Summary
蛍光漏れアッセイは、ペプチド/膜相互作用の調査を可能にする簡単な方法であり、いくつかの生物学的プロセスへの関与、特に細胞内転位プロセス中に細胞透過性ペプチドが二重層のリン脂質を乱す能力を理解する。
Abstract
細胞貫通性ペプチド(CpP)は、細胞膜を横断し、細胞に貨物を移動することができるキャリアとして定義されます。この活性に必要な主な共通の特徴の1つは、CCPと血漿膜(脂質)の相互作用、特に膜自体の細胞外マトリックス(ヘパラン硫酸塩)の成分との相互作用から生じる。実際、直接転位またはエンドサイトーシス依存の内在化とは無関係に、脂質二重層は、細胞膜のレベルと細胞内トラフィック(内皮小胞)のレベルの両方で内在化プロセスに関与している。本稿では、蛍光漏れ測定法における大ユニラメラ小胞(LUV)製剤の様々なステップを説明する詳細なプロトコルを紹介し、CPP膜不安定化/相互作用の可能性を検出し、内部化メカニズムにおけるそれらの役割に対処する。細胞膜含量を反映した脂質組成物を有するRVは、蛍光色素とクエンチャーの両方を封入するために生成される。また、発光培地にペプチドを添加し、また、LUV上でのペプチド膜相互作用の誘導は、このように、蛍光の有意な増加を漏出を明らかにする用量依存的に誘導する可能性がある。例は、最近開発されたトリプトファン(W)-およびアルギニン(R)が豊富なアンフィパシーペプチド(WrAP)を備えており、様々な細胞株における迅速かつ効率的なsiRNA送達を示した。最後に、これらの相互作用の性質と脂質に対する親和性を理解し、膜転座および/または内膜脱出を改善するために議論される。
Introduction
90年代に発見された後、細胞透過性ペプチド(CpP)は、原形質膜1,2を介した貨物の効率的な細胞送達を促進するために開発された。CpPは、通常、短いペプチド、一般的に8〜30個のアミノ酸、多種多様な起源を有する。彼らは最初に「直接転位」キャリアとして定義され、細胞膜を横断し、エネルギー要件も受容体関与も含み無い任意のエンドサイトー状態経路とは無関係に細胞に貨物を移すことができたことを意味する。しかし、さらなる調査は、これらの最初の観測は、主に、実験用アーティファクトおよび/またはメタノール3を用いた固定プロトコルによる蛍光過大評価から来たことを明らかにした。今日では、CPPの取り込みは、貨物の性質、CPPと貨物の間の使用リンク、研究されたセルラインなどの異なるパラメータに応じて、エンドサイトーシスとエネルギー独立転座4、5、6、7の両方で行われることが広く受け入れられています。
CpPは、CPPとその貨物8、9、10、11との間の化学的リンク(共有戦略)または静電/疎水性相互作用(非共有性戦略)を含む2つの戦略に従ってトランスフェクション剤として使用することができる。両方の戦略は、いくつかの貨物の細胞移動における効率を示しているが、CCPによる内在化のメカニズムの理解は依然として論争の下にあり、エンドサイトーシス経路または直接浸透間のバランスは12,13を測定することは依然として困難である。一連の実験ツールと戦略は、エンドサイトのプロセスの関与に明確に対処するために利用可能であるが、直接転位は、しかし、それは形質膜成分とのより離散的な相互作用を意味するので、より特徴付けが難しいようです。生体膜は通常、リン脂質から膜タンパク質まで、細胞の種類や環境(ストレス条件、細胞分裂など)によって異なる多くの成分で構成されています。この組成物の多様性、そして結果的に普遍的な細胞膜モデルの欠如は、単一の方法での研究を可能にしません。しかし、これらの限界を回避するために、ステップバイステップのアプローチは、人工膜または膜抽出物で開発された。小さな単層小胞から単層のアプローチまで、すべてのモデルは明らかに特定の質問14、15に答えるために関連していた。中でも、大きな単層小胞(RV)は、ペプチド/膜相互作用を内部化プロセスの重要なポイントとして研究するための適切な膜模倣モデルを構成しています。
