staining kit Fisher 23123869 cytospun urinalysis
HEPES Cellgro  25-060-Cl for NYCIII G. vaginalis growth media
iridium Ted Pella 91120 SEM sample processing
isofluorane mouse anaesthesia
kanamycin Gibco 11815024 add to UPEC LB selective plates (50 ug/mL)
Luria-Bertani agar BD DF0445174 UPEC growth plates
Luria-Bertani broth BD DF0446173 UPEC growth media
Merlin FE-SEM Zeiss scanning electron microscope
Milli-Q Water Purifier Millipore IQ-7000 SEM sample processing
NaCl  Sigma S3014 for NYCIII G. vaginalis growth media
Olympus Vanox AHBT3 microscope Olympus cytospun urinalysis
osmium tetroxide EMS 19170 SEM sample processing
paraformaldehyde EMS 15710 in situ bladder fixation
polyethylene tubing Intramedic 427401 for catheters
Proteose Peptone #3  Fisher  DF-122-17-4 for NYCIII G. vaginalis growth media
PTFE coated double edge razor blade EMS 72000 cutting bladders for SEM
Shandon Cytocentrifuge Thermo Scientific A78300002 cytospun urinalysis
Shandon cytofunnel filter Simport M965FWDV cytospun urinalysis
Shandon Double cytofunnel Simport M964-1D cytospun urinalysis
Shandon double cytoslides (coated) Thermo Scientific 5991055 cytospun urinalysis
sodium cacodylate trihydrate EMS 12310 in situ bladder fixation
spectrophotometer BioChrom 80-3000-45 measuring bacterial OD600
streptomycin Gibco 11860038 add to G. vaginalis NYCIII selective plates (1 mg/mL)
tuberculin slip tip syringe BD 309659 for catheters
Yeast Extract  Fisher DF0127-17-9 for NYCIII G. vaginalis growth media

