CRISPR/Cas9 게놈 편집 헬리코파 아르미게라 의 배아 미세 주입 및 녹아웃 돌연변이 식별 (휘브너)
Summary
여기에 제시 헬 리코파 armigera 의 프로토콜입니다 (Hübner) 태아 미세 주입 및 CRISPR / Cas9 게놈 편집에 의해 생성 된 녹아웃 돌연변이 식별. 돌연변이 곤충은 생체 내의 다른 유전자 들 사이에서 유전자 기능 및 상호 작용의 추가 연구를 가능하게 합니다.
Abstract
면 볼웜헬 리코파 아미게라는 세계에서 가장 파괴적인 해충 중 하나입니다. 분자 유전학의 조합, 생리학, 기능적 유전체학, 행동 연구는 H. armigera 레피드 옵테라 녹투이대에서 모델 종했다. 다른 유전자 간의 생체 내 기능 및 상호 작용을 연구하기 위해 정기적으로 간격이 짧은 palindromic 반복 (CRISPR)/ 관련 단백질 9 (Cas9) 게놈 편집 기술은 기능적 게놈 연구를 수행하는 데 사용되는 편리하고 효과적인 방법입니다. 이 연구에서는 CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여 H. armigera 에서 유전자 녹아웃을 완료하는 단계별 체계적인 방법을 제공합니다. 가이드 RNA(gRNA)의 설계 및 합성은 자세히 설명되어 있다. 이어서, 가이드 RNA(gRNA) 생성, 배아 수집, 미세주입, 곤충 사육 및 돌연변이 검출을 위한 유전자 특이적 프라이머 설계로 구성된 후속 단계를 요약한다. 마지막으로, 유전자 편집의 효율성을 개선하기 위해 문제 해결 조언과 메모가 제공됩니다. 우리의 방법은 H. 아미게라 뿐만 아니라 다른 Lepidopteran 나방에 CRISPR / Cas9 게놈 편집의 적용을위한 참조 역할을 할 것입니다.
Introduction
게놈 편집 기술의 응용 프로그램은 다양한 종에서 표적 유전자 돌연변이를 달성하기 위한 효율적인 도구를 제공합니다. 클러스터된 단락형 짧은 palindromic 반복(CRISPR)/관련 단백질 9(Cas9) 시스템의 출현은 게놈1을 조작하는 새로운 방법을 제공한다. CRISPR/Cas9 시스템은 가이드 RNA(gRNA)와 Cas9 endonuclease2,3로 구성되며, gRNA는 두 부분으로 더 나눌 수 있으며, 표적 보완 CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스 활성화 crRNA(tracrRNA)로 나뉩니다. gRNA는 Cas9 엔도누클레스와 통합하고 리보뉴클레오단백질(RNP)을 형성한다. gRNA를 사용하면 Cas9 엔도누벨리스는 기본 보완을 통해 게놈의 특정 부위로 향할 수 있습니다. Cas9의 RuvC 및 HNH 도메인은 프로토스페서 인접 모티프(PAM) 서열 전에 게놈 3기의 표적 부위를 크리브하고 이중 가닥 브레이크(DSB)를 생성한다. DNA 분열은 다음 두 가지 메커니즘을 통해 복구 할 수 있습니다, 비 동종 종조 (NHEJ) 또는 homology 지향 수리 (HDR)4. DSB의 복구는 표적 유전자를 비활성화하는 방법으로 삽입 또는 삭제를 소개합니다, 잠재적으로 유전자 기능의 완전한 손실을 일으키는 원인이 됩니다. 따라서 CRISPR/Cas9 시스템의 퇴적및 특이성은 생체 내에서 유전자 기능을 특성화하고 유전자 상호 작용을 분석하는 견고한 방법입니다5.
CRISPR/Cas9 시스템은 생물의학6,7, 유전자 치료8,9, 농업 10,11,12 등 다양한 분야에 적용되었으며 미생물13, 식물14,15, 선충제16 및 포유류17을 포함한 다양한 생물학적 시스템에 사용되어 왔습니다. . 무척추 동물에서는 많은 곤충 종은 과일 플라이 드로소필라 멜라노가스터와 그 너머 18,19,20,21,22와 같은 CRISPR/Cas9 게놈 편집을 실시했습니다.
