Helmontert immunfluorescensfarging, konfokal avbildning og 3D-rekonstruksjon av sinoatriell og atrioventrikulær knute i mus
Summary
Vi tilbyr en trinnvis protokoll for fullmontert immunfluorescensfarging av sinoatrialknuten (SAN) og atrioventrikulær knute (AVN) i murine hjerter.
Abstract
Det elektriske signalet fysiologisk generert av pacemakerceller i sinoatrialknuten (SAN) utføres gjennom ledningssystemet, som inkluderer atrioventrikulær knutepunkt (AVN), for å tillate eksitasjon og sammentrekning av hele hjertet. Enhver dysfunksjon av enten SAN eller AVN resulterer i arytmier, noe som indikerer deres grunnleggende rolle i elektrofysiologi og arytmogenese. Musemodeller er mye brukt i arytmiforskning, men den spesifikke undersøkelsen av SAN og AVN er fortsatt utfordrende.
SAN ligger ved krysset mellom crista terminalis med den overlegne vena cava og AVN ligger ved toppen av trekanten Koch, dannet av åpningen av koronar sinus, tricuspid annulus og senen til Todaro. På grunn av den lille størrelsen er visualisering ved konvensjonell histologi imidlertid fortsatt utfordrende, og det tillater ikke studier av SAN og AVN i deres 3D-miljø.
Her beskriver vi en helmontert immunfluorescenstilnærming som tillater lokal visualisering av merket mus SAN og AVN. Helmontert immunfluorescensfarging er beregnet for mindre seksjoner av vev uten behov for manuell seksjonering. Til dette formål dissekeres musehjertet, med uønsket vev fjernet, etterfulgt av fiksering, permeabilisering og blokkering. Celler i ledningssystemet i SAN og AVN blir deretter farget med et anti-HCN4 antistoff. Konfokal laserskanningsmikroskopi og bildebehandling tillater differensiering mellom nodalceller og arbeidende kardiomyocytter, og å tydelig lokalisere SAN og AVN. Videre kan ytterligere antistoffer kombineres for å merke andre celletyper også, for eksempel nervefibre.
Sammenlignet med konvensjonell immunohistologi bevarer helmontert immunfluorescensfarging den anatomiske integriteten til hjerteledningssystemet, og tillater dermed undersøkelse av AVN; Spesielt så inn i deres anatomi og interaksjoner med det omkringliggende arbeidsmyokardiet og ikke-myocyttceller.
Introduction
Arytmier er vanlige sykdommer som rammer millioner av mennesker, og er årsaken til betydelig sykelighet og dødelighet over hele verden. Til tross for enorme fremskritt innen behandling og forebygging, som utvikling av hjertepacemakere, er behandling av arytmier fortsatt utfordrende, først og fremst på grunn av svært begrenset kunnskap om underliggende sykdomsmekanismer 1,2,3. En bedre forståelse av både normal elektrofysiologi og patofysiologi av arytmier kan bidra til å utvikle nye, innovative og kausale behandlingsstrategier i fremtiden. I tillegg, for å studere arytmogenese grundig, er det viktig å lokalisere og visualisere det spesifikke hjerteledningssystemet i dyremodeller som musen, da mus er mye brukt i elektrofysiologiforskning.
De viktigste delene av hjerteledningssystemet er sinoatrialknuten (SAN), hvor den elektriske impulsen genereres i spesialiserte pacemakerceller, og atrioventrikulær knute (AVN), som er den eneste elektriske forbindelsen mellom atriene og ventriklene4. Når de elektrofysiologiske egenskapene til SAN og AVN endres, kan arytmier som syk sinus syndrom eller atrioventrikulært blokk forekomme som kan føre til hemodynamisk forverring, synkope og til og med død, og dermed understreke den essensielle rollen til både SAN og AVN i elektrofysiologi og arytmogenese5.
Omfattende studier på SAN eller AVN krever en presis lokalisering og visualisering av begge strukturer, ideelt innenfor deres fysiologiske miljø. På grunn av deres lille størrelse og plassering i arbeidsmyokardiet, uten å etablere en klar makroskopisk synlig struktur, er det imidlertid utfordrende å studere anatomien og elektrofysiologien til SAN og AVN. Anatomiske landemerker kan brukes til å grovt identifisere regionen som inneholder SAN og AVN 6,7,8. Kort fortalt ligger SAN i interkavalområdet i høyre atrium ved siden av muskelcrista terminalis (CT), AVN ligger innenfor trekanten av Koch etablert av trikuspidalklaffen, ostium av koronar sinus og senen til Todaro. Så langt ble disse anatomiske landemerkene hovedsakelig brukt til å lokalisere, fjerne og deretter studere SAN og AVN som individuelle strukturer (f.eks. Ved konvensjonell histologi). For bedre å forstå den komplekse elektrofysiologien til SAN og AVN (f.eks. regulatoriske effekter av tilstøtende celler i arbeidsmyokardiet), er det imidlertid nødvendig å studere ledningssystemene i det fysiologiske 3D-miljøet.
