Embryomikroinjeksjon og knockout mutant identifikasjon av CRISPR/Cas9 Genom-redigert Helicoverpa Armigera (Hübner)
Summary
Presentert her er en protokoll av Helicoverpa armigera (Hübner) embryo mikroinjeksjon og knockout mutant identifikasjon opprettet av CRISPR / Cas9 genom redigering. Mutante insekter muliggjør videre forskning på genfunksjon og interaksjon mellom ulike gener in vivo.
Abstract
Bomullsbollworm, Helicoverpa armigera, er en av de mest destruktive i verden. En kombinasjon av molekylær genetikk, fysiologi, funksjonell genomikk og atferdsstudier har gjort H. armigera til en modellart i Lepidoptera Noctuidae. For å studere in vivo-funksjonene til og interaksjoner mellom forskjellige gener, er gruppert regelmessig interspaced korte palindromiske repetisjoner (CRISPR)/ assosiert protein 9 (Cas9) genomredigeringsteknologi en praktisk og effektiv metode som brukes til å utføre funksjonelle genomiske studier. I denne studien tilbyr vi en trinnvis systematisk metode for å fullføre gen knockout i H. armigera ved hjelp av CRISPR / Cas9-systemet. Design og syntese av guide RNA (gRNA) er beskrevet i detalj. Deretter oppsummeres de påfølgende trinnene som består av genspesifikk primerdesign for RNA (gRNA) opprettelse, embryosamling, mikroinjeksjon, insektoppdrett og mutantdeteksjon. Til slutt gis feilsøkingsråd og notater for å forbedre effektiviteten av genredigering. Vår metode vil fungere som en referanse for anvendelsen av CRISPR / Cas9 genomredigering i H. armigera samt andre Lepidopteran møll.
Introduction
Anvendelsen av genomredigeringsteknologi gir et effektivt verktøy for å oppnå målgenmutanter i forskjellige arter. Fremveksten av det klyngede regelmessig interspaced korte palindromiske repetisjoner (CRISPR) / assosiert protein 9 (Cas9) systemet gir en ny metode for å manipulere genomer1. CRISPR/Cas9-systemet består av en guide RNA (gRNA) og Cas9 endonuclease2,3, mens gRNA kan videre deles inn i to deler, et mål komplementær CRISPR RNA (crRNA) og en transaktiverende crRNA (tracrRNA). GRNA integreres med Cas9 endonuclease og danner et ribonukleoprotein (RNP). Med gRNA kan Cas9 endonuclease rettes til et bestemt sted for genomet via base komplementering. RuvC- og HNH-domenene til Cas9 cleave målstedet til genomet tre baser før protospacer-tilstøtende motiv (PAM) sekvens og skape en dobbel-strand pause (DSB). DNA-spaltingen kan deretter repareres gjennom to mekanismer, ikke-homolog ende sammenføyning (NHEJ) eller homologi-rettet reparasjon (HDR)4. Reparasjon av DSB introduserer innsettinger eller slettinger som en måte å inaktivere det målrettede genet på, noe som potensielt kan føre til et fullstendig tap av genfunksjon. Derfor gjør den arvelige og spesifisiteten til CRISPR/Cas9-systemet det til en robust metode for å karakterisere genfunksjoner in vivo og analysere geninteraksjoner5.
Med mange fordeler har CRISPR/Cas9-systemet blitt brukt på ulike felt, inkludert biomedisin6,7, genterapi8,9 og landbruk10,11,12, og har blitt brukt til ulike biologiske systemer, inkludert mikroorganismer13, planter14,15, nematoder16 og pattedyr17 . I hvirvelløse dyr har mange insektarter blitt utsatt for CRISPR / Cas9 genomredigering, for eksempel fruktfluen Drosophila melanogaster og utover 18,19,20,21,22.
Helicoverpa armigera er en av de mest destruktive over hele verden23, og skader mange avlinger, inkludert bomull, soyabønner og sorghum24,25. Med utviklingen av sekvenseringsteknologi har genomet til H. armigera, så vel som for en rekke Lepidoptera insektarter, blitt sekvensert helt26,27,28,29. Et stort antall resistens- og olfaktoriske reseptorgener har blitt identifisert og karakterisert fra disse insektene de siste årene19,27,28,29. Noen resistensrelaterte gener er identifisert i H. armigera, for eksempel genkoding for kadherin30, en ATP-bindende kassetttransportør31,32, samt HaTSPAN133. Knockout av disse genene ved hjelp av CRISPR/ Cas9-teknologi resulterer i et høyt nivå av motstand mot Bacillus thuringiensis (BT) toksin i mottakelige stammer. Chang et al. (2017) slo også ut en feromonreseptor, som validerte sin betydelige funksjon i parringstidsregulering19. Disse rapportene tyder på at CRISPR/Cas9 kan fungere som et effektivt verktøy for å studere genfunksjon in vivo i insektsystemer. Imidlertid forblir en detaljert prosedyre for CRISPR / Cas9-modifikasjon i insektsystemer ufullstendig, noe som begrenser bruksområdet i insektfunksjonell genomikk.