헬리코파 아미게라는 전 세계적으로 가장 파괴적인 해충 중 하나이며, 면, 대두, 사탕수수를 포함한 수많은 작물을 손상시다. 시퀀싱 기술의 발달로, H. armigera의 게놈은 물론 Lepidoptera 곤충 종의 범위의 그, 완전히 시퀀싱되었습니다 26,27,28,29. 많은 수의 저항 및 후각 수용체 유전자가 최근 몇 년 동안 이들 곤충으로부터 확인되고 특징지어졌다19,27,28,29. 일부 저항 관련 유전자는 H. armigera에서 확인되었습니다, cadherin30에 대한 인코딩 유전자와 같은, ATP 결합 카세트 수송31,32, 뿐만 아니라 HaTSPAN133. CRISPR/Cas9 기술을 사용하여 이 유전자의 녹아웃은 취약한 긴장에서 바실러스 thuringiensis (BT) 독소에 저항의 높은 수준을 초래합니다. 또한, Chang et al. (2017)는 페로몬 수용체를 쓰러뜨려 짝짓기 시간 규정19에서 중요한 기능을 검증했습니다. 이 보고는 CRISPR/Cas9가 곤충 시스템에서 생체 내 유전자 기능을 공부하는 효과적인 공구로 작동할 수 있다는 것을 건의합니다. 그러나 곤충 시스템의 CRISPR/Cas9 수정에 대한 자세한 절차는 불완전하게 남아 있어 곤충 기능적 유전체학의 적용 범위를 제한합니다.
여기서, 우리는 CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여 H. armigera 에 있는 기능성 유전자를 노크하기 위한 프로토콜을 제시합니다. gRNA 생산을 위한 유전자 특이적 프라이머의 설계 및 준비, 배아 수집, 미세 주입, 곤충 사육 및 돌연변이 식별을 포함한 상세한 단계별 프로토콜이 제공됩니다. 이 프로토콜은 H. 아미게라 에 있는 어떤 기능성 유전자든지 조작하기 위하여 귀중한 참조 역할을 하고 그밖 Lepidoptera 종으로 확장될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
CRISPR/Cas9 시스템의 적용은 다양한 유전자 간의 유전자 기능 및 상호 작용의 분석을 위한 강력한 기술 지원을 제공하고 있습니다. 우리가 여기에서 제시하는 상세한 프로토콜은 CRISPR/Cas9 게놈 편집을 통해 H. armigera 에 있는 homozygote 돌연변이의 생성을 보여줍니다. 이 믿을 수 있는 절차는 H. armigera에 있는 지시한 유전자 돌연변이 발생을 위한 간단한 쪽을 제공합니다.
<p class="jove_conte…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 중국 국립 자연 과학 재단 (31725023, GW에 31861133019, CY에 31171912)에 의해 지원되었다.
Materials
| 2kb DNA ladder | TransGen Biotech | BM101 | |
| Capillary Glass | World Precision Instrucments | 504949 | referred to as "capillary glass" in the protocol |
| Double Sided Tape | Minnesota Mining and Manufacturing Corporation | 665 | |
| Eppendorf FemtoJet 4i Microinjector | Eppendorf Corporate | E5252000021 | |
| Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator | Eppendorf Corporate | 5192000051 | |
| Eppendorf Microloader Pipette Tips | Eppendorf Corporate | G2835241 | |
| GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | A29377 | |
| Microscope Slide | Sail Brand | 7105 | |
| Olympus Microscope | Olympus Corporation | SZX16 | |
| PrimeSTAR HS (Premix) | Takara Biomedical Technology | R040 | used for mutant detection |
| Sutter Micropipette Puller | Sutter Instrument Company | P-1000 | |
| TIANamp Genomic DNA Kit | TIANGEN Corporate | DP304-03 | |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo Fisher Scientific | A36499 |
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