Helmontert immunfluorescensfarging er en metode som brukes til å studere anatomiske strukturer in situ samtidig som integriteten til det omkringliggende vevet 9 opprettholdes. Ved å dra nytte av konfokalmikroskopi og bildeanalyseprogramvare, kan SAN og AVN visualiseres med fluorescerende merkede antistoffer rettet mot ionkanaler spesielt uttrykt i disse regionene.
Denne følgende protokollen forklarer de nødvendige trinnene for å utføre en veletablert helmontert fargemetode for lokalisering og visualisering av SAN- og AVN-mikroskop. Spesifikt beskriver denne protokollen hvordan (1) å lokalisere SAN og AVN ved anatomiske landemerker for å forberede disse prøvene for farging og mikroskopianalyse (2) for å utføre helmontert immunfluorescensfarging av referansemarkørene HCN4 og Cx43 (3) for å forberede SAN- og AVN-prøver for konfokalmikroskopi (4) for å utføre konfokal avbildning av SAN og AVN. Vi beskriver også hvordan denne protokollen kan modifiseres for å inkludere ytterligere farging av omkringliggende arbeidende myokardceller eller ikke-myocyttceller som autonome nervefibre som muliggjør en grundig undersøkelse av hjerteledningssystemet i hjertet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hjerteanatomi har tradisjonelt vært studert ved hjelp av tynne histologiske snitt11. Disse metodene bevarer imidlertid ikke den tredimensjonale strukturen til ledningssystemet og gir dermed bare 2D-informasjon. Den helmonterte immunfluorescensfargeprotokollen beskrevet her gjør det mulig å overvinne disse begrensningene og kan rutinemessig brukes til SAN- og AVN-avbildning.
Sammenlignet med standardmetoder som konvensjonell immunhistokjemi som krever parafininnebyggi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av China Scholarship Council (CSC, til R. Xia), det tyske senteret for kardiovaskulær forskning (DZHK; 81X2600255 til S. Clauss, 81Z0600206 til S. Kääb), Corona Foundation (S199/10079/2019 til S. Clauss), SFB 914 (prosjekt Z01 til H. Ishikawa-Ankerhold og S. Massberg og prosjekt A10 til C. Schulz), ERA-NET om kardiovaskulære sykdommer (ERA-CVD; 01KL1910 til S. Clauss) og Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (til S. Clauss). Finansiørene hadde ingen rolle i manuskriptutarbeidelsen.
Materials
| Anesthesia | |||
| Isoflurane vaporizer system | Hugo Sachs Elektronik | 34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910 | Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters |
| Modified Bain circuit | Hugo Sachs Elektronik | 73-4860 | Includes an anesthesia mask for mice |
| Surgical Platform | Kent Scientific | SURGI-M | |
| In vivo instrumentation | |||
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Iris scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Tissue forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
| Tissue pins | Fine Science Tools | 26007-01 | Could use 27G needles as a substitute |
| General lab instruments | |||
| Orbital shaker | Sunlab | D-8040 | |
| Magnetic stirrer | IKA | RH basic | |
| Pipette,volume 10 µL, 100 µL, 1000 µL | Eppendorf | Z683884-1EA | |
| Microscopes | |||
| Dissection stereo- zoom microscope | VWR | 10836-004 | |
| Laser Scanning Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| Software | |||
| Imaris 8.4.2 | Oxford instruments | ||
| ZEN 2.3 SP1 black | Zeiss | ||
| General Lab Material | |||
| 0.2 µm syringe filter | Sartorius | 17597 | |
| 100 mm petri dish | Falcon | 351029 | |
| 27G needle | BD Microlance 3 | 300635 | |
| 50 ml Polypropylene conical Tube | Falcon | 352070 | |
| 5ml Syringe | Braun | 4606108V | |
| Cover slips | Thermo Scientific | 7632160 | |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 30121872 | |
| Chemicals | |||
| 0.5 M EDTA | Sigma | 20-158 | Components of TEA |
| 16% Formaldehyde Solution | Thermo Scientific | 28908 | use as a 4% solution |
| Acetic acid | Merck | 100063 | Components of TEA |
| Agarose | Biozym | 850070 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153-100G | |
| DPBS (1X) Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-094 | |
| Normal goat serum | Sigma | NS02L | |
| Sucrose | Sigma | S1888-1kg | |
| Tris-base | Roche | TRIS-RO | Components of TEA |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250ml | Diluted to 1% in PBS |
| Tween 20 | Sigma | P2287-500ml | |
| Drugs | |||
| Fentanyl 0.5 mg/10 mL | Braun Melsungen | ||
| Isoflurane 1 mL/mL | Cp-pharma | 31303 | |
| Oxygen 5 L | Linde | 2020175 | Includes a pressure regulator |
| Antibodies | |||
| Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Cell Signaling Technology | #4412 | diluted to 1:200 |
| Goat anti-Rat IgG Alexa Fluor 647 | Invitrogen | #A-21247 | diluted to 1:200 |
| Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI) | Invitrogen | H3570 | diluted to 1:1000 |
| Rabbit Anti-Connexin-43 | Sigma | C6219 | diluted to 1:200 |
| Rat anti-HCN4 (SHG 1E5) | Invitrogen | MA3-903 | diluted to 1:200 |
| Other | |||
| Plastic ring | Self-designed and 3D printed | ||
| Plasticine | Cernit | 49655005 | |
| Silikonpasten, Baysilone | VWR | 291-1220 | |
| Animals | |||
| Mouse, C57BL/6 | The Jackson Laboratory | ||
References
- Clauss, S., et al. Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals. Nature Reviews Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).
