Este artigo descreve os procedimentos experimentais para (a) esgotamento do U1 snRNP a partir de extratos nucleares, com perda concomitante de atividade de emenda; e (b) reconstituição da atividade de emenda no extrato empobrecido U1 por partículas de galectina-3 – U1 snRNP ligadas a contas covalentemente acopladas a anticorpos anti-galectina-3.
Experimentos clássicos de esgotamento-reconstituição indicam que a galectina-3 é um fator de emenda necessário em extratos nucleares. O mecanismo de incorporação da galectina-3 na via de emenda é abordado neste artigo. A sedimentação de extratos nucleares de células HeLa em 12%-32% gradientes de glicerol produz frações enriquecidas em uma partícula endógena ~10S que contém galectina-3 e U1 snRNP. Descrevemos agora um protocolo para esgotar extratos nucleares do U1 snRNP com perda concomitante de atividade de emenda. A atividade de emenda no extrato empobrecido U1 pode ser reconstituída pela partícula de galectin-3 – U1 snRNP presa em contas de agarose covalentemente acopladas com anticorpos anti-galectina-3. Os resultados indicam que o complexo ternário pré-mRNA é um complexo E funcional que leva a intermediários e produtos da reação de emenda e que a galectina-3 entra no caminho de emenda através de sua associação com o U1 snRNP. O esquema de utilização de complexos de afinidade ou imuno-selecionados em contas para reconstituir a atividade de emenda em extratos esgotados de um fator de emenda específico pode ser geralmente aplicável a outros sistemas.
A produção da maioria dos RNAs (mRNAs) do mensageiro eucariótico envolve a remoção de introns e a ligadura de exons em um processo nuclear chamado de emenda pré-mRNA1. Duas classes de complexos de proteína RNA (RNPs) direcionam o processamento do RNA pré-mensageiro em mRNA maduro através de complexos spliceossômicos. Uma classe, rnps pré-mensageiro nascente, é formada co-transcrição pela vinculação de proteínas heterogêneas nucleares RNP e outras proteínas de ligação de RNA, incluindo alguns membros da família SR, produzindo complexos hnRNP2. A segunda classe, rica em uracil, pequenas RNPs nucleares (U snRNPs com U1, U2, U4, U5 e U6 snRNAs) está associada com proteínas específicas e core u3,4. Os SNRNPs da U interagem de forma ordenada com regiões específicas de RNPs pré-mensageiros em um caminho de remodelação dinâmica à medida que os introns são extirpados e exons são ligados para produzir mRNPs5 maduros. Muitas proteínas nucleares adicionais participam desses eventos de processamento6.
Galectin-1 (Gal1) e galectin-3 (Gal3) são duas proteínas que são fatores necessários na via de emenda, como mostrado pelos estudos de esgotamento-reconstituição7,8. A remoção de ambas as galectinas de emendas extratos nucleares competentes (NE) abolia a montagem de emendas e a atividade de emenda em um passo inicial. A adição de uma galectina a um NE duplamente esgotado restaura ambas as atividades. Gal1 e Gal3 são componentes de emendas ativas, evidenciadas por imunoprecipitação específica de pré-mRNA, intermediários de emenda e mRNA maduro por antiserum específico para Gal1 ou Gal39. É importante ressaltar que a Gal3 associa-se ao snRNA u endógeno contendo partículas no NE fora da via de emenda, como mostrado pela precipitação de snRNPs por anti-Gal3 antisera10. Finalmente, o silenciamento de Gal3 em células HeLa altera padrões de emenda de numerosos genes11.
No NE pré-incubado para desmontar os spliceosomes pré-formados12, snRNPs são encontrados em múltiplos complexos sedimentando em gradientes de glicerol de 7S para maiores de 60S. Embora o fracionamento do gradiente de glicerol seja uma técnica comum para o isolamento de complexos e componentes spliceossômicos (ver referências13,14,15 por exemplo), ampliamos esse método caracterizando frações específicas usando imunoprecipitações de anticorpos. Um sedimento snRNP em 10S contém apenas u1 snRNA juntamente com Gal3. A imunoprecipitação da fração 10S com antisera específica para Gal3 ou U1 snRNP co-precipita tanto u1 quanto Gal3 indicando que algumas das mon partículas do U1 snRNP estão ligadas a Gal310. Como o U1 snRNP é o primeiro complexo que se liga ao pré-mRNP em conjuntos emendasomais1,5, esta etapa representa um potencial local de entrada para Gal3 na via de emenda. Com base nisso, mostramos que as monpartículas 10S Gal3-U1 snRNP ligadas à anti-Gal3 contendo contas restauradas para um NE esgotado U1 snRNP, estabelecendo este complexo como um mecanismo pelo qual Gal3 é recrutado para o caminho emendalomal16. Isso contrasta com as tentativas de isolar os emendas em estágios específicos na reação de emenda e catalogação dos fatores associados17,18. Em tais estudos, a presença de certos fatores em algum momento é apurada, mas não o mecanismo pelo qual foram carregados.
