Microiniezione embrionale e identificazione di mutanti knockout di Helicoverpa Armigera (Hübner) modificata dal genoma CRISPR/Cas9
Summary
Qui è presentato un protocollo di microiniezione embrionale Helicoverpa armigera (Hübner) e identificazione di mutanti knockout creati dall’editing del genoma CRISPR / Cas9. Gli insetti mutanti consentono ulteriori ricerche sulla funzione genica e sull’interazione tra diversi geni in vivo.
Abstract
Il verme del cotone, Helicoverpa armigera, è uno dei parassiti più distruttivi al mondo. Una combinazione di genetica molecolare, fisiologia, genomica funzionale e studi comportamentali ha reso H. armigera una specie modello in Lepidoptera Noctuidae. Per studiare le funzioni in vivo e le interazioni tra geni diversi, la tecnologia di editing del genoma a brevi ripetizioni palindrome raggruppate regolarmente intervallate (CRISPR) / proteina 9 associata (Cas9) è un metodo conveniente ed efficace utilizzato per eseguire studi genomici funzionali. In questo studio, forniamo un metodo sistematico passo-passo per completare il knockout genico in H. armigera utilizzando il sistema CRISPR / Cas9. La progettazione e la sintesi dell’RNA guida (gRNA) sono descritte in dettaglio. Quindi, vengono riepilogate le fasi successive costituite dalla progettazione di primer gene-specifici per la creazione di RNA guida (gRNA), la raccolta di embrioni, la microiniezione, l’allevamento di insetti e il rilevamento di mutanti. Infine, vengono forniti consigli e note per la risoluzione dei problemi per migliorare l’efficienza dell’editing genetico. Il nostro metodo servirà come riferimento per l’applicazione dell’editing del genoma CRISPR / Cas9 in H. armigera e in altre falene lepidottere.
Introduction
L’applicazione della tecnologia di editing del genoma fornisce uno strumento efficiente per ottenere mutanti del gene bersaglio in diverse specie. L’emergere del sistema clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/associated protein 9 (Cas9) fornisce un nuovo metodo per manipolare i genomi1. Il sistema CRISPR/Cas9 è costituito da un RNA guida (gRNA) e dall’endonucleasi Cas92,3, mentre il gRNA può essere ulteriormente diviso in due parti, un RNA CRISPR complementare bersaglio (crRNA) e un crRNA trans-attivante (tracrRNA). Il gRNA si integra con l’endonucleasi Cas9 e forma una ribonucleoproteina (RNP). Con il gRNA, l’endonucleasi Cas9 può essere diretta a un sito specifico del genoma tramite la complementazione di base. I domini RuvC e HNH del Cas9 fendono il sito bersaglio del genoma tre basi prima della sequenza del motivo adiacente al protospacer (PAM) e creano una rottura a doppio filamento (DSB). La scissione del DNA può quindi essere riparata attraverso due meccanismi, l’unione finale non omologa (NHEJ) o la riparazione diretta dall’omologia (HDR)4. La riparazione del DSB introduce inserzioni o delezioni come un modo per inattivare il gene bersaglio, causando potenzialmente una completa perdita della funzione genica. Quindi, l’ereditarietà e la specificità del sistema CRISPR/Cas9 lo rendono un metodo robusto per caratterizzare le funzioni geniche in vivo e analizzare le interazioni geniche5.
Con numerosi meriti, il sistema CRISPR /Cas9 è stato applicato a vari campi, tra cui la biomedicina6,7, la terapia genica8,9 e l’agricoltura10,11,12, ed è stato utilizzato per vari sistemi biologici tra cui microrganismi13, piante14,15, nematodi16 e mammiferi17 . Negli invertebrati, molte specie di insetti sono state sottoposte a modifica del genoma CRISPR / Cas9, come il moscerino della frutta Drosophila melanogaster e oltre18,19,20,21,22.
Helicoverpa armigera è uno dei parassiti più distruttivi al mondo23 e danneggia numerose colture, tra cui cotone, soia e sorgo24,25. Con lo sviluppo della tecnologia di sequenziamento, il genoma di H. armigera, così come quello di una serie di specie di insetti Lepidotteri, sono stati sequenziati completamente26,27,28,29. Un gran numero di geni di resistenza e recettori olfattivi sono stati identificati e caratterizzati da questi insetti negli ultimi anni19,27,28,29. Alcuni geni correlati alla resistenza sono stati identificati in H. armigera, come i geni che codificano per la caderina30, un trasportatore di cassette che lega l’ATP31,32, così come HaTSPAN133. Il knockout di questi geni utilizzando la tecnologia CRISPR/Cas9 si traduce in un alto livello di resistenza alla tossina Bacillus thuringiensis (BT) nei ceppi sensibili. Inoltre, Chang et al. (2017) hanno eliminato un recettore dei feromoni, che ha convalidato la sua funzione significativa nella regolazione del tempo di accoppiamento19. Questi rapporti suggeriscono che CRISPR / Cas9 può agire come uno strumento efficace per studiare la funzione genica in vivo nei sistemi di insetti. Tuttavia, una procedura dettagliata per la modifica CRISPR/Cas9 nei sistemi di insetti rimane incompleta, il che limita il suo campo di applicazione nella genomica funzionale degli insetti.
Qui, presentiamo un protocollo per eliminare un gene funzionale in H. armigera usando il sistema CRISPR / Cas9. Viene fornito un protocollo dettagliato passo-passo, compresa la progettazione e la preparazione di primer gene-specifici per la produzione di gRNA, la raccolta di embrioni, la microiniezione, l’allevamento di insetti e l’identificazione mutante. Questo protocollo serve come un prezioso riferimento per manipolare qualsiasi gene funzionale in H. armigera e può essere esteso ad altre specie di lepidotteri.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’applicazione del sistema CRISPR/Cas9 ha fornito un potente supporto tecnico per l’analisi della funzione genica e dell’interazione tra vari geni. Il protocollo dettagliato che presentiamo qui dimostra la generazione di un mutante omozigote in H. armigera tramite l’editing del genoma CRISPR / Cas9. Questa procedura affidabile fornisce un modo semplice per la mutagenesi genica diretta in H. armigera.
La scelta dei siti bersaglio crispr potrebbe influire sull’efficienza della …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (31725023, 31861133019 a GW e 31171912 a CY).
Materials
| 2kb DNA ladder | TransGen Biotech | BM101 | |
| Capillary Glass | World Precision Instrucments | 504949 | referred to as "capillary glass" in the protocol |
| Double Sided Tape | Minnesota Mining and Manufacturing Corporation | 665 | |
| Eppendorf FemtoJet 4i Microinjector | Eppendorf Corporate | E5252000021 | |
| Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator | Eppendorf Corporate | 5192000051 | |
| Eppendorf Microloader Pipette Tips | Eppendorf Corporate | G2835241 | |
| GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | A29377 | |
| Microscope Slide | Sail Brand | 7105 | |
| Olympus Microscope | Olympus Corporation | SZX16 | |
| PrimeSTAR HS (Premix) | Takara Biomedical Technology | R040 | used for mutant detection |
| Sutter Micropipette Puller | Sutter Instrument Company | P-1000 | |
| TIANamp Genomic DNA Kit | TIANGEN Corporate | DP304-03 | |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo Fisher Scientific | A36499 |
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