Her presenterer vi en protokoll for å slå ut et funksjonelt gen i H. armigera ved hjelp av CRISPR / Cas9-systemet. En detaljert trinnvis protokoll er gitt, inkludert design og forberedelse av genspesifikke primere for gRNA-produksjon, embryosamling, mikroinjeksjon, insektoppdrett og mutantidentifikasjon. Denne protokollen fungerer som en verdifull referanse for å manipulere eventuelle funksjonelle gener i H. armigera og kan utvides til andre Lepidoptera-arter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Anvendelsen av CRISPR/Cas9-systemet har gitt kraftig teknisk støtte til analyse av genfunksjon og interaksjon mellom ulike gener. Den detaljerte protokollen vi presenterer her demonstrerer genereringen av en homozygot mutant i H. armigera via CRISPR / Cas9 genomredigering. Denne pålitelige prosedyren gir en enkel måte for rettet genmutagenese i H. armigera.
Valget av CRISPR-målsider kan påvirke mutageneseeffektiviteten37. I denne protokollen samme…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (31725023, 31861133019 til GW, og 31171912 til CY).
Materials
| 2kb DNA ladder | TransGen Biotech | BM101 | |
| Capillary Glass | World Precision Instrucments | 504949 | referred to as "capillary glass" in the protocol |
| Double Sided Tape | Minnesota Mining and Manufacturing Corporation | 665 | |
| Eppendorf FemtoJet 4i Microinjector | Eppendorf Corporate | E5252000021 | |
| Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator | Eppendorf Corporate | 5192000051 | |
| Eppendorf Microloader Pipette Tips | Eppendorf Corporate | G2835241 | |
| GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | A29377 | |
| Microscope Slide | Sail Brand | 7105 | |
| Olympus Microscope | Olympus Corporation | SZX16 | |
| PrimeSTAR HS (Premix) | Takara Biomedical Technology | R040 | used for mutant detection |
| Sutter Micropipette Puller | Sutter Instrument Company | P-1000 | |
| TIANamp Genomic DNA Kit | TIANGEN Corporate | DP304-03 | |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo Fisher Scientific | A36499 |
Referências
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Ding, Q., et al. Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs. Cell Stem Cell. 12 (4), 393-394 (2013).
- Collins, P. J., Hale, C. M., Xu, H. Edited course of biomedical research: leaping forward with CRISPR. Pharmacological Research. 125, 258-265 (2017).
- Huang, J., Wang, Y., Zhao, J. CRISPR editing in biological and biomedical investigation. Journal of Cellular Physiology. 233 (5), 3875-3891 (2018).
- Guan, L., Han, Y., Zhu, S., Lin, J. Application of CRISPR-Cas system in gene therapy: pre-clinical progress in animal model. DNA Repair. 46, 1-8 (2016).
- Wu, J., et al. Gene therapy for glaucoma by ciliary body aquaporin 1 disruption using CRISPR-Cas9. Molecular Therapy. 28 (3), 820-829 (2020).
- Jiao, R., Gao, C. The CRISPR/Cas9 genome editing revolution. Journal of Genetics and Genomics. 43, 227-228 (2016).
- Gupta, M., Gerard, M., Padmaja, S. S., Sastry, R. K. Trends of CRISPR technology development and deployment into Agricultural Production-Consumption Systems. World Patent Information. 60, 101944 (2020).
- Es, I., et al. The application of the CRISPR-Cas9 genome editing machinery in food and agricultural science: Current status, future perspectives, and associated challenges. Biotechnology Advances. 37 (3), 410-421 (2019).
- Tarasava, K., Oh, E. J., Eckert, C. A., Gill, R. T. CRISPR-enabled tools for engineering microbial genomes and phenotypes. Biotechnology Journal. 13 (9), 1700586 (2018).
- Ma, X., Zhu, Q., Chen, Y., Liu, Y. -. G. CRISPR/Cas9 platforms for genome editing in plants: developments and applications. Molecular Plant. 9 (7), 961-974 (2016).
- Pandey, P. K., et al. Versatile and multifaceted CRISPR/Cas gene editing tool for plant research. Seminars in Cell & Developmental Biology. 96, 107-114 (2019).
- Friedland, A. E., et al. Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system. Nature Methods. 10 (8), 741-743 (2013).
- Mojica, F. J., Montoliu, L. On the origin of CRISPR-Cas technology: from prokaryotes to mammals. Trends in Microbiology. 24 (10), 811-820 (2016).
- Taning, C. N. T., Van Eynde, B., Yu, N., Ma, S., Smagghe, G. CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns. Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).
