Microinjection embryonnaire et identification des mutants Knockout de l’Helicoverpa Armigera éditée par le génome CRISPR/Cas9 (Hübner)
Summary
Présenté ici est un protocole de micro-injection d’embryon Helicoverpa armigera (Hübner) et d’identification de mutant knockout créé par l’édition du génome CRISPR / Cas9. Les insectes mutants permettent de poursuivre les recherches sur la fonction des gènes et l’interaction entre différents gènes in vivo.
Abstract
Le ver du coton, Helicoverpa armigera, est l’un des ravageurs les plus destructeurs au monde. Une combinaison de génétique moléculaire, de physiologie, de génomique fonctionnelle et d’études comportementales a fait de H. armigera une espèce modèle chez le Lepidoptera Noctuidae. Pour étudier les fonctions in vivo et les interactions entre différents gènes, la technologie d’édition du génome des courtes répétitions palindromiques régulièrement espacées (CRISPR) / associée à la protéine 9 (Cas9) est une méthode pratique et efficace utilisée pour effectuer des études génomiques fonctionnelles. Dans cette étude, nous fournissons une méthode systématique étape par étape pour compléter l’élimination du gène chez H. armigera en utilisant le système CRISPR / Cas9. La conception et la synthèse de l’ARN guide (ARNg) sont décrites en détail. Ensuite, les étapes suivantes consistant en la conception d’amorces spécifiques à un gène pour la création d’ARN guide (ARNg), la collecte d’embryons, la micro-injection, l’élevage d’insectes et la détection de mutants sont résumées. Enfin, des conseils de dépannage et des notes sont fournis pour améliorer l’efficacité de l’édition de gènes. Notre méthode servira de référence pour l’application de l’édition du génome CRISPR/Cas9 chez H. armigera ainsi que chez d’autres papillons lépidoptères.
Introduction
L’application de la technologie d’édition du génome fournit un outil efficace pour atteindre des mutants de gènes cibles chez diverses espèces. L’émergence du système CRISPR (Clustered Regular Interspaced short palindromic repeats)/Associated Protein 9 (Cas9) fournit une nouvelle méthode pour manipuler les génomes1. Le système CRISPR/Cas9 se compose d’un ARN guide (aRNg) et de l’endonucléase Cas92,3, tandis que l’ARNg peut être divisé en deux parties, un ARN CRISPR complémentaire cible (ARN crnc) et un ARNnc transactivant (tracrRNA). L’ARNg s’intègre à l’endonucléase Cas9 et forme une ribonucléoprotéine (RNP). Avec l’ARNg, l’endonucléase Cas9 peut être dirigée vers un site spécifique du génome via la complémentation de base. Les domaines RuvC et HNH du Cas9 coupent le site cible du génome trois bases avant la séquence protospacer-adjacent motif (PAM) et créent une rupture double brin (DSB). Le clivage de l’ADN peut ensuite être réparé par deux mécanismes, la jonction terminale non homologue (NHEJ) ou la réparation dirigée par homologie (HDR)4. La réparation du DSB introduit des insertions ou des délétions comme moyen d’inactiver le gène ciblé, ce qui peut entraîner une perte complète de la fonction du gène. Par conséquent, la héréditaire et la spécificité du système CRISPR/Cas9 en font une méthode robuste pour caractériser les fonctions des gènes in vivo et analyser les interactions géniques5.
Avec de nombreux mérites, le système CRISPR/Cas9 a été appliqué à divers domaines, y compris la biomédecine6,7, la thérapie génique8,9 et l’agriculture10,11,12, et a été utilisé pour divers systèmes biologiques, y compris les micro-organismes13, les plantes14,15, les nématodes16 et les mammifères17 . Chez les invertébrés, de nombreuses espèces d’insectes ont été soumises à l’édition du génome CRISPR/Cas9, comme la mouche des fruits Drosophila melanogaster et au-delà18,19,20,21,22.
Helicoverpa armigera est l’un des ravageurs les plus destructeurs au monde23 et endommage de nombreuses cultures, notamment le coton, le soja et le sorgho24,25. Avec le développement de la technologie de séquençage, le génome de H. armigera, ainsi que celui d’une gamme d’espèces d’insectes lépidoptères, ont été séquencés complètement26,27,28,29. Un grand nombre de gènes de résistance et de récepteurs olfactifs ont été identifiés et caractérisés à partir de ces insectes au cours des dernières années19,27,28,29. Certains gènes liés à la résistance ont été identifiés chez H. armigera, tels que les gènes codant pour la cadhérine30, un transporteur de cassettes liant l’ATP31,32, ainsi que HaTSPAN133. L’élimination de ces gènes à l’aide de la technologie CRISPR/Cas9 entraîne un niveau élevé de résistance à la toxine Bacillus thuringiensis (BT) chez les souches sensibles. En outre, Chang et al. (2017) ont éliminé un récepteur de phéromones, ce qui a validé sa fonction significative dans la régulation du temps d’accouplement19. Ces rapports suggèrent que CRISPR/Cas9 peut agir comme un outil efficace pour étudier la fonction des gènes in vivo dans les systèmes d’insectes. Cependant, une procédure détaillée pour la modification CRISPR/Cas9 dans les systèmes d’insectes reste incomplète, ce qui limite sa gamme d’applications en génomique fonctionnelle des insectes.
Nous présentons ici un protocole pour éliminer un gène fonctionnel chez H. armigera à l’aide du système CRISPR/Cas9. Un protocole détaillé étape par étape est fourni, y compris la conception et la préparation d’amorces spécifiques aux gènes pour la production d’ARNg, la collecte d’embryons, la microinjection, l’élevage d’insectes et l’identification des mutants. Ce protocole sert de référence précieuse pour manipuler tout gène fonctionnel chez H. armigera et peut être étendu à d’autres espèces de lépidoptères.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’application du système CRISPR/Cas9 a fourni un support technique puissant pour l’analyse de la fonction des gènes et de l’interaction entre divers gènes. Le protocole détaillé que nous présentons ici démontre la génération d’un mutant homozygote chez H. armigera via l’édition du génome CRISPR/Cas9. Cette procédure fiable fournit un moyen simple de mutagénèse génique dirigée chez H. armigera.
Le choix des sites cibles CRISPR pourrait affecter l’ef…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la National Natural Science Foundation of China (31725023, 31861133019 à GW et 31171912 à CY).
Materials
| 2kb DNA ladder | TransGen Biotech | BM101 | |
| Capillary Glass | World Precision Instrucments | 504949 | referred to as "capillary glass" in the protocol |
| Double Sided Tape | Minnesota Mining and Manufacturing Corporation | 665 | |
| Eppendorf FemtoJet 4i Microinjector | Eppendorf Corporate | E5252000021 | |
| Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator | Eppendorf Corporate | 5192000051 | |
| Eppendorf Microloader Pipette Tips | Eppendorf Corporate | G2835241 | |
| GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | A29377 | |
| Microscope Slide | Sail Brand | 7105 | |
| Olympus Microscope | Olympus Corporation | SZX16 | |
| PrimeSTAR HS (Premix) | Takara Biomedical Technology | R040 | used for mutant detection |
| Sutter Micropipette Puller | Sutter Instrument Company | P-1000 | |
| TIANamp Genomic DNA Kit | TIANGEN Corporate | DP304-03 | |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo Fisher Scientific | A36499 |
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