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Foxman, B. Urinary tract infection syndromes: occurrence, recurrence, bacteriology, risk factors, and disease burden. Infectious Disease Clinics of North America. 28 (1), 1-13 (2014).
  2. Foxman, B. Recurring urinary tract infection: incidence and risk factors. American Journal of Public Health. 80 (3), 331-333 (1990).
  3. Foxman, B. Epidemiology of urinary tract infections: incidence, morbidity, and economic costs. American Journal of Medicine. 113, Suppl 1A 5-13 (2002).
  4. Foxman, B. The epidemiology of urinary tract infection. Nature Reviews Urology. 7 (12), 653-660 (2010).
  5. Ikaheimo, R., et al. Recurrence of urinary tract infection in a primary care setting: analysis of a 1-year follow-up of 179 women. Clinical Infectious Diseases. 22 (1), 91-99 (1996).
  6. Russo, T. A., Stapleton, A., Wenderoth, S., Hooton, T. M., Stamm, W. E. Chromosomal restriction fragment length polymorphism analysis of Escherichia coli strains causing recurrent urinary tract infections in young women. Journal of Infectious Diseases. 172 (2), 440-445 (1995).
  7. Luo, Y., et al. Similarity and divergence of phylogenies, antimicrobial susceptibilities, and virulence factor profiles of Escherichia coli isolates causing recurrent urinary tract infections that persist or result from reinfection. Journal of Clinical Microbiology. 50 (12), 4002-4007 (2012).
  8. Schreiber, H. L. t, et al. Bacterial virulence phenotypes of Escherichia coli and host susceptibility determine risk for urinary tract infections. Science Translational Medicine. 9 (382), (2017).
  9. Rosen, D. A., Hooton, T. M., Stamm, W. E., Humphrey, P. A., Hultgren, S. J. Detection of intracellular bacterial communities in human urinary tract infection. PLoS Med. 4 (12), 329 (2007).
  10. Elliott, T. S., Reed, L., Slack, R. C., Bishop, M. C. Bacteriology and ultrastructure of the bladder in patients with urinary tract infections. Journal of Infection. 11 (3), 191-199 (1985).
  11. Robino, L., et al. Detection of intracellular bacterial communities in a child with Escherichia coli recurrent urinary tract infections. Pathogens and Disease. 68 (3), 78-81 (2013).
  12. Robino, L., et al. Intracellular bacteria in the pathogenesis of Escherichia coli urinary tract infection in children. Clinical Infectious Diseases. 59 (11), 158-164 (2014).
  13. De Nisco, N. J., et al. Direct Detection of Tissue-Resident Bacteria and Chronic Inflammation in the Bladder Wall of Postmenopausal Women with Recurrent Urinary Tract Infection. Journal of Molecular Biology. 431 (21), 4368-4379 (2019).
  14. Mulvey, M. A., Schilling, J. D., Hultgren, S. J. Establishment of a persistent Escherichia coli reservoir during the acute phase of a bladder infection. Infection and Immunity. 69 (7), 4572-4579 (2001).
  15. Kerrn, M. B., Struve, C., Blom, J., Frimodt-Moller, N., Krogfelt, K. A. Intracellular persistence of Escherichia coli in urinary bladders from mecillinam-treated mice. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 55 (3), 383-386 (2005).
  16. Eto, D. S., Sundsbak, J. L., Mulvey, M. A. Actin-gated intracellular growth and resurgence of uropathogenic Escherichia coli. Cellular Microbiology. 8 (4), 704-717 (2006).
  17. Mysorekar, I. U., Hultgren, S. J. Mechanisms of uropathogenic Escherichia coli persistence and eradication from the urinary tract. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (38), 14170-14175 (2006).
  18. Blango, M. G., Ott, E. M., Erman, A., Veranic, P., Mulvey, M. A. Forced resurgence and targeting of intracellular uropathogenic Escherichia coli reservoirs. PLoS One. 9 (3), 93327 (2014).
  19. Gilbert, N. M., Lewis, A. L. Covert pathogenesis: Transient exposures to microbes as triggers of disease. PLoS Pathogens. 15 (3), 1007586 (2019).
  20. Lewis, A. L., Gilbert, N. M. Roles of the vagina and the vaginal microbiota in urinary tract infection: evidence from clinical correlations and experimental models. GMS Infectious Diseases. 8, (2020).
  21. Janulaitiene, M., et al. Prevalence and distribution of Gardnerella vaginalis subgroups in women with and without bacterial vaginosis. BMC Infectious Diseases. 17 (1), 394 (2017).
  22. Fredricks, D. N. Molecular methods to describe the spectrum and dynamics of the vaginal microbiota. Anaerobe. 17 (4), 191-195 (2011).
  23. Hilt, E. E., et al. Urine is not sterile: use of enhanced urine culture techniques to detect resident bacterial flora in the adult female bladder. Journal of Clinical Microbiology. 52 (3), 871-876 (2014).
  24. Klein, S., et al. Significant increase in cultivation of Gardnerella vaginalis, Alloscardovia omnicolens, Actinotignum schaalii, and Actinomyces spp. in urine samples with total laboratory automation. European Journal of Clinical Microbiology Infect Dis. 37 (7), 1305-1311 (2018).
  25. Pearce, M. M., et al. The female urinary microbiome in urgency urinary incontinence. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 213 (3), 341 (2015).
  26. Pearce, M. M., et al. The female urinary microbiome: a comparison of women with and without urgency urinary incontinence. mBio. 5 (4), 01283 (2014).