この文脈において、以下のプロトコルは、陰イオン蛍光色素とリポソームに封入された対応するポリカチオンクエンチャーの両方のモニタリングを通じて、ペプチドおよびペプチド/膜相互作用がLUVの完全性に及ぼす影響の調査を記述する。このツールは、直接膜転座を行うことができるかどうかを理解するために、CPP/膜相互作用を研究するために使用されます。通常は異なる膜相互作用ペプチドを比較するために適用されますが、このLUV蛍光漏れアッセイは、CpPs-貨物コンジュゲート(共有戦略)とCPP:貨物複合体(非共有戦略)の両方を調査するためにも使用できます。
本プロトコルは、最近開発されたトリプトファン(W)とアルギニン(R)が豊富な媒性ペプチド(WRAP)16で最初に例示される。WRAPは、ペプチドベースのナノ粒子を形成し、いくつかの細胞株16において小さな干渉RNA(siRNA)を迅速かつ効率的に送達することができる。WRAPペプチド単独またはsiRNA搭載WRAPベースナノ粒子の蛍光漏れ特性をモニタリングし、細胞内在化のメカニズムを特徴付けた。我々は、内部化のメカニズムが主に直接転座7を含むことを示した。第2の例では、WRAPペプチドをタンパク質/タンパク質干渉ペプチドiCAL36(WRAP-iCAL36)17に共有結合し、膜を不安定化させる能力を、penetratin 18(Penetratin-iCAL36)と結合したiCAL36に対する蛍光漏れアッセイで比較した。
最後に、この方法の利点と限界は、技術的な観点から、生物学的関連性に関して議論される。
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Protocol
1. 大型ユニラメラベシクル(RV)の調製
- 蛍光漏れ測定のための細胞膜模倣として使用するためのLUVを準備します。
- ハミルトンガラス注射器ホスファチジルコリン(DOPC、786.11 g/mol)、スフィンゴミエリン(SM、760.22 g/mol)、コレステロール(Chol、386.65 g/mol)をモル比4:4:2で混ぜます。脂質溶液は、25 mLガラス丸底フラスコで25mg/mLのメタノール/クロロホルム(3/1;体積/体積)溶媒で可溶化した各脂質のストック溶液から得られます。4 μmolの DOPC、4 μmol SM、および 2 μmol の Chol に基づいて、脂質溶液は、それぞれ 126 μL、117 μL、および 31 μL を混合してストック溶液から得られます。
注意:メタノールは有毒で可燃性の溶媒であり、クロロホルムは有毒で発がん性があります。どちらもフードの下で適切な保護で処理する必要があります。 - 乾燥した脂質膜の形成まで60°Cで45〜60分の真空下でロータリーエバポレーターを使用してメタノール/クロロホルムを蒸発させます。
- 2つのストックHEPESバッファソリューションを準備します。HEPES バッファー 1 を 20 mM HEPES (238.3 g/mol) と 75 mM NaCl (58.44 g/mol) を混合して準備し、pH を 7.4 に調整します。20 mM HEPES と 145 mM NaCl を混合して HEPES バッファー 2 を準備し、pH を 7.4 に調整します。HEPESバッファーは、4°Cで1ヶ月間保存することができます。
メモ:オスマメーターを使用してバッファの浸透圧を確認することをお勧めします。 - 膜不浸透性蛍光色素クエンチャーカップル、8-アミノナフタレン-1、3、6-トリスルホン酸、12.5mM(ANTS、427.33 g/mol)の二ナトリウム塩、45 mM(DPX、422.16)の臭化液中にp-キシレンバイスピリジウム臭化物を溶解して脂質水和液を調製する。DPXとアリを混合すると、黄色の溶液が出ます。12.5 mMのANTSと45 mMのDPXの濃度を達成するために、HEPESバッファー1の4 mLにそれぞれ21.4mgおよび76mgを溶解する。
注:脂質ハイドレーション溶液は、チューブをアルミホイルで包むことで4°Cで2週間保存することができます。 - リコンセシスマルチラメラ小胞(MLV)は、乾燥した脂質水和溶液の1mLで乾燥した脂質膜を再懸濁し、乾燥した脂質膜を溶解するまでボルテックスすることにより行う。小さな脂質凝集体が前のステップに悪影響を及ぼすため、溶液が完全に可溶化していることを確認してください。また、ガラス丸底フラスコの壁面を確認して、残っている脂質フィルムがないことを確認します。
