Vi tilbyr en trinnvis protokoll for fullmontert immunfluorescensfarging av sinoatrialknuten (SAN) og atrioventrikulær knute (AVN) i murine hjerter.
Det elektriske signalet fysiologisk generert av pacemakerceller i sinoatrialknuten (SAN) utføres gjennom ledningssystemet, som inkluderer atrioventrikulær knutepunkt (AVN), for å tillate eksitasjon og sammentrekning av hele hjertet. Enhver dysfunksjon av enten SAN eller AVN resulterer i arytmier, noe som indikerer deres grunnleggende rolle i elektrofysiologi og arytmogenese. Musemodeller er mye brukt i arytmiforskning, men den spesifikke undersøkelsen av SAN og AVN er fortsatt utfordrende.
SAN ligger ved krysset mellom crista terminalis med den overlegne vena cava og AVN ligger ved toppen av trekanten Koch, dannet av åpningen av koronar sinus, tricuspid annulus og senen til Todaro. På grunn av den lille størrelsen er visualisering ved konvensjonell histologi imidlertid fortsatt utfordrende, og det tillater ikke studier av SAN og AVN i deres 3D-miljø.
Her beskriver vi en helmontert immunfluorescenstilnærming som tillater lokal visualisering av merket mus SAN og AVN. Helmontert immunfluorescensfarging er beregnet for mindre seksjoner av vev uten behov for manuell seksjonering. Til dette formål dissekeres musehjertet, med uønsket vev fjernet, etterfulgt av fiksering, permeabilisering og blokkering. Celler i ledningssystemet i SAN og AVN blir deretter farget med et anti-HCN4 antistoff. Konfokal laserskanningsmikroskopi og bildebehandling tillater differensiering mellom nodalceller og arbeidende kardiomyocytter, og å tydelig lokalisere SAN og AVN. Videre kan ytterligere antistoffer kombineres for å merke andre celletyper også, for eksempel nervefibre.
Sammenlignet med konvensjonell immunohistologi bevarer helmontert immunfluorescensfarging den anatomiske integriteten til hjerteledningssystemet, og tillater dermed undersøkelse av AVN; Spesielt så inn i deres anatomi og interaksjoner med det omkringliggende arbeidsmyokardiet og ikke-myocyttceller.
Arytmier er vanlige sykdommer som rammer millioner av mennesker, og er årsaken til betydelig sykelighet og dødelighet over hele verden. Til tross for enorme fremskritt innen behandling og forebygging, som utvikling av hjertepacemakere, er behandling av arytmier fortsatt utfordrende, først og fremst på grunn av svært begrenset kunnskap om underliggende sykdomsmekanismer 1,2,3. En bedre forståelse av både normal elektrofysiologi og patofysiologi av arytmier kan bidra til å utvikle nye, innovative og kausale behandlingsstrategier i fremtiden. I tillegg, for å studere arytmogenese grundig, er det viktig å lokalisere og visualisere det spesifikke hjerteledningssystemet i dyremodeller som musen, da mus er mye brukt i elektrofysiologiforskning.
De viktigste delene av hjerteledningssystemet er sinoatrialknuten (SAN), hvor den elektriske impulsen genereres i spesialiserte pacemakerceller, og atrioventrikulær knute (AVN), som er den eneste elektriske forbindelsen mellom atriene og ventriklene4. Når de elektrofysiologiske egenskapene til SAN og AVN endres, kan arytmier som syk sinus syndrom eller atrioventrikulært blokk forekomme som kan føre til hemodynamisk forverring, synkope og til og med død, og dermed understreke den essensielle rollen til både SAN og AVN i elektrofysiologi og arytmogenese5.
Omfattende studier på SAN eller AVN krever en presis lokalisering og visualisering av begge strukturer, ideelt innenfor deres fysiologiske miljø. På grunn av deres lille størrelse og plassering i arbeidsmyokardiet, uten å etablere en klar makroskopisk synlig struktur, er det imidlertid utfordrende å studere anatomien og elektrofysiologien til SAN og AVN. Anatomiske landemerker kan brukes til å grovt identifisere regionen som inneholder SAN og AVN 6,7,8. Kort fortalt ligger SAN i interkavalområdet i høyre atrium ved siden av muskelcrista terminalis (CT), AVN ligger innenfor trekanten av Koch etablert av trikuspidalklaffen, ostium av koronar sinus og senen til Todaro. Så langt ble disse anatomiske landemerkene hovedsakelig brukt til å lokalisere, fjerne og deretter studere SAN og AVN som individuelle strukturer (f.eks. Ved konvensjonell histologi). For bedre å forstå den komplekse elektrofysiologien til SAN og AVN (f.eks. regulatoriske effekter av tilstøtende celler i arbeidsmyokardiet), er det imidlertid nødvendig å studere ledningssystemene i det fysiologiske 3D-miljøet.
Helmontert immunfluorescensfarging er en metode som brukes til å studere anatomiske strukturer in situ samtidig som integriteten til det omkringliggende vevet 9 opprettholdes. Ved å dra nytte av konfokalmikroskopi og bildeanalyseprogramvare, kan SAN og AVN visualiseres med fluorescerende merkede antistoffer rettet mot ionkanaler spesielt uttrykt i disse regionene.
