Embryomikroinjektion og knockout-mutant identifikation af CRISPR/Cas9-genomredigeret Helicoverpa Armigera (Hübner)
Summary
Præsenteret her er en protokol over Helicoverpa armigera (Hübner) embryomikroinjektion og knockout mutant identifikation skabt af CRISPR / Cas9 genomredigering. Mutante insekter muliggør yderligere forskning i genfunktion og interaktion mellem forskellige gener in vivo.
Abstract
Bomuldsbollormen, Helicoverpa armigera, er et af de mest destruktive skadedyr i verden. En kombination af molekylær genetik, fysiologi, funktionel genomik og adfærdsstudier har gjort H. armigera til en modelart i Lepidoptera Noctuidae. For at studere in vivo-funktionerne af og interaktionerne mellem forskellige gener er clustered regular interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/associated protein 9 (Cas9) genomredigeringsteknologi en praktisk og effektiv metode, der anvendes til at udføre funktionelle genomiske undersøgelser. I denne undersøgelse giver vi en trinvis systematisk metode til at fuldføre genknockout i H. armigera ved hjælp af CRISPR/Cas9-systemet. Design og syntese af guide RNA (gRNA) er beskrevet detaljeret. Derefter opsummeres de efterfølgende trin, der består af genspecifikt primerdesign til oprettelse af guide-RNA (gRNA), embryoopsamling, mikroinjektion, insektopdræt og mutantdetektion. Endelig gives fejlfindingsråd og noter for at forbedre effektiviteten af genredigering. Vores metode vil tjene som reference for anvendelsen af CRISPR/Cas9 genomredigering i H. armigera samt andre Lepidopteran møl.
Introduction
Anvendelsen af genomredigeringsteknologi giver et effektivt værktøj til at opnå målgenmutanter i forskellige arter. Fremkomsten af det klyngede system med regelmæssigt indbyrdes mellemrum med korte palindromiske gentagelser (CRISPR)/associeret protein 9 (Cas9) giver en ny metode til at manipulere genomer1. CRISPR/Cas9-systemet består af et guide-RNA (gRNA) og Cas9-endonuklease2,3, mens gRNA’et yderligere kan opdeles i to dele, et målkomplementært CRISPR-RNA (crRNA) og et transaktiverende crRNA (tracrRNA). GRNA’et integreres med Cas9-endonuklease og danner et ribonukleoprotein (RNP). Med gRNA’et kan Cas9-endonuklease ledes til et bestemt sted i genomet via basekomplementering. RuvC- og HNH-domænerne i Cas9 spalter målet for genomet tre baser før den protospacer-tilstødende motivsekvens (PAM) og skaber en dobbeltstrengsbrud (DSB). DNA-spaltningen kan derefter repareres gennem to mekanismer, ikke-homolog endesammenføjning (NHEJ) eller homologistyret reparation (HDR)4. Reparation af DSB introducerer indsættelser eller deletioner som en måde at inaktivere det målrettede gen på, hvilket potentielt kan forårsage et fuldstændigt tab af genfunktion. Derfor gør CRISPR/Cas9-systemets arvelighed og specificitet det til en robust metode til at karakterisere genfunktioner in vivo og analysere geninteraktioner5.
Med mange fordele er CRISPR/Cas9-systemet blevet anvendt på forskellige områder, herunder biomedicin6,7, genterapi8,9 og landbrug10,11,12, og er blevet anvendt til forskellige biologiske systemer, herunder mikroorganismer13, planter14,15, nematoder16 og pattedyr17 . Hos hvirvelløse dyr har mange insektarter været udsat for CRISPR/Cas9-genomredigering, såsom bananfluen Drosophila melanogaster og derover18,19,20,21,22.
Helicoverpa armigera er et af de mest ødelæggende skadedyr på verdensplan23 og beskadiger adskillige afgrøder, herunder bomuld, sojabønner og sorghum24,25. Med udviklingen af sekventeringsteknologi er genomet af H. armigera såvel som for en række Lepidoptera insektarter blevet sekventeret fuldstændigt26,27,28,29. Et stort antal resistens- og olfaktoriske receptorgener er blevet identificeret og karakteriseret fra disse insekter i de senere år19,27,28,29. Nogle resistensrelaterede gener er blevet identificeret i H. armigera, såsom de gener, der koder for cadherin30, en ATP-bindende kassettetransportør31,32 samt HaTSPAN133. Knockout af disse gener ved hjælp af CRISPR/Cas9-teknologi resulterer i en høj grad af resistens over for Bacillus thuringiensis (BT) toksin i modtagelige stammer. Chang et al. (2017) slog også en feromonreceptor ud, som validerede dens signifikante funktion i parringstidsregulering19. Disse rapporter tyder på, at CRISPR/Cas9 kan fungere som et effektivt redskab til at studere genfunktionen in vivo i insektsystemer. En detaljeret procedure for CRISPR/Cas9-modifikation i insektsystemer er dog fortsat ufuldstændig, hvilket begrænser dens anvendelsesområde inden for insektfunktionel genomik.