- Chang, H., et al. A pheromone antagonist regulates optimal mating time in the moth Helicoverpa armigera. Current Biology. 27 (11), 1610-1615 (2017).
- Yan, H., et al. An engineered orco mutation produces aberrant social behavior and defective neural development in ants. Cell. 170 (4), 736-747 (2017).
- Koutroumpa, F., et al. Heritable genome editing with CRISPR/Cas9 induces anosmia in a crop pest moth. Scientific Reports. 6 (1), 29620 (2016).
- Chen, D., et al. CRISPR/Cas9-mediated genome editing induces exon skipping by complete or stochastic altering splicing in the migratory locust. BMC Biotechnology. 18 (1), 1-9 (2018).
- Fitt, G. P. The ecology of Heliothis species in relation to agroecosystems. Annual Review of Entomology. 34 (1), 17-53 (1989).
- Jallow, M. F., Cunningham, J. P., Zalucki, M. P. Intra-specific variation for host plant use in Helicoverpa armigera (Hübner)(Lepidoptera: Noctuidae): implications for management. Crop Protection. 23 (10), 955-964 (2004).
- Ai, D., et al. Gene cloning, prokaryotic expression, and biochemical characterization of a soluble trehalase in Helicoverpa armigera Hübner (Lepidoptera: Noctuidae). Journal of Insect Science. 18 (3), 22 (2018).
- Wan, F., et al. A chromosome-level genome assembly of Cydia pomonella provides insights into chemical ecology and insecticide resistance. Nature Communications. 10 (1), 1-14 (2019).
- Cheng, T., et al. Genomic adaptation to polyphagy and insecticides in a major East Asian noctuid pest. Nature Ecology & Evolution. 1 (11), 1747-1756 (2017).
- Xu, W., Papanicolaou, A., Zhang, H. J., Anderson, A. Expansion of a bitter taste receptor family in a polyphagous insect herbivore. Science Reports. 6, 23666 (2016).
- Gouin, A., et al. Two genomes of highly polyphagous lepidopteran pests (Spodoptera frugiperda, Noctuidae) with different host-plant ranges. Scientific Reports. 7 (1), 1-12 (2017).
- Wang, J., et al. Functional validation of cadherin as a receptor of Bt toxin Cry1Ac in Helicoverpa armigera utilizing the CRISPR/Cas9 system. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 76, 11-17 (2016).
- Wang, J., Wang, H., Liu, S., Liu, L., Wu, Y. CRISPR/Cas9 mediated genome editing of Helicoverpa armigera with mutations of an ABC transporter gene HaABCA2 confers resistance to Bacillus thuringiensis Cry2A toxins. Insect Biochemistry and Molecular biology. 87, 147 (2017).
- Wang, J., Ma, H., Zhao, S., Huang, J., Wu, Y. Functional redundancy of two ABC transporter proteins in mediating toxicity of Bacillus thuringiensis to cotton bollworm. PLoS Pathogens. 16 (3), 1008427 (2020).
- Jin, L., et al. Dominant point mutation in a tetraspanin gene associated with field-evolved resistance of cotton bollworm to transgenic Bt cotton. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (46), 11760-11765 (2018).
- Hongtao, Z., Jianan, L., Lian, T., Yang, Z. Sexing of Helicoverpa assulta and Helicoverpa armigera pupae based on machine vision. Tobacco Sciene & Technology. 53 (2), 21-26 (2019).
- Wu, K., Gong, P. A new and practical artificial diet for the cotton boll-worm. Insect science. 4 (3), 277-282 (1997).
- Jha, R. K., Chi, H., Li-Cheng, T. A Comparison of Artificial Diet and Hybrid Sweet Corn for the Rearing of Helicoverpa armigera (Hübner) (Lepidoptera: Noctuidae) Based on Life Table Characteristics. Environmental Entomology. (1), 30 (2012).
- Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. -. L. Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system. Cell Reports. 4 (1), 220-228 (2013).
- Zheng, M. -. Y., et al. A non-destructive method of genotyping individual insects from the exuviate of final instar larvae, or puparia. Chinese Journal of Applied Entomology. (2), 21 (2018).
- Pashley, D. P., Hammond, A. M., Hardy, T. N. Reproductive isolating mechanisms in fall armyworm host strains (Lepidoptera: Noctuidae). Annals of The Entomological Society of America. 85 (4), 400-405 (1992).
- Kamimura, M., Tatsuki, S. Diel rhythms of calling behavior and pheromone production of oriental tobacco budworm moth, Helicoverpa assulta(Lepidoptera: Noctuidae). Journal of Chemical Ecology. 19 (12), 2953-2963 (1993).
- Edwards, K. D. Activity rhythms of lepidopterous defoliators: ii. Halisidota argentata pack. (arctiidae), and nepytia phantasmaria stkr. (GEOMETRIDAE). Canadian Journal of Zoology. 42 (6), 939-958 (1964).
