Utnyttelse av Grafix for påvisning av forbigående interagere av Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Summary

Her beskriver vi bruken av Grafix (Gradient Fixation), en glyserol gradient sentrifugering i nærvær av en krysskobling, for å identifisere interaksjoner mellom skjøtefaktorer som binder seg forbigående til skjøteosomet.

Abstract

Pre-mRNA skjøting er en veldig dynamisk prosess som innebærer mange molekylære omorganiseringer av skjøteosomets underkomplekser under montering, RNA-behandling og frigjøring av de komplekse komponentene. Glyserol gradient sentrifugering har blitt brukt til separasjon av protein eller RNP (RiboNucleoProtein) komplekser for funksjonelle og strukturelle studier. Her beskriver vi bruken av Grafix (Gradient Fixation), som først ble utviklet for å rense og stabilisere makromolekylære komplekser for enkeltpartikkelkryo-elektronmikroskopi, for å identifisere interaksjoner mellom skjøtefaktorer som binder seg forbigående til skjøteosomet. Denne metoden er basert på sentrifugering av prøver i en økende konsentrasjon av et fikseringsreagens for å stabilisere komplekser. Etter sentrifugering av gjærtotalekstrakter lastet på glyserolgradienter, analyseres gjenopprettede fraksjoner av dot blot for identifisering av skjøteosomets underkomplekser og bestemmelse av tilstedeværelsen av individuelle skjøtefaktorer.

Introduction

Skjøting er en svært dynamisk prosess som krever binding og frigjøring av en rekke faktorer på en koordinert måte. Disse skjøtefaktorene inkluderer RNA-bindende proteiner, ATPaser, helikaser, proteinkinaser og fosfater, allestedsnærværende ligaer, blant annet^1,2,3; og for å tillate molekylære omorganiseringer å finne sted, binder noen av disse faktorene svært forbigående til skjøteosomets underkomplekser, noe som gjør isolasjonen og identifiseringen av disse RNP-mellomkompleksene svært utfordrende.

Her, vi brukte Grafix-metoden^4,5 for å stabilisere samspillet mellom gjærspleisefaktoren Cwc24 med^{B-aktkomplekset 6} for å tillate identifisering av andre faktorer bundet samtidig til den subcomplexen og avgjøre om ubiquitin ligase Prp19 spiller noen rolle i bindingen eller utgivelsen av Cwc24 til Nitten (NTC) komplekset og til 5 ‘ slutten av intron før aktivering og den første transesterifisering reaksjonen tar sted. Fordelen med å utsette makromolekylene for en økende konsentrasjon av krysskoblingen langs glyserolgradienten er at den unngår interkomplekser krysskoblinger^4,5, og derfor dannelsen av aggregater.

Denne metoden ble brukt som en komplementering til proteinkoimmunoprecipitation og pull-down analyser, som til tross for å tillate isolering av store komplekser, kanskje ikke er pålitelig for å opprettholde forbigående interaksjoner i store dynamiske komplekser^7,8. Bruken av fikseringsreagenser i glyserolgradienten stabiliserer bindingen av slike faktorer, slik at bekreftelsen av interaksjoner av spesifikke proteiner med skjøtende underkomplekser. Fordi den valgte krysskoblingen var kjemisk irreversibel, ble proteiner tilstede i de gjenvunne fraksjonene analysert av prikkflekk etter gradient sentrifugering.

Protocol

1. Gjær total ekstrakt forberedelse Dyrk gjærcellene som uttrykker en av skjøtefaktorene som er smeltet sammen til TAP-taggen9 i 1 L YNB-limmedie (Gjær nitrogen basis supplert med 2% m / v glukose) med passende aminosyrer eller nukleiske baser, i dette tilfellet adenin (20 μg/ml), leucin (30 μg/ml), tryptofan (30 μg/ml), opptil OD600 = 1,0. Samle cellene fra 1 L-kulturen ved sentrifugering i tre 500 ml sentrifugeflasker ved 17 000 x g i 10 min ved 4 ?…

Representative Results

For å analysere sedimenteringsprofilen til Cwc24-TAP og avgjøre om Grafix-metoden var effektiv for å stabilisere bindingen til skjøtende underkomplekser, separerte vi totale gjærekstrakter av celler som uttrykte Cwc24-TAP gjennom sentrifugering på glyserolgradienter, i nærvær eller fravær av glutaraldehyd som et krysskoblingsmiddel. Prøver av tjuefire 500 μL-fraksjoner ble deretter analysert av sporflekk med antistoff mot CBP-delen av TAP-taggen. Resultatene viser at i fravær av crosslinker er Cwc24 konsentre…

Discussion

Proteinprotein- og ribonukleinsyreproteininteraksjoner kan stabiliseres ved hjelp av krysskoblingsmidler. Det er viktig at det resulterende komplekset er stabilt for å tåle ultracentrifugation på glyserol gradient. I tillegg bør bufferbetingelsene tillate samhandlingen, men være strenge nok til å unngå ikke-spesifikk binding. I forsøkene som vises her, brukte vi en bufferløsning som allerede er etablert for in vitro skjøtereaksjoner¹⁵.

Hastigheten og tiden for…

Materials

Anti-Calmodulin Binding Protein Epitope	Millipore	07-482
ECL anti-Rabbit IgG	GE Healthcare	NA934
EconoSystem	Bio-Rad	1-800-424-6723	Parts of the EconoSystem used: peristaltic pump, the UV detector and the fraction collector
EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail	Roche	11873580001
Fraction Recovery System	Beckman Coulter	270-331580	Tube-perforating device that was connected to the parts of the EconoSystem
Gradient Master Model 107ip	Biocomp	107-201M
Mixer Mill MM 200	Retsch	207460001	Ball Mill device
Rotor F12-6x500Lex	Thermo Scientific	096-062375
Sorvall RC 6 Plus Centrifuge	Thermo Scientific	36-101-0816
Swinging Bucket Rotor P40ST	Hitachi
Ultracentrifuge CP 80 NX	Hitachi	901069
Ultra-Clear Centrifuge Tubes (14 x 89 mm)	Beckman Coulter	344059