- Clauss, S., et al. Characterization of a porcine model of atrial arrhythmogenicity in the context of ischaemic heart failure. PLoS One. 15 (5), 0232374 (2020).
- Schuttler, D., et al. Animal Models of Atrial Fibrillation. Circulation Research. 127 (1), 91-110 (2020).
- van Weerd, J. H., Christoffels, V. M. The formation and function of the cardiac conduction system. Development. 143 (2), 197-210 (2016).
- Vogler, J., Breithardt, G., Eckardt, L. Bradyarrhythmias and Conduction Blocks. Revista Española de Cardiología (English Edition. 65 (7), 656-667 (2012).
- Wen, Y., Li, B. Morphology of mouse sinoatrial node and its expression of NF-160 and HCN4. International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (8), 13383-13387 (2015).
- Verheijck, E. E., et al. Electrophysiological features of the mouse sinoatrial node in relation to connexin distribution. Cardiovascular Research. 52 (1), 40-50 (2001).
- Glukhov, A. V., Fedorov, V. V., Anderson, M. E., Mohler, P. J., Efimov, I. R. Functional anatomy of the murine sinus node: high-resolution optical mapping of ankyrin-B heterozygous mice. American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology. 299 (2), H482-H491 (2010).
- Sillitoe, R. V., Hawkes, R. Whole-mount immunohistochemistry: a high-throughput screen for patterning defects in the mouse cerebellum. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 50 (2), 235-244 (2002).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
- Liu, J., Dobrzynski, H., Yanni, J., Boyett, M. R., Lei, M. Organisation of the mouse sinoatrial node: structure and expression of HCN channels. Cardiovascular Research. 73 (4), 729-738 (2007).
- Muller-Taubenberger, A. Application of fluorescent protein tags as reporters in live-cell imaging studies. Methods Mol Biol. 346, 229-246 (2006).
- Müller-Taubenberger, A., Ishikawa-Ankerhold, H. C., Eichinger, L., Rivero, F. . Dictyostelium discoideum Protocol. , 93-112 (2013).
- Shaw, P. J., Pawley, J. B. . Handbook Of Biological Confocal Microscopy. , 453-467 (2006).
- Huff, J. The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. Nature Methods. 12 (12), (2015).
- Rysevaite, K., et al. Immunohistochemical characterization of the intrinsic cardiac neural plexus in whole-mount mouse heart preparations. Heart Rhythm. 8 (5), 731-738 (2011).
- Acar, M., et al. Deep imaging of bone marrow shows non-dividing stem cells are mainly perisinusoidal. Nature. 526 (7571), 126-130 (2015).
- Brahmajothi, M. V., Morales, M. J., Campbell, D. L., Steenbergen, C., Strauss, H. C. Expression and distribution of voltage-gated ion channels in ferret sinoatrial node. Physiological Genomics. 42 (2), 131-140 (2010).
- Mesirca, P., et al. Cardiac arrhythmia induced by genetic silencing of ‘funny’ (f) channels is rescued by GIRK4 inactivation. Nature Communication. 5, 4664 (2014).
- Liang, X., et al. HCN4 dynamically marks the first heart field and conduction system precursors. Circulation Research. 113 (4), 399-407 (2013).
- Verheule, S., Kaese, S. Connexin diversity in the heart: insights from transgenic mouse models. Frontiers in Pharmacology. 4, 81 (2013).
- van der Velden, H. Cardiac gap junctions and connexins: their role in atrial fibrillation and potential as therapeutic targets. Cardiovascular Research. 54 (2), 270-279 (2002).