注: 溶液は可溶化後に青白色と淡黄色で表示されます。 - 小胞を5回凍結/解凍サイクルにして、単層小胞を得る。凍結ステップのために液体窒素に30sのガラス丸底フラスコを入れて、解凍ステップのために2分間水浴に残すことによって、各サイクルを実行します。
注:浴水の温度は、脂質の溶融温度よりも5〜10°C高くする必要があります。 - 2つのフィルターを挿入して脂質押出機を準備し、各ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)押出機片にHEPESバッファーを用いて予備加湿をサポートし、金属押出機キャニスターに入れ加工する。
- 1つのフィルターサポートの上部にHEPES加湿ポリカーボネート膜(0.1 μmの細孔サイズ、直径25mm)を入れます。
- 2つの金属押出機キャニスターを組み立て、ねじ込みます。
- 組み立てた押出機をホルダーに入れ、各ポリテトラフルオロエチレン押出機片の先端部に適当な穴に1mLシリンジを導入します。押出は、ポリカーボネート膜を通して一方のシリンジから他方への検査された液体の通過に相当する。
- 1 mL シリンジの 1 つに HEPES バッファーを 1 mL ロードして押出機をテストし、漏れや問題がないことを確認します。
- 1 mL HEPES バッファーを MLV サンプルに交換します。
- MLVサンプルを一方のシリンジから他方のシリンジに少なくとも21回通し、同じサイズの均一なRVを得ることによって押出を行う。
注:押出は、脂質混合物の溶融温度よりも高い温度で行われるべきです。
2. ルブの浄化
- 非カプセル化されたANTSおよびDPX過剰を除去するためにカラム精製を準備する。
- 液体クロマトグラフィーカラム(ルアーロック、ノンジャケット、1.0cm x 20cm、ベッド容積16mL)に0.01%NaN 3(65g/mol)を含む水媒体に再懸濁された架橋デキストランゲル(G-50)を、無色部分の上部から1cm下に1cm下に導入します。
- タップを開き、液体を流して架橋ドキストランゲルを落ち着かせる。
- 20mLのHEPESバッファー2で溶出してカラムを洗浄し、カラムの出力フローを廃棄します。
- カラム上の溶媒のデッドボリュームが最小になったら(<100 μL)、架橋ドキストランゲルの乾燥を避けるために十分な後にタップを閉じます。
- 押し出したてのSUV(黄色)をコラムに置き、架橋されたデキストランゲルに入ります。
- 列にHEPESバッファー2を連続的に加え、LUV精製を行う。
- 約2mLのHEPES緩衝液2(架橋ドキストランゲルの乾燥を避けるためにカラムの上部を定期的に充填することを忘れないでください):フリーイエローANTSおよびDPX溶液はリポソームよりも遅く移行します。
- チューブ(1.5 mL)内の精製されたLUVの収集を開始します。
- カラムからの溶離液の滴を観察し、それらが乳白色になると、リポソームが含まれています。チューブを変更して、LUV含有分率を回復します。
- 滴がもはや青白色(〜1 mL)になるまでエルテ。その後、別の分数で別の0.5 mLを溶出し、溶出を停止します。
注: キットや個々の分子量として、UV の溶出量を校正するために、幅広い分子量で規格が利用可能になりました。 - 蛍光色素の漂白を避けるために、チューブをアルミニウム箔でチューブに包みます。
- 20 mL HEPES バッファー 2 でカラムを洗います。
- その後、RVは4°Cで1週間保存することができます。
注意:LUVの安定性は、LUVの濃度と構成、およびイオン強度に依存する可能性があるため、LUVのサイズはダイナミック光散乱(DLS)機器を使用して制御する必要があります(セクション4を参照してください。各テストの前に、LUV サイズと同質性の特性を示します。
3. LUV の濃度を定量化する
- リン脂質定量キットによるLUV濃度を推定し、コリン濃度19の評価を可能にする。このアッセイは、極性頭部を含むコリンを含むリン脂質が実質的である場合に適用される可能性があります(rvvの>50%)。
- 18mgのクロモーゲン基質を3mLのバッファーに溶解して色試薬を調製する。
- ポリスチレンキュベットをロード, 10 x 10 x 45 mm, 色試薬の 3 mL.