Havia descrito anteriormente em detalhes a preparação do NE, o substrato de emenda, a montagem da mistura de reação de emenda, e a análise de produtos em nossa documentação do papel das galectinas no splicing pré-mRNA19. Descrevemos agora os procedimentos experimentais para o fracionamento de extratos nucleares para obter uma fração enriquecida no complexo Gal3 – U1 snRNP e para a imuno-seleção deste último complexo para reconstituir a atividade de emenda em um extrato nuclear esgotado pelo U1.
Figura 1: Diagrama esquemático ilustrando a complementação da atividade de emenda em extrato nuclear esgotado de U1 snRNP por um complexo de snRNP Gal3-U1 em contas. (A) NE em Buffer C (NE(C)) é incubado com contas de proteína A-Sepharose covalentemente acopladas com anti-U1 snRNP (contas αU1). A fração desvinculada está esgotada de U1 snRNP (U1ΔNE). (B) NE em Buffer D (NE(D)) é fracionado sobre um gradiente de glicerol de 12%-32% por ultracentrifugação. Frações correspondentes à região 10S (frações 3-5) são combinadas e misturadas com contas covalentemente acopladas com anticorpos anti-Gal3 (contas αGal3). O material ligado às contas contém uma monopartícula de SnRNP Gal3-U1. (C) O complexo de snRNP Gal3-U1 da Parte (B) é misturado com U1ΔNE da Parte (A) em um ensaio de emenda usando substrato minx pré-mRNA com 32P e os intermediários e produtos da reação de emenda são analisados por eletroforese gel e autoradiografia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Este relatório fornece os detalhes experimentais que documentam um complexo Gal3 – U1 snRNP preso em contas revestidas anti-Gal3 pode se ligar ao substrato pré-mRNA e este complexo ternário pode restaurar a atividade de emenda a um NE er. . Os estudos de imunofluorescência precoce e fracionamento subcelular forneceram o indício inicial de uma associação de Gal3 com componentes da máquina de emenda: colocalização em manchas nucleares com polipeptídeos de núcleo Sm de snRNPs e serina e a…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado pela National Science Foundation Grant MCB-0092919 e Michigan State University Intramural Research Grant 09-CDFP-2001 (para RJP) e pelos Institutos Nacionais de Saúde Grant GM-38740 e Michigan AgBioResearch Project MICL02455 (para JLW).
O substrato minx pré-mRNA usado nos ensaios de emenda foi um presente gentil da Dra.
anti-U1 snRNP | The Binding Site | Hu ENA-RNP #33471 | human autoimmune serum specific for U1 snRNP |
bottle top vacuum filter | Fisher Scientific | Corning 431153 (0.22 μm; PES 150 ml) | for filtering solutions containing Tris |
centrifuge | International Equipment Company | IEC Model PR-6 | for pelletting Sepharose beads in immunoprecipitation |
diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | 159220-5G | for treatment of water used in preparation of all solutions |
dimethylpimelimidate (DMP) | Sigma-Aldrich | 80490-5G | for cross-linking antibody to Sepharose beads |
electrophoresis cell | BioRad Laboratories, Inc | Mini-Protean II | for SDS-PAGE separation of proteins |
ethanolamine | Sigma-Aldrich | 411000-100ml | for blocking after the cross-linking reaction |
gel electrophoresis system | Hoefer, Inc | HSI SE 500 Series | for separating snRNAs by gel electrophoresis |
gel slab dryer | BioRad | Model 224 | for drying gel slabs for autoradiography |
Hybond ECL membrane | GE Healthcare | RPN3032D (0.2 μm; 30 cm x 3 m) | for immunoblotting of proteins on membrane |
microdialyzer (12 x 100 μl sample capacity) | Pierce | Microdialyzer System 100 | for exchanging the buffer of nuclear extract |
microdialyzer membranes (8K cutoff) | Pierce | 66310 | for exchanging the buffer of nuclear extract |
non-fat dry milk | Spartan Stores | Spartan Instant Non-fat Dry Milk | |
Protein A Sepharose CL-4B | Millipore-Sigma | GE 17-0780-01 | for coupling antibody to beads |
Proteinase K | Millipore-Sigma | P2308-5mg | for stopping the splicing reaction to isolate the RNAs |
RNasin | Promega | N2111 | for inhibiting ribonuclease activity |
rocker/rotator | Lab Industries, Inc | Labquake Shaker 400-110 | for mixing protein solutions in coupling reactions and in immunoprecipitation |
Safety-Solve | Research Products International Corp. | No. 111177 | scintillation counting cocktail for determination of radioactivity in splicing substrate |
scintillation counter | Beckman Instruments | LS6000SC | scintillation counter for determination of radioactivity |
speed vaccum concentrator | Savant | SVC 100H | for drying ethanol-precipitated RNA pellets |
Transphor electrophoresis unit | Hoefer, Inc | Hoefer TE Series Transphor | for protein transfer from SDS-PAGE to blotting membrane |