  27. Gottschick, C., et al. The urinary microbiota of men and women and its changes in women during bacterial vaginosis and antibiotic treatment. Microbiome. 5 (1), 99 (2017).
  28. Malki, K., et al. Genomes of Gardnerella Strains Reveal an Abundance of Prophages within the Bladder Microbiome. PLoS One. 11 (11), 0166757 (2016).
  29. Kramer, H., et al. Diversity of the midstream urine microbiome in adults with chronic kidney disease. International Urology and Nephrology. 50 (6), 1123-1130 (2018).
  30. Allsworth, J. E., Peipert, J. F. Prevalence of bacterial vaginosis: 2001-2004 National Health and Nutrition Examination Survey data. Obstetrics & Gynecology. 109 (1), 114-120 (2007).
  31. Ravel, J., et al. Vaginal microbiome of reproductive-age women. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, Suppl 1 4680-4687 (2011).
  32. Hillier, S. L. Diagnostic microbiology of bacterial vaginosis. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 169 (2), Pt 2 455-459 (1993).
  33. Amatya, R., Bhattarai, S., Mandal, P. K., Tuladhar, H., Karki, B. M. Urinary tract infection in vaginitis: a condition often overlooked. Nepal Medical College Journal. 15 (1), 65-67 (2013).
  34. Harmanli, O. H., Cheng, G. Y., Nyirjesy, P., Chatwani, A., Gaughan, J. P. Urinary tract infections in women with bacterial vaginosis. Obstetrics & Gynecology. 95 (5), 710-712 (2000).
  35. Sharami, S. H., Afrakhteh, M., Shakiba, M. Urinary tract infections in pregnant women with bacterial vaginosis. Journal of Obstetrics and Gynaecology. 27 (3), 252-254 (2007).
  36. Hillebrand, L., Harmanli, O. H., Whiteman, V., Khandelwal, M. Urinary tract infections in pregnant women with bacterial vaginosis. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 186 (5), 916-917 (2002).
  37. Sumati, A. H., Saritha, N. K. Association of urinary tract infection in women with bacterial vaginosis. Journal of Global Infectious Diseases. 1 (2), 151-152 (2009).
  38. Gilbert, N. M., Lewis, W. G., Lewis, A. L. Clinical features of bacterial vaginosis in a murine model of vaginal infection with Gardnerella vaginalis. PLoS One. 8 (3), 59539 (2013).
  39. Gilbert, N. M., O'Brien, V. P., Lewis, A. L. Transient microbiota exposures activate dormant Escherichia coli infection in the bladder and drive severe outcomes of recurrent disease. PLoS Pathogens. 13 (3), 1006238 (2017).
  40. Wright, K. J., Seed, P. C., Hultgren, S. J. Uropathogenic Escherichia coli flagella aid in efficient urinary tract colonization. Infection and Immunity. 73 (11), 7657-7668 (2005).
  41. Garofalo, C. K., et al. Escherichia coli from urine of female patients with urinary tract infections is competent for intracellular bacterial community formation. Infection and Immunity. 75 (1), 52-60 (2007).
  42. Hannan, T. J., Mysorekar, I. U., Hung, C. S., Isaacson-Schmid, M. L., Hultgren, S. J. Early severe inflammatory responses to uropathogenic E. coli predispose to chronic and recurrent urinary tract infection. PLoS Pathogens. 6 (8), 1001042 (2010).
  43. Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. Time course and host responses to Escherichia coli urinary tract infection in genetically distinct mouse strains. Infection and Immunity. 66 (6), 2798-2802 (1998).
  44. Conover, M. S., Flores-Mireles, A. L., Hibbing, M. E., Dodson, K., Hultgren, S. J. Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model. Journal of Visualized Experiments. (100), e52892 (2015).
  45. Hannan, T. J., Hunstad, D. A. A Murine Model for Escherichia coli Urinary Tract Infection. Methods in Molecular Biology. 1333, 159-175 (2016).
  46. Zychlinsky Scharff, A., Albert, M. L., Ingersoll, M. A. Urinary Tract Infection in a Small Animal Model: Transurethral Catheterization of Male and Female Mice. Journal of Visualized Experiments. (130), e54432 (2017).
  47. Thai, K. H., Thathireddy, A., Hsieh, M. H. Transurethral induction of mouse urinary tract infection. Journal of Visualized Experiments. (42), e2070 (2010).
  48. O'Brien, V. P., et al. A mucosal imprint left by prior Escherichia coli bladder infection sensitizes to recurrent disease. Nature Microbiology. 2, 16196 (2016).
  49. O'Brien, V. P., Dorsey, D. A., Hannan, T. J., Hultgren, S. J. Host restriction of Escherichia coli recurrent urinary tract infection occurs in a bacterial strain-specific manner. PLoS Pathogens. 14 (12), 1007457 (2018).

Tags

Immunologi och infektion utgåva 166 UTI återkommande UTI latent infektion bakteriell vaginos transuretral kateter vagina urin anaerob urinblåsa njure urinmikrobiota vaginal mikrobiota svepelektronmikroskopi
Återkommande <em>Escherichia coli </em>urinvägsinfektion utlöst av <em>Gardnerella vaginalis </em>urinblåsans exponering hos möss
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

O'Brien, V. P., Joens, M. S., Lewis, … More

O'Brien, V. P., Joens, M. S., Lewis, A. L., Gilbert, N. M. Recurrent Escherichia coli Urinary Tract Infection Triggered by Gardnerella vaginalis Bladder Exposure in Mice. J. Vis. Exp. (166), e61967, doi:10.3791/61967 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter