Embryo Microinjectie en Knockout Mutant Identificatie van CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera (Hübner)
Summary
Hier wordt een protocol gepresenteerd van Helicoverpa armigera (Hübner) embryo micro-injectie en knock-out mutant identificatie gemaakt door CRISPR / Cas9 genoombewerking. Gemuteerde insecten maken verder onderzoek naar genfunctie en interactie tussen verschillende genen in vivo mogelijk.
Abstract
De katoenbolworm, Helicoverpa armigera, is een van de meest destructieve plagen ter wereld. Een combinatie van moleculaire genetica, fysiologie, functionele genomica en gedragsstudies heeft van H. armigera een modelsoort gemaakt in Lepidoptera Noctuidae. Om de in vivo functies van en interacties tussen verschillende genen te bestuderen, is geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische herhalingen (CRISPR) / geassocieerd eiwit 9 (Cas9) genoombewerkingstechnologie een handige en effectieve methode die wordt gebruikt voor het uitvoeren van functionele genomische studies. In deze studie bieden we een stapsgewijze systematische methode om gen knock-out in H. armigera te voltooien met behulp van het CRISPR / Cas9-systeem. Het ontwerp en de synthese van gids-RNA (gRNA) worden in detail beschreven. Vervolgens worden de volgende stappen, bestaande uit genspecifiek primerontwerp voor het maken van gids-RNA (gRNA), embryoverzameling, micro-injectie, insectenopfok en mutantendetectie samengevat. Ten slotte worden advies en opmerkingen over het oplossen van problemen verstrekt om de efficiëntie van genbewerking te verbeteren. Onze methode zal dienen als referentie voor de toepassing van CRISPR/Cas9 genoombewerking in H. armigera en andere Lepidoptera motten.
Introduction
De toepassing van genoombewerkingstechnologie biedt een efficiënt hulpmiddel om doelgenmutanten in diverse soorten te bereiken. De opkomst van het clustered regular interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/associated protein 9 (Cas9) systeem biedt een nieuwe methode om genomen te manipuleren1. Het CRISPR/Cas9-systeem bestaat uit een geleidings-RNA (gRNA) en het Cas9-endonuclease2,3, terwijl het gRNA verder kan worden onderverdeeld in twee delen, een doel complementair CRISPR-RNA (crRNA) en een trans-activerend crRNA (tracrRNA). Het gRNA integreert met Cas9 endonuclease en vormt een ribonucleoproteïne (RNP). Met het gRNA kan Cas9-endonuclease via basecomplementatie naar een specifieke plaats van het genoom worden geleid. De RuvC- en HNH-domeinen van de Cas9 splitsen de doellocatie van het genoom drie basen voor de protospacer-adjacent motif (PAM) -sequentie en creëren een dubbelstrengsbreuk (DSB). De DNA-splitsing kan vervolgens worden gerepareerd via twee mechanismen, niet-homologe eindverbinding (NHEJ) of homologiegerichte reparatie (HDR)4. Reparatie van de DSB introduceert inserties of deleties als een manier om het beoogde gen te inactiveren, wat mogelijk een volledig verlies van genfunctie veroorzaakt. Vandaar dat de herbewerkbaarheid en specificiteit van het CRISPR/Cas9-systeem het een robuuste methode maken om genfuncties in vivo te karakteriseren en geninteracties te analyseren5.
Met tal van verdiensten is het CRISPR/Cas9-systeem toegepast op verschillende gebieden, waaronder biogeneeskunde6,7, gentherapie8,9 en landbouw10,11,12, en is het gebruikt voor verschillende biologische systemen, waaronder micro-organismen13, planten14,15, nematoden16 en zoogdieren17 . Bij ongewervelde dieren zijn veel insectensoorten onderworpen aan CRISPR/Cas9-genoombewerking, zoals de fruitvlieg Drosophila melanogaster en verder dan 18,19,20,21,22.
Helicoverpa armigera is een van de meest destructieve plagen ter wereld23 en beschadigt tal van gewassen, waaronder katoen, sojabonen en sorghum24,25. Met de ontwikkeling van sequencingtechnologie zijn het genoom van H. armigera, evenals dat van een reeks Lepidoptera-insectensoorten, volledig gesequenced26,27,28,29. Een groot aantal resistentie- en reukreceptorgenen is de afgelopen jaren geïdentificeerd en gekarakteriseerd van deze insecten19,27,28,29. Sommige resistentiegerelateerde genen zijn geïdentificeerd in H. armigera, zoals de genen die coderen voor cadherin30, een ATP-bindende cassettetransporter31,32, evenals HaTSPAN133. Knock-out van deze genen met behulp van CRISPR/Cas9-technologie resulteert in een hoge mate van resistentie tegen Bacillus thuringiensis (BT) toxine in gevoelige stammen. Ook sloegen Chang et al. (2017) een feromoonreceptor uit, die zijn significante functie in paringstijdregulatie valideerde19. Deze rapporten suggereren dat CRISPR/Cas9 kan fungeren als een effectief hulpmiddel om de genfunctie in vivo in insectensystemen te bestuderen. Een gedetailleerde procedure voor CRISPR/Cas9-modificatie in insectensystemen blijft echter onvolledig, wat het toepassingsgebied ervan in functionele genomica voor insecten beperkt.
Hier presenteren we een protocol voor het uitschakelen van een functioneel gen in H. armigera met behulp van het CRISPR / Cas9-systeem. Een gedetailleerd stapsgewijs protocol wordt verstrekt, inclusief het ontwerp en de voorbereiding van genspecifieke primers voor gRNA-productie, embryoverzameling, micro-injectie, insectenopfok en mutantidentificatie. Dit protocol dient als een waardevolle referentie om functionele genen in H. armigera te manipuleren en kan worden uitgebreid naar andere Lepidoptera-soorten.
Protocol
Representative Results
Discussion
De toepassing van het CRISPR/Cas9-systeem heeft krachtige technische ondersteuning geboden voor de analyse van de genfunctie en interactie tussen verschillende genen. Het gedetailleerde protocol dat we hier presenteren, toont de generatie van een homozygote mutant in H. armigera via CRISPR / Cas9-genoombewerking. Deze betrouwbare procedure biedt een eenvoudige manier voor gerichte genmutagenese bij H. armigera.
De keuze van crispr-doellocaties kan van invloed zijn op de <sup …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (31725023, 31861133019 voor GW en 31171912 voor CY).
Materials
| 2kb DNA ladder | TransGen Biotech | BM101 | |
| Capillary Glass | World Precision Instrucments | 504949 | referred to as "capillary glass" in the protocol |
| Double Sided Tape | Minnesota Mining and Manufacturing Corporation | 665 | |
| Eppendorf FemtoJet 4i Microinjector | Eppendorf Corporate | E5252000021 | |
| Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator | Eppendorf Corporate | 5192000051 | |
| Eppendorf Microloader Pipette Tips | Eppendorf Corporate | G2835241 | |
| GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | A29377 | |
| Microscope Slide | Sail Brand | 7105 | |
| Olympus Microscope | Olympus Corporation | SZX16 | |
| PrimeSTAR HS (Premix) | Takara Biomedical Technology | R040 | used for mutant detection |
| Sutter Micropipette Puller | Sutter Instrument Company | P-1000 | |
| TIANamp Genomic DNA Kit | TIANGEN Corporate | DP304-03 | |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo Fisher Scientific | A36499 |
Referências
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Ding, Q., et al. Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs. Cell Stem Cell. 12 (4), 393-394 (2013).
- Collins, P. J., Hale, C. M., Xu, H. Edited course of biomedical research: leaping forward with CRISPR. Pharmacological Research. 125, 258-265 (2017).
- Huang, J., Wang, Y., Zhao, J. CRISPR editing in biological and biomedical investigation. Journal of Cellular Physiology. 233 (5), 3875-3891 (2018).
- Guan, L., Han, Y., Zhu, S., Lin, J. Application of CRISPR-Cas system in gene therapy: pre-clinical progress in animal model. DNA Repair. 46, 1-8 (2016).
- Wu, J., et al. Gene therapy for glaucoma by ciliary body aquaporin 1 disruption using CRISPR-Cas9. Molecular Therapy. 28 (3), 820-829 (2020).
- Jiao, R., Gao, C. The CRISPR/Cas9 genome editing revolution. Journal of Genetics and Genomics. 43, 227-228 (2016).
- Gupta, M., Gerard, M., Padmaja, S. S., Sastry, R. K. Trends of CRISPR technology development and deployment into Agricultural Production-Consumption Systems. World Patent Information. 60, 101944 (2020).
- Es, I., et al. The application of the CRISPR-Cas9 genome editing machinery in food and agricultural science: Current status, future perspectives, and associated challenges. Biotechnology Advances. 37 (3), 410-421 (2019).
- Tarasava, K., Oh, E. J., Eckert, C. A., Gill, R. T. CRISPR-enabled tools for engineering microbial genomes and phenotypes. Biotechnology Journal. 13 (9), 1700586 (2018).
- Ma, X., Zhu, Q., Chen, Y., Liu, Y. -. G. CRISPR/Cas9 platforms for genome editing in plants: developments and applications. Molecular Plant. 9 (7), 961-974 (2016).
- Pandey, P. K., et al. Versatile and multifaceted CRISPR/Cas gene editing tool for plant research. Seminars in Cell & Developmental Biology. 96, 107-114 (2019).
- Friedland, A. E., et al. Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system. Nature Methods. 10 (8), 741-743 (2013).
- Mojica, F. J., Montoliu, L. On the origin of CRISPR-Cas technology: from prokaryotes to mammals. Trends in Microbiology. 24 (10), 811-820 (2016).
- Taning, C. N. T., Van Eynde, B., Yu, N., Ma, S., Smagghe, G. CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns. Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).