- 純色試薬をブランク条件(ブランク)として使用してください。LUVサンプル(テスト)または既知のコリン濃度の標準溶液の20 μLを追加します(標準)。
- よく混ぜ、37 °Cのすべての条件(ブランク、テスト、および標準)で5分間インキュベートします。
- 試験試料の吸光度(光学密度、OD)を測定し、スペクトロフォトメーターで600nmでコントロールするブランク溶液を用いて標準溶液を測定します。
- 既知の濃度の標準と比較して、コリン相当のRVの脂質濃度を推定することを可能にするOD値をチェックしてください。
- 次の式を使用して計算を実行します。
C[LUV] (モル / l) = (OD サンプル / OD 標準) x C[標準] (モル / l)
注:リン脂質定量キットは、C[標準]=3.87 mmol/L.ODサンプルおよびOD標準のモル濃度に対応する54mg/dLのコリンクロライド(139.6 mg/l)標準溶液を提供し、それぞれLUVおよびコリン溶液の吸光度を600nmで測定した。
4. LUVサイズと均質性の特性
- LUV サイズ (nm) と多分散インデックス (PdI) を決定するために、DLS 計測器を使用して測定を実行します。
- 溶媒/バッファーおよび使用済キュベットの粘度を示すことによって、適切な「標準操作手順」(SOP)をプログラムします。
- 500 μL の LUV 溶液をポリスチレンセミマイクロキュベットに入れる。
- DLS装置にポリスチレンセミマイクロキュベットを挿入します。
- 室温では、粒子分布と均質性(多分散指数、PdI)の平均サイズ(Z平均)の観点からサイズ分布を測定する。
- すべての結果は、3つの繰り返しサイクルでそれぞれ実行される2つの独立した測定から得られます。
注: LUV の標準値は、0.149 ± 0.041 の PdI で 137 ± 7 nm の平均サイズになります。
5. ペプチド溶液の調製
- 漏れアッセイのために分析されるべきペプチドのストック溶液を準備する。
- ペプチド粉末(>純度>)を純水(例えば、純水500μLで1mgのペプチド)に溶解します。
注:ペプチドを純水中で希釈し、ジメチルスルホキシド(DMSO)の可溶化を避けることを推奨し、人工物を誘導する可能性があります(例えば、膜透過20)。 - 5 sのペプチド溶液をボルテックスする。
- 5分間水超音波浴でペプチド溶液を超音波処理し、12,225 x gで5分間遠心分離します。濃度決定のために上清を収集します。
- 3つの独立したペプチド希釈液の280 nmで吸光度を測定し、そのモル絶滅係数ε(ペプチド配列中のトリプトファンおよびチロシン含有量に依存する)およびビール・ランバート規則を用いてペプチド濃度を計算します。
注:ペプチドにトリプトファンおよびチロシンが含まれている場合、εモル絶滅係数はトリプトファンε= 5,690 M-1cm-1、チロシンε= 1,280 M -1 cm-1に基づいて計算されます。ペプチド配列にトリプトファンまたはチロシンが含まなければ、他の着色アッセイを行って濃度を測定することができます(例えば、BCAまたはブラッドフォード)。 - 純水でペプチド溶液を希釈し、最終溶液100μMにし、4°Cで保存します。
注:純水では、4°Cの保存中にペプチド分解は起こりません。しかし、水の蒸発が起こらないように、2週間ごとにペプチド濃度を測定する必要があります。
6. 蛍光漏れ測定
- 蛍光漏れ測定は、室温の分光蛍光計で測定されます。励起波長および発光波長はEx= 360 nm ±3 nm、Em = 530 nm ± 5 nm でそれぞれ 5 nm に固定されています。
- 1 mL HEPES バッファー 2 の LUV を、水晶蛍光キュベットで 100 μM の最終濃度に希釈します。磁気攪拌機を加えて、実験中に溶液を均質化します。
- バックグラウンド蛍光にアクセスするには、最初の100 s(t = 0 sとt = 99 sの間)で単独でLUVを測定します。