Denne følgende protokollen forklarer de nødvendige trinnene for å utføre en veletablert helmontert fargemetode for lokalisering og visualisering av SAN- og AVN-mikroskop. Spesifikt beskriver denne protokollen hvordan (1) å lokalisere SAN og AVN ved anatomiske landemerker for å forberede disse prøvene for farging og mikroskopianalyse (2) for å utføre helmontert immunfluorescensfarging av referansemarkørene HCN4 og Cx43 (3) for å forberede SAN- og AVN-prøver for konfokalmikroskopi (4) for å utføre konfokal avbildning av SAN og AVN. Vi beskriver også hvordan denne protokollen kan modifiseres for å inkludere ytterligere farging av omkringliggende arbeidende myokardceller eller ikke-myocyttceller som autonome nervefibre som muliggjør en grundig undersøkelse av hjerteledningssystemet i hjertet.
Hjerteanatomi har tradisjonelt vært studert ved hjelp av tynne histologiske snitt11. Disse metodene bevarer imidlertid ikke den tredimensjonale strukturen til ledningssystemet og gir dermed bare 2D-informasjon. Den helmonterte immunfluorescensfargeprotokollen beskrevet her gjør det mulig å overvinne disse begrensningene og kan rutinemessig brukes til SAN- og AVN-avbildning.
Sammenlignet med standardmetoder som konvensjonell immunhistokjemi som krever parafininnebyggi…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av China Scholarship Council (CSC, til R. Xia), det tyske senteret for kardiovaskulær forskning (DZHK; 81X2600255 til S. Clauss, 81Z0600206 til S. Kääb), Corona Foundation (S199/10079/2019 til S. Clauss), SFB 914 (prosjekt Z01 til H. Ishikawa-Ankerhold og S. Massberg og prosjekt A10 til C. Schulz), ERA-NET om kardiovaskulære sykdommer (ERA-CVD; 01KL1910 til S. Clauss) og Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (til S. Clauss). Finansiørene hadde ingen rolle i manuskriptutarbeidelsen.
Anesthesia | |||
Isoflurane vaporizer system | Hugo Sachs Elektronik | 34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910 | Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters |
Modified Bain circuit | Hugo Sachs Elektronik | 73-4860 | Includes an anesthesia mask for mice |
Surgical Platform | Kent Scientific | SURGI-M | |
In vivo instrumentation | |||
Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
Iris scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
Spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
Tissue forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
Tissue pins | Fine Science Tools | 26007-01 | Could use 27G needles as a substitute |
General lab instruments | |||
Orbital shaker | Sunlab | D-8040 | |
Magnetic stirrer | IKA | RH basic | |
Pipette,volume 10 µL, 100 µL, 1000 µL | Eppendorf | Z683884-1EA | |
Microscopes | |||
Dissection stereo- zoom microscope | VWR | 10836-004 | |
Laser Scanning Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 | |
Software | |||
Imaris 8.4.2 | Oxford instruments | ||
ZEN 2.3 SP1 black | Zeiss | ||
General Lab Material | |||
0.2 µm syringe filter | Sartorius | 17597 | |
100 mm petri dish | Falcon | 351029 | |
27G needle | BD Microlance 3 | 300635 | |
50 ml Polypropylene conical Tube | Falcon | 352070 | |
5ml Syringe | Braun | 4606108V | |
Cover slips | Thermo Scientific | 7632160 | |
Eppendorf Tubes | Eppendorf | 30121872 | |
Chemicals | |||
0.5 M EDTA | Sigma | 20-158 | Components of TEA |
16% Formaldehyde Solution | Thermo Scientific | 28908 | use as a 4% solution |
Acetic acid | Merck | 100063 | Components of TEA |
Agarose | Biozym | 850070 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-094 | |
Normal goat serum | Sigma | NS02L | |
Sucrose | Sigma | S1888-1kg | |
Tris-base | Roche | TRIS-RO | Components of TEA |
Triton X-100 | Sigma | T8787-250ml | Diluted to 1% in PBS |
Tween 20 | Sigma | P2287-500ml | |
Drugs | |||
Fentanyl 0.5 mg/10 mL | Braun Melsungen | ||
Isoflurane 1 mL/mL | Cp-pharma | 31303 | |
Oxygen 5 L | Linde | 2020175 | Includes a pressure regulator |
Antibodies | |||
Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Cell Signaling Technology | #4412 | diluted to 1:200 |
Goat anti-Rat IgG Alexa Fluor 647 | Invitrogen | #A-21247 | diluted to 1:200 |
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI) | Invitrogen | H3570 | diluted to 1:1000 |
Rabbit Anti-Connexin-43 | Sigma | C6219 | diluted to 1:200 |
Rat anti-HCN4 (SHG 1E5) | Invitrogen | MA3-903 | diluted to 1:200 |
Other | |||
Plastic ring | Self-designed and 3D printed | ||
Plasticine | Cernit | 49655005 | |
Silikonpasten, Baysilone | VWR | 291-1220 | |
Animals | |||
Mouse, C57BL/6 | The Jackson Laboratory |