- Chang, H., et al. A pheromone antagonist regulates optimal mating time in the moth Helicoverpa armigera. Current Biology. 27 (11), 1610-1615 (2017).
- Yan, H., et al. An engineered orco mutation produces aberrant social behavior and defective neural development in ants. Cell. 170 (4), 736-747 (2017).
- Koutroumpa, F., et al. Heritable genome editing with CRISPR/Cas9 induces anosmia in a crop pest moth. Scientific Reports. 6 (1), 29620 (2016).
- Chen, D., et al. CRISPR/Cas9-mediated genome editing induces exon skipping by complete or stochastic altering splicing in the migratory locust. BMC Biotechnology. 18 (1), 1-9 (2018).
- Fitt, G. P. The ecology of Heliothis species in relation to agroecosystems. Annual Review of Entomology. 34 (1), 17-53 (1989).
- Jallow, M. F., Cunningham, J. P., Zalucki, M. P. Intra-specific variation for host plant use in Helicoverpa armigera (Hübner)(Lepidoptera: Noctuidae): implications for management. Crop Protection. 23 (10), 955-964 (2004).
- Ai, D., et al. Gene cloning, prokaryotic expression, and biochemical characterization of a soluble trehalase in Helicoverpa armigera Hübner (Lepidoptera: Noctuidae). Journal of Insect Science. 18 (3), 22 (2018).
- Wan, F., et al. A chromosome-level genome assembly of Cydia pomonella provides insights into chemical ecology and insecticide resistance. Nature Communications. 10 (1), 1-14 (2019).
- Cheng, T., et al. Genomic adaptation to polyphagy and insecticides in a major East Asian noctuid pest. Nature Ecology & Evolution. 1 (11), 1747-1756 (2017).
- Xu, W., Papanicolaou, A., Zhang, H. J., Anderson, A. Expansion of a bitter taste receptor family in a polyphagous insect herbivore. Science Reports. 6, 23666 (2016).
- Gouin, A., et al. Two genomes of highly polyphagous lepidopteran pests (Spodoptera frugiperda, Noctuidae) with different host-plant ranges. Scientific Reports. 7 (1), 1-12 (2017).
- Wang, J., et al. Functional validation of cadherin as a receptor of Bt toxin Cry1Ac in Helicoverpa armigera utilizing the CRISPR/Cas9 system. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 76, 11-17 (2016).
- Wang, J., Wang, H., Liu, S., Liu, L., Wu, Y. CRISPR/Cas9 mediated genome editing of Helicoverpa armigera with mutations of an ABC transporter gene HaABCA2 confers resistance to Bacillus thuringiensis Cry2A toxins. Insect Biochemistry and Molecular biology. 87, 147 (2017).
- Wang, J., Ma, H., Zhao, S., Huang, J., Wu, Y. Functional redundancy of two ABC transporter proteins in mediating toxicity of Bacillus thuringiensis to cotton bollworm. PLoS Pathogens. 16 (3), 1008427 (2020).
- Jin, L., et al. Dominant point mutation in a tetraspanin gene associated with field-evolved resistance of cotton bollworm to transgenic Bt cotton. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (46), 11760-11765 (2018).
- Hongtao, Z., Jianan, L., Lian, T., Yang, Z. Sexing of Helicoverpa assulta and Helicoverpa armigera pupae based on machine vision. Tobacco Sciene & Technology. 53 (2), 21-26 (2019).
- Wu, K., Gong, P. A new and practical artificial diet for the cotton boll-worm. Insect science. 4 (3), 277-282 (1997).
- Jha, R. K., Chi, H., Li-Cheng, T. A Comparison of Artificial Diet and Hybrid Sweet Corn for the Rearing of Helicoverpa armigera (Hübner) (Lepidoptera: Noctuidae) Based on Life Table Characteristics. Environmental Entomology. (1), 30 (2012).
- Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. -. L. Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system. Cell Reports. 4 (1), 220-228 (2013).
- Zheng, M. -. Y., et al. A non-destructive method of genotyping individual insects from the exuviate of final instar larvae, or puparia. Chinese Journal of Applied Entomology. (2), 21 (2018).
- Pashley, D. P., Hammond, A. M., Hardy, T. N. Reproductive isolating mechanisms in fall armyworm host strains (Lepidoptera: Noctuidae). Annals of The Entomological Society of America. 85 (4), 400-405 (1992).
- Kamimura, M., Tatsuki, S. Diel rhythms of calling behavior and pheromone production of oriental tobacco budworm moth, Helicoverpa assulta(Lepidoptera: Noctuidae). Journal of Chemical Ecology. 19 (12), 2953-2963 (1993).
- Edwards, K. D. Activity rhythms of lepidopterous defoliators: ii. Halisidota argentata pack. (arctiidae), and nepytia phantasmaria stkr. (GEOMETRIDAE). Canadian Journal of Zoology. 42 (6), 939-958 (1964).