注: RV 単独は、バックグラウンドの蛍光と潜在的なリークにアクセスするために、実験全体(15 分)の間に測定することもできます。 - その後、次の900s(15分)に対するペプチド溶液のアリコートを添加した際の蛍光強度の増加として漏れを測定する。このプロトコルは、0.1 μMから2.5 μMまで試験したペプチドの濃度ごとに実行されます。
- 最後に、トリトンX-100(0.1%、v/v)の1μLを加えてLUVを可溶化することで100%蛍光を得て、t= 1,000 sとt=1,100sの間で完全に消し止められていないプローブを得ました。
7. 漏出の定量化
- テストされた各条件で同じポイント数を維持するために、t = 1,090 s の後に取得された値を抑制します。
- 最小蛍光 F分を計算するには、t = 0 s と t = 49 s (LUV 単体) の間の平均 50 ポイントを作成します。
- t = 1,041 s と t = 1,090 s (Triton X-100 を持つ LUV) の間の平均 50 ポイントを作ることによって、最大蛍光 Fmaxを計算します。
- 次の式に従って、各時点(t = x)における漏れ率(%リーク)を計算します。
%リーク(t=x) = (F(t=x) - F最小) / (F最大 - F最小値) x 100 - 同じ条件に対して異なる LUV 準備 (n ≥ 2) で取得された値の平均と標準偏差を計算します。
- 時間の関数で漏れ率%リーク(t=x)をプロットします。
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Representative Results
蛍光漏れ測定の原理を 図1に示す。詳細には、蛍光色素とクエンチャー(蛍光シグナルなし)をカプセル化した大きなユニラメラ小胞(RV)を、目的の生体分子で処理します。脂質膜とのペプチドの相互作用により、膜透過性、再編成、あるいは破裂を意味する可能性があるため、蛍光色素およびクエンチャーは、RVから放出される。バッファー内のその後の希釈は、増加した蛍光シグナルをもたらす。
このスキームは、自由なペプチドを用いたテストを表示しますが、システムの利点は、脂質膜を不安定化させる疑いがある貨物共役ペプチド、ペプチドベースのナノ粒子または他の生体高分子もテストする能力にあります。特に試験された分子に関してプロトコルの予備的な最適化が必要であるが、この蛍光漏れアッセイは、膜相互作用成分の多種多様に拡張されるかもしれない。本プロトコルでは、CCPとそれらの複雑化(非共有戦略)または共役(共有戦略)形式で得られたいくつかの結果を示す。以下の例は、単独でWRAPを意味し、siRNA搭載WRAPベースのナノ粒子と2つの異なるペプチドコンジュゲート(WRAP-iCAL3617 およびペネクラチン-iCAL36)を意味する。
非共有化戦略に関して、RNAの存在下でのペプチドおよび対応するsiRNA搭載ナノ粒子を用いた蛍光漏れ測定が図2に示されている。小胞は、KONATEら21に記載されている形質膜を反映したDOPC/SM/Chol(4:4:2)の混合物で構成され、通常、フリーラップおよびラップベースナノ粒子7の脂質二重層相互作用および/または形質伝達特性の可能性を直接評価するために使用される。ペプチドが存在しない場合、漏れは認められず(最初の100sの間にベースライン)。LUVにフリーラップを追加すると、重要なLUV漏れおよびアリ放出を明らかにする蛍光の有意な増加を誘発する。15分後、トリトン条件(陽性対照)と比較して67.8%±0.4%の漏れが、WRAPペプチドの使用濃度(2.5μM)で得られます。なお、ここでいくつかの異なる濃度も試験され、用量依存性蛍光上昇を明らかにしており、用量依存性のLUV漏出7に対応する。対照的に、WRAPをsiRNAと同じ濃度で組み立ててペプチドベースのナノ粒子を形成すると、漏れは遊離ペプチドと比較して1.5倍弱(40.5%±0.5%)(図2)。。RICKペプチド(60%)またはRICK:siRNAナノ粒子(28%)22に対して同様の漏れ値が報告されている。ナノ粒子と比較した遊離ペプチド間の値の差は、ナノ粒子に関与すると、ペプチドのかなりの部分がsiRNAとの直接相互作用に関与し、脂質との相互作用のためのペプチドの可用性を低下させるという事実によって説明されるかもしれない。
