Udnyttelse af grafix til påvisning af forbigående interactorer af saccharomyces cerevisiae splejsning splejsstoffer

Summary

Her beskriver vi udnyttelsen af Grafix (Gradient Fiksering), en glycerol gradient centrifugering i nærværelse af en crosslinker, for at identificere interaktioner mellem splejsning faktorer, der binder forbigående til splejsning kompleks.

Abstract

Pre-mRNA splejsning er en meget dynamisk proces, der involverer mange molekylære omlægninger af de splejsiske underkomplekser under montering, RNA-behandling og frigivelse af de komplekse komponenter. Glycerol gradient centrifugering er blevet anvendt til adskillelse af protein eller RNP (RiboNucleoProtein) komplekser til funktionelle og strukturelle undersøgelser. Her beskriver vi udnyttelsen af Grafix (Gradient Fiksering), som først blev udviklet til at rense og stabilisere makromolekyllære komplekser til enkelt partikel kryo-elektronmikroskopi, for at identificere interaktioner mellem splejsning faktorer, der binder forbigående til splejse kompleks. Denne metode er baseret på centrifugering af prøver i en stigende koncentration af et fikseringsreagens for at stabilisere komplekser. Efter centrifugering af gær samlede ekstrakter læsset på glycerol gradienter, genvundet fraktioner analyseres ved prik blot til identifikation af splejsning sub-komplekser og bestemmelse af tilstedeværelsen af individuelle splejsning faktorer.

Introduction

Splejsning er en meget dynamisk proces, der kræver binding og frigivelse af en lang række faktorer på en koordineret måde. Disse splejsning faktorer omfatter RNA bindende proteiner, ATPases, helicaser, protein kinaser og fosfattaser, allestedsnærværende ligaser, blandt andre^1,2,3; og for at gøre det muligt for de molekylære omlægninger at finde sted, binder nogle af disse faktorer meget forbigående til de splejsede underkomplekser, hvilket gør isoleringen og identifikationen af disse RNP-mellemkomplekser meget udfordrende.

Her brugte vi Grafix metode^4,5 til at stabilisere samspillet mellem gær splejsning faktor Cwc24 med B^handling kompleks⁶ at give mulighed for identifikation af andre faktorer bundet samtidig til denne subcomplex og afgøre, om den allestedsnærværende ligase Prp19 spiller nogen rolle i bindingen eller frigivelsen af Cwc24 til Nitten (NTC) kompleks og til 5 ‘slutningen af intron før aktivering og den første transesterificering reaktion tager sted. Fordelen ved at udsætte makromolekylerne for en stigende koncentration af crosslinkeren langs glycerolgradienten er, at den undgår interkomplekser krydslinks^4,5og dermed dannelsen af aggregater.

Denne metode blev brugt som et supplement til protein coimmunoprecipitation og pull-down assays, som, på trods af at tillade isolering af store komplekser, kan ikke være pålidelige til at opretholde forbigående interaktioner inden for store dynamiske komplekser^7,8. Brugen af fiksering reagenser i glycerol gradient stabiliserer bindingen af sådanne faktorer, så bekræftelse af interaktioner af specifikke proteiner med splejsning subkomplekser. Fordi den valgte crosslinker var kemisk irreversibel, proteiner til stede i de genvundne fraktioner blev analyseret ved prik blot efter gradient centrifugation.

Protocol

1. Gær total ekstrakt forberedelse Knyt gærcellerne, der udtrykker en af splejsning faktorer smeltet til TAP tag9 i 1 L YNB-glu medier (Gær Nitrogen Basis suppleret med 2% m / v glukose) med de relevante aminosyrer eller nuklein baser, i dette tilfælde, adenin (20 μg/mL), leucin (30 μg/mL), tryptofan (30 μg/mL), op til OD600 = 1,0. Cellerne opsamles fra 1 L-kulturen ved at centrifugere i tre 500 mL centrifugeflasker ved 17.000 x g i 10 min ved 4 °C o…

Representative Results

For at analysere sedimenteringsprofilen af Cwc24-TAP og afgøre, om Grafix-metoden var effektiv til at stabilisere sin binding til splejsning af underkomplekser, adskilte vi samlede gærekstrakter af celler, der udtrykker Cwc24-TAP gennem centrifugering på glycerolgradienter, i nærvær eller fravær af glutaraldehyd som et krydslinkmiddel. Prøver på 24 500 μL-fraktioner blev derefter analyseret ved slot blot med antistof mod CBP-delen af TAP-mærket. Resultaterne viser , at I mangel af crosslinker er Cwc24 koncentre…

Discussion

Protein-protein og ribonukleinsyrer-protein interaktioner kan stabiliseres ved hjælp af crosslinking midler. Det er vigtigt, at det resulterende kompleks er stabilt til at modstå ultracentrifugering på glycerol gradient. Derudover bør bufferbetingelserne gøre det muligt at interagere, men være strenge nok til at undgå ikke-specifik binding. I de eksperimenter, der er vist her, brugte vi en bufferopløsning, der allerede er etableret til in vitro-splejsningsreaktioner¹⁵.

<p class="jove_c…

Materials

Anti-Calmodulin Binding Protein Epitope	Millipore	07-482
ECL anti-Rabbit IgG	GE Healthcare	NA934
EconoSystem	Bio-Rad	1-800-424-6723	Parts of the EconoSystem used: peristaltic pump, the UV detector and the fraction collector
EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Roche	11873580001
Fraction Recovery System	Beckman Coulter	270-331580	Tube-perforating device that was connected to the parts of the EconoSystem
Gradient Master Model 107ip	Biocomp	107-201M
Mixer Mill MM 200	Retsch	207460001	Ball Mill device
Rotor F12-6x500Lex	Thermo Scientific	096-062375
Sorvall RC 6 Plus Centrifuge	Thermo Scientific	36-101-0816
Swinging Bucket Rotor P40ST	Hitachi
Ultracentrifuge CP 80 NX	Hitachi	901069
Ultra-Clear Centrifuge Tubes (14 x 89 mm)	Beckman Coulter	344059