Her præsenterer vi en protokol til at slå et funktionelt gen ud i H. armigera ved hjælp af CRISPR/Cas9-systemet. En detaljeret trin-for-trin protokol leveres, herunder design og forberedelse af genspecifikke primere til gRNA-produktion, embryoopsamling, mikroinjektion, insektopdræt og mutantidentifikation. Denne protokol tjener som en værdifuld reference til at manipulere eventuelle funktionelle gener i H. armigera og kan udvides til andre Lepidoptera-arter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Anvendelsen af CRISPR/Cas9-systemet har givet kraftig teknisk støtte til analyse af genfunktion og interaktion mellem forskellige gener. Den detaljerede protokol, vi præsenterer her, viser dannelsen af en homozygot mutant i H. armigera via CRISPR /Cas9 genomredigering. Denne pålidelige procedure giver en ligetil måde for rettet genmutagenese i H. armigera.
Valget af CRISPR-målsteder kan påvirke mutageneseeffektiviteten37. I denne protokol sammenl…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (31725023, 31861133019 til GW og 31171912 til CY).
Materials
| 2kb DNA ladder | TransGen Biotech | BM101 | |
| Capillary Glass | World Precision Instrucments | 504949 | referred to as "capillary glass" in the protocol |
| Double Sided Tape | Minnesota Mining and Manufacturing Corporation | 665 | |
| Eppendorf FemtoJet 4i Microinjector | Eppendorf Corporate | E5252000021 | |
| Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator | Eppendorf Corporate | 5192000051 | |
| Eppendorf Microloader Pipette Tips | Eppendorf Corporate | G2835241 | |
| GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | A29377 | |
| Microscope Slide | Sail Brand | 7105 | |
| Olympus Microscope | Olympus Corporation | SZX16 | |
| PrimeSTAR HS (Premix) | Takara Biomedical Technology | R040 | used for mutant detection |
| Sutter Micropipette Puller | Sutter Instrument Company | P-1000 | |
| TIANamp Genomic DNA Kit | TIANGEN Corporate | DP304-03 | |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo Fisher Scientific | A36499 |
Referências
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Ding, Q., et al. Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs. Cell Stem Cell. 12 (4), 393-394 (2013).
- Collins, P. J., Hale, C. M., Xu, H. Edited course of biomedical research: leaping forward with CRISPR. Pharmacological Research. 125, 258-265 (2017).
- Huang, J., Wang, Y., Zhao, J. CRISPR editing in biological and biomedical investigation. Journal of Cellular Physiology. 233 (5), 3875-3891 (2018).
- Guan, L., Han, Y., Zhu, S., Lin, J. Application of CRISPR-Cas system in gene therapy: pre-clinical progress in animal model. DNA Repair. 46, 1-8 (2016).
- Wu, J., et al. Gene therapy for glaucoma by ciliary body aquaporin 1 disruption using CRISPR-Cas9. Molecular Therapy. 28 (3), 820-829 (2020).
- Jiao, R., Gao, C. The CRISPR/Cas9 genome editing revolution. Journal of Genetics and Genomics. 43, 227-228 (2016).
- Gupta, M., Gerard, M., Padmaja, S. S., Sastry, R. K. Trends of CRISPR technology development and deployment into Agricultural Production-Consumption Systems. World Patent Information. 60, 101944 (2020).
- Es, I., et al. The application of the CRISPR-Cas9 genome editing machinery in food and agricultural science: Current status, future perspectives, and associated challenges. Biotechnology Advances. 37 (3), 410-421 (2019).
- Tarasava, K., Oh, E. J., Eckert, C. A., Gill, R. T. CRISPR-enabled tools for engineering microbial genomes and phenotypes. Biotechnology Journal. 13 (9), 1700586 (2018).
- Ma, X., Zhu, Q., Chen, Y., Liu, Y. -. G. CRISPR/Cas9 platforms for genome editing in plants: developments and applications. Molecular Plant. 9 (7), 961-974 (2016).
- Pandey, P. K., et al. Versatile and multifaceted CRISPR/Cas gene editing tool for plant research. Seminars in Cell & Developmental Biology. 96, 107-114 (2019).
- Friedland, A. E., et al. Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system. Nature Methods. 10 (8), 741-743 (2013).
- Mojica, F. J., Montoliu, L. On the origin of CRISPR-Cas technology: from prokaryotes to mammals. Trends in Microbiology. 24 (10), 811-820 (2016).
- Taning, C. N. T., Van Eynde, B., Yu, N., Ma, S., Smagghe, G. CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns. Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).