共有戦略に関して、Luvの存在下でのCPP結合体を用いた蛍光漏れアッセイを図3に示す。同じLUV組成[DOPC/SM/Chol(4:4:2)]では、WRAP-iCAL36とペネタチン-iCAL36の2つの共役ペプチドが適用されます。既に気づいたように、ペプチドの不在時に漏れは見られない。15分2.5μMのペネプラチンiCAL36を注入した後、有意な蛍光増加は検出されない(2.3%±0.7%)、ラップ-iCAL36の2.5μMを添加すると非常に強い蛍光信号(85.8%±11.1%)を特徴とするネット漏れを誘発する。これらの観察は、一部のペプチド、またはコンジュゲートでは、蛍光漏れが起こり得ない、ペプチド/膜相互作用または脂質二重層障害がないことを示唆していることを示している。これは、以前に公表された結果に従って、ペネトラットンとTatが膜23、24、25を不安定にすることが出来なかった。CPPの膜不安定性は、結合貨物26に応じて変化する可能性があることを強調すべきである。
さらに、WRAP-iCAL36は強い漏れを引き起こしたが、追加の研究は、特定の細胞内在化を明らかにしていない、これらのコンジュゲートが、形質膜17の脂質二重層の内側に残っていることを示す。WRAPナノ粒子とは対照的に、WRAP-CARGOコンジュゲートは、脂質鎖間に付着したり、細孔を形成することによって、LUV膜を不安定化させることができると仮定します。
これらの結果は、蛍光漏れ測定がペプチド/膜相互作用を開発する一部のCpPの能力を明らかにする可能性があることを示しており、多かれ少なかれ顕著な膜透過性を引き起こすことができる。さらに、これらの相互作用は、貨物の送達戦略(ナノ粒子 対 共役体)の戦略が何であれ起こりうる。逆に、この方法は、蛍光漏れを誘発しないCPPが脂質の二層または生物学的膜と相互作用する可能性があるかどうかを判別しない。この種の行動には、ゼータ電位測定、ペプチドと膜間のFRET、またはトリプトファン蛍光実験などの追加アプローチが必要です。
図1:蛍光漏れ測定の原理 UVには蛍光色素(ANTS)が白色で、対応するクエンチャー(DPX)がグレーでロードされました。ペプチド(赤色)が存在しない場合、DPXによりANTS蛍光が消光されたため蛍光シグナルは認められなかった。RVにペプチドを付加した膜透過性と、その後のANTSおよびDPXの放出は、ANTS蛍光(黄色)の有意な増加をもたらした。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:フリーラップとラップ:siRNAナノ粒子による蛍光漏れ測定ペプチド単独およびsiRNA搭載ナノ粒子を2.5μMのペプチド濃度でLUVに適用した。黒矢印は、それぞれペプチド(ナノ粒子)およびトリトンX-100の注射を示す。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:WRAP-iCAL36およびペネタチン-iCAL36コンジュゲートによる蛍光漏れアッセイ コンジュゲートは2.5 μMの濃度でLUVに適用され、ブラック矢印はそれぞれペプチドおよびTriton X-100の注射を示す。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
提示された蛍光漏れアッセイは、細胞透過性ペプチドによる膜不安定化に対処するための簡単で迅速な方法です。容易に行うと、それはまた、異なる膜相互作用ペプチドまたは他の膜相互作用分子間の間接的な比較を可能にする。プロトコルの重要なステップに関しては、このアッセイはベースライン(LUV単独)と最大蛍光放出(トリトン条件)の間の相対的な値を提供するので、通常、我々は、LUVのコリン寄与のみを推定するリン脂質定量化キットを用いて、RVの濃度を評価する。しかし、Rouserと同僚27と同僚27 によって説明された酸消化によって、またはBartlett28 またはリン脂質を含むアンモニウムフェロチオシアネートを用いた着色法によって、より正確なLUV濃度の測定を含めることもできる。私たちの手では、漏出の相対的な定量化や膜相互作用ペプチド間の比較に影響を与えません。
LUV の使用に関しては、LUV のベースラインの状態を制御して、それらが使用可能であるかどうか、およびすでに漏れを示しているかどうかを確認する必要があります (蛍光の連続的な増加を特徴とする)。同様に、望ましくないクエンチプロセス(例えば、ペプチド/色素のクエンチ)のために偽陰性の結果が記録されないように、各ペプチドインキュベーション後の最大蛍光放出を測定することが重要です。
一般に、DLS特性評価によれば、LUVは1週間安定しており、蛍光の背景が高すぎるのは表示されません。この文脈では、ゲル濾過によるANTS/DPX装填リポソームの精製も、バックグラウンドに寄与したり蛍光過大評価を生じさせる残留蛍光を持たずにLUVの形成を可能にするため、重要なポイントです。さらに、常に同じ漏出率を与えることができる特定の正の制御を含めることによってプロトコルを較正することを強く推奨します。これは、さまざまな測定値を通じて内部制御を構成し、各テストの LUV の特性を強化し、統計情報を増加させる可能性があります。
蛍光漏れアッセイは、CPSによる膜不安定化の迅速な比較を提供するかもしれないが、一部のペプチドは膜の乱れや漏出を誘発することなく脂質二重層と相互作用することができるので、ペプチド膜相互作用の解釈には限定的である。これらのペプチドについては、FRET30を有効にする特定の蛍光マーカーを用いて追加の実験を行うことを強く推奨する。
また、他の蛍光色素/クエンチャーペア(例えば、Tb3+/DPA31)を用いることができることにも留意すべきである。テルビウム(III)は水にあまり溶けず、リン酸の存在下では使用できないのに対し、ANTSクエンチングはDPX濃度の線形関数ではありません。さらに、70 mMカルセイン溶液32やデキストランPTS33などの他の自己消満材料は、分析されたペプチドまたは化合物によって引き起こされる膜欠陥に応じて処理することができる。
最後に、この蛍光漏れアッセイの主な利点は、多数の潜在的な膜相互作用分子ならびに異なる膜組成を試験する能力です。 例えば、エンドソーム膜模倣[例えば、ジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)/ジオレオイルホスファ・ジプレロアミン(DOPE)/大豆由来ホスファチジリノシトール(PI)/ビス(モノオレロイルグリセリド)リン酸(LBPA)5:2:24]、ミトコンドリア膜は、例えば、46.5%のDOPC、28.5%ホスファチジルエタノールアミン(PE)、9%ホスファチジルイノシトール(PI)、9%ホスファチジルセリン(PS)、および7%カーディオリピン(CL)35または他の任意の所望の脂質二重層組成物を模倣する。しかし、まず、実験と保管中に100nm近くの平均サイズを有する小胞の安定性(LUV融合、凝集、または沈殿、懸濁液から脱落しない脂質、負の膜湾曲なし)の安定性を確保する必要があります。
また、抽出された膜(赤血球、ミトコンドリアなど)と比較してこの方法の利点は、タンパク質の存在しない場合の精製された十分に特徴付けられる脂質の使用である。脂質二重層組成物(血漿、内膜、またはミトコンドリア膜)の制御はまた、特定の膜タンパク質(プロトンポンプ)の挿入を可能にする。さらに、UV内部環境と外部環境の両方を制御する機能により、膜の乱れ/漏出を明確に解釈することができます。膜透過性イベントを可視化することもできる黒脂質膜実験36と比較して、この漏れプロトコルは膜活性ペプチドのより簡単なスクリーニング方法を提供する。
結論として、この単純な方法は、膜不安定化につながる強いペプチド/膜相互作用の迅速な同定を好む。CpPsの内在化のメカニズムを調べ、フジオジェニックペプチドや抗菌ペプチドなどの「膜活性ペプチド」のより一般的なアプローチで応用することができる。
一般に、CCPが細胞質に到達するために使用する主な経路の特徴付けは非常に複雑であり、生物物理学から細胞生物学に至るいくつかの明確なアプローチが必要です。例えば、WRAP内在化の調査では、細胞に入る異なるメカニズム(エンドサイトーシス 対 直接転座)と蛍光漏れアッセイとの間のバランスを明らかにした、 他の方法に関連する、直接浸透プロセス7を支持する。