- Chang, H., et al. A pheromone antagonist regulates optimal mating time in the moth Helicoverpa armigera. Current Biology. 27 (11), 1610-1615 (2017).
- Yan, H., et al. An engineered orco mutation produces aberrant social behavior and defective neural development in ants. Cell. 170 (4), 736-747 (2017).
- Koutroumpa, F., et al. Heritable genome editing with CRISPR/Cas9 induces anosmia in a crop pest moth. Scientific Reports. 6 (1), 29620 (2016).
- Chen, D., et al. CRISPR/Cas9-mediated genome editing induces exon skipping by complete or stochastic altering splicing in the migratory locust. BMC Biotechnology. 18 (1), 1-9 (2018).
- Fitt, G. P. The ecology of Heliothis species in relation to agroecosystems. Annual Review of Entomology. 34 (1), 17-53 (1989).
- Jallow, M. F., Cunningham, J. P., Zalucki, M. P. Intra-specific variation for host plant use in Helicoverpa armigera (Hübner)(Lepidoptera: Noctuidae): implications for management. Crop Protection. 23 (10), 955-964 (2004).
- Ai, D., et al. Gene cloning, prokaryotic expression, and biochemical characterization of a soluble trehalase in Helicoverpa armigera Hübner (Lepidoptera: Noctuidae). Journal of Insect Science. 18 (3), 22 (2018).
- Wan, F., et al. A chromosome-level genome assembly of Cydia pomonella provides insights into chemical ecology and insecticide resistance. Nature Communications. 10 (1), 1-14 (2019).
- Cheng, T., et al. Genomic adaptation to polyphagy and insecticides in a major East Asian noctuid pest. Nature Ecology & Evolution. 1 (11), 1747-1756 (2017).
- Xu, W., Papanicolaou, A., Zhang, H. J., Anderson, A. Expansion of a bitter taste receptor family in a polyphagous insect herbivore. Science Reports. 6, 23666 (2016).
- Gouin, A., et al. Two genomes of highly polyphagous lepidopteran pests (Spodoptera frugiperda, Noctuidae) with different host-plant ranges. Scientific Reports. 7 (1), 1-12 (2017).
- Wang, J., et al. Functional validation of cadherin as a receptor of Bt toxin Cry1Ac in Helicoverpa armigera utilizing the CRISPR/Cas9 system. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 76, 11-17 (2016).
- Wang, J., Wang, H., Liu, S., Liu, L., Wu, Y. CRISPR/Cas9 mediated genome editing of Helicoverpa armigera with mutations of an ABC transporter gene HaABCA2 confers resistance to Bacillus thuringiensis Cry2A toxins. Insect Biochemistry and Molecular biology. 87, 147 (2017).
- Wang, J., Ma, H., Zhao, S., Huang, J., Wu, Y. Functional redundancy of two ABC transporter proteins in mediating toxicity of Bacillus thuringiensis to cotton bollworm. PLoS Pathogens. 16 (3), 1008427 (2020).
- Jin, L., et al. Dominant point mutation in a tetraspanin gene associated with field-evolved resistance of cotton bollworm to transgenic Bt cotton. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (46), 11760-11765 (2018).
- Hongtao, Z., Jianan, L., Lian, T., Yang, Z. Sexing of Helicoverpa assulta and Helicoverpa armigera pupae based on machine vision. Tobacco Sciene & Technology. 53 (2), 21-26 (2019).
- Wu, K., Gong, P. A new and practical artificial diet for the cotton boll-worm. Insect science. 4 (3), 277-282 (1997).
- Jha, R. K., Chi, H., Li-Cheng, T. A Comparison of Artificial Diet and Hybrid Sweet Corn for the Rearing of Helicoverpa armigera (Hübner) (Lepidoptera: Noctuidae) Based on Life Table Characteristics. Environmental Entomology. (1), 30 (2012).
- Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. -. L. Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system. Cell Reports. 4 (1), 220-228 (2013).
- Zheng, M. -. Y., et al. A non-destructive method of genotyping individual insects from the exuviate of final instar larvae, or puparia. Chinese Journal of Applied Entomology. (2), 21 (2018).
- Pashley, D. P., Hammond, A. M., Hardy, T. N. Reproductive isolating mechanisms in fall armyworm host strains (Lepidoptera: Noctuidae). Annals of The Entomological Society of America. 85 (4), 400-405 (1992).
- Kamimura, M., Tatsuki, S. Diel rhythms of calling behavior and pheromone production of oriental tobacco budworm moth, Helicoverpa assulta(Lepidoptera: Noctuidae). Journal of Chemical Ecology. 19 (12), 2953-2963 (1993).
- Edwards, K. D. Activity rhythms of lepidopterous defoliators: ii. Halisidota argentata pack. (arctiidae), and nepytia phantasmaria stkr. (GEOMETRIDAE). Canadian Journal of Zoology. 42 (6), 939-958 (1964).