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Disclosures
著者には利益相反はありません。
Acknowledgments
著者たちは、エミリー・ジョッセが原稿の批判的なレビューに感謝したいと思います。この作品は、財団「ラ・リーグ・コントル・ル・ガン」「フォンダシオンARCはラ・レシェルシュ・シュル・ル・ガンを注ぐ」、そして「センター・ナショナル・デ・ラ・レシェルシュ・サイエンティフィック」(CNRS)によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 mL glass round-bottom flask | Pyrex | ||
| 8-aminonaphthalene-1, 3, 6-trisulfonic acid, disodium salt (ANTS) | Invitrogen | A350 | Protect from light |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| DOPC (dioleoylphosphatidylcholine) | Avanti Polar | 850375P | Protect from air |
| Extruder | Avanti Polar | 610000 | |
| Fluorimeter | PTI Serlabo | ||
| 50 µL glass syringe | Hamilton | 705N | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| LabAssay Phospholipid | WAKO | 296-63801 | |
| liquid chromatography column | Sigma-Aldrich | ||
| Methanol | Carlo Erba | 414902 | |
| Nuclepore polycarbonate membrane (0.1 µm pore size, 25 mm diameter) | Whatman | 800309 | |
| polystyrene cuvette, 10 x 10 x 45 mm | Grener Bio-One | 614101 | |
| polystyrene semi-micro cuvette, DLS | Fisher Scientific | FB55924 | |
| p-xylene-bispyridinium bromide (DPX) | Invitrogen | X1525 | Protect from light |
| quartz fluorescence cuvette | Hellma | 109.004F-QS | |
| rotavapor system | Heidolph | Z334898 | |
| Sephadex G-50 resin | Amersham | 17-0042-01 | |
| Sodium azide (NaN3) | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium chlorid (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sonicator bath USC300T | VWR | 142-6001 | |
| Sphingomyelin | Avanti Polar | 860062P | Protect from air |
| Triton X-100 | Eromedex | 2000-B | |
| Zetaziser NanoZS | Malvern | ZEN3500 |
References
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