Summary
Den præsenterede metode muliggør visualisering af fluorescerende mærkede cellulære proteiner med ekspansionsmikroskopi, der fører til en opløsning på 70 nm på et konventionelt mikroskop.
Abstract
Afbrydelse af det glomerulære filter bestående af den glomerulære endotel, kugleformede kældermembran og podocytter, resulterer i albuminuria. Podocyte fodprocesser indeholder actin bundter, der binder sig til cytoskeletal adapter proteiner såsom podocin. Disse adapterproteiner, såsom podocin, forbinder rygraden i det glomerulære spaltede mellemgulv, såsom nephrin, med actin cytoskelet. At studere lokaliseringen og funktionen af disse og andre podocytiske proteiner er afgørende for forståelsen af det glomerulære filters rolle i sundhed og sygdom. Den præsenterede protokol gør det muligt for brugeren at visualisere actin, podocin og nephrin i celler med superopløsningsbilleddannelse på et konventionelt mikroskop. For det første farves celler med en konventionel immunfluorescensteknik. Alle proteiner i prøven er derefter kovalent forankret til en svulmelig hydrogel. Gennem fordøjelsen med proteinase K kløves strukturelle proteiner, hvilket tillader isotropisk hævelse af gelen i det sidste trin. Dialyse af prøven i vand resulterer i en 4-4,5 gange udvidelse af prøven, og prøven kan afbildes via et konventionelt fluorescensmikroskop, hvilket gør en potentiel opløsning på 70 nm.
Introduction
Albuminuria er en surrogatparameter for hjerte-kar-risiko og skyldes afbrydelse af det glomerulære filter1. Det kugleformede filter består af fenestrated endothelium, den kugleformede kældermembran og slidsmembran dannet af podocytter. Primære og sekundære fodprocesser af podocytter ombrydes omkring glomerulumens kapillærvæg2. Den delikate struktur af fodprocesser opretholdes af kortikale actinbundter, der også tjener som ankre for flere spaltede membranproteiner og andre adapterproteiner2. Spaltemembranens rygradprotein kaldes nephrin og interagerer på en homofil måde med nephrinmolekyler af modsatrettede podocytter. Via forskellige adapterproteiner er nephrin knyttet til actin cytoskeleton2,3. Mutationer i nephrin-kodningsgenet NPHS1 fører til nefrotisk syndrom af finsk type4.
En af nephrin's interagerende proteiner er podocin, en hårnål-lignende protein i stomatin familien3. Podocin rekrutter nephrin til lipid flåder og links det til actin cytoskeleton5. Podocin er kodet af NPHS2 genet. Mutationer i NPHS2 føre til steroid-resistente nefrotiske syndrom6.
For at visualisere og lokalisere actin-adapterproteiner kan der anvendes immunfluorescensteknikker. Desværre begrænser lysets diffraktionsbarriere opløsningen af konventionelle fluorescensmikroskoper til 200-350 nm7. Nye mikroskopiteknikker, f.eks. stimuleret emissionsudtømning (STED)8, fotoaktiveret lokaliseringsmikroskopi (PALM)9, stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi (STORM eller dSTORM) eller jordtilstandssletningsmikroskopi efterfulgt af individuel molekyleretur (GSDIM)9,10,11, muliggør en opløsning på op til ca. 10 nm. Disse superopløsningsteknikker kræver imidlertid meget dyre mikroskoper, veluddannet personale og er derfor ikke tilgængelige i mange laboratorier.
Udvidelse mikroskopi (ExM) er en ny og enkel teknik, der muliggør super opløsning billeddannelse med konventionelle mikroskoper og er potentielt tilgængelig for et stort forskningsmiljø12. I proteinophobningsudvidelsesmikroskopi (proExM) fastgøres og farves prøven af interesse (celler eller væv) med fluorophorer13. Proteinerne i prøven er derefter kovalent forankret af et lille molekyle (6-((Acryloyl)amino)hexanosyre, succinimidylester, AcX) til en svulmelig hydrogel13. Gennem enzymatisk fordøjelse med proteinase K (ProK) bevarer proteiner og fluorophorer deres relative position i gelen efter ekspansion13. Efter hævelse af gelen udvides prøven op til 4,5 gange (90 gange volumetrisk ekspansion), hvilket fører til en effektiv lateral opløsning på ca. 60-70 nm (300 nm/4.5). Ændringer af denne teknik kan endda give mulighed for en 10-fold ekspansion (1.000 gange volumetrisk ekspansion), hvilket gør en opløsning på 20-30 nm på konventionelle mikroskoper14,15,16.
Glomerulære strukturer af mus og menneskelige nyrer er blevet visualiseret via ExM17. I dette papir præsenterer vi en detaljeret proExM-protokol til visualisering af superopløsningsbilleder af F-actin og actin-adapter protein podocin i celler ved hjælp af et konventionelt fluorescensmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Opdeling og såning af celler
- Varm sterilt Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), herunder 10% føtal kalv serum (FCS), steril Fosfat buffered saltvand (PBS) og steril trypsin til 37 °C. Aktiver den rene bænk.
- Forbered en 6-brønds plade ved at tilføje en steril glasdæksel slip (10 mm) til hver brønd ved hjælp af sterile pincet.
- Sæt en 10 cm cellekultur skål med Cos7 celler under den rene bænk. Under den rene bænk suges cellernes medium ved hjælp af en vakuumanordning.
- Hold den regulerede cellekulturskål i den ene hånd og tilsæt 10 mL steril PBS til siden af cellekulturretten for at undgå at skylle celler af. Sæt cellekulturskålen fra dig, så PBS skyller hele cellekulturskålen.
- PBS fjernes, og der tilsættes 1 mL trypsin til midten af cellekulturskålen og inkuberes i 5 min ved 37 °C.
- Stop trypsiniseringsreaktionen ved at tilføje 10 ml DMEM inklusive 10% FCS og pipette celleopløsningen op og ned med en pipettor for manuelt at adskille cellerne.
- Analysere celletallet pr. milliliter ved hjælp af et tællekammer.
- Frø 68.000 celler i 2 mL medium per brønd på glasdækslet glider i 6-brønds pladen. Fordel cellerne i 6-brøndspladen ved forsigtigt at ryste pladen vandret og lodret.
BEMÆRK: Cellerne skal ligge spredt. - Cellerne inkuberes natten over i en 37 °C inkubator med 5% CO2.
2. Transfekt af celler
- Der fremstilles to sterile 1,5 mL rør (et til fortyndet DNA (A) og et til fortyndet reagens til kationisk lipidtransfekt (B)). 0,75 μg nephrin og 0,75 μg podocin cDNA-udtryk plasmid pr. godt ind i et 1,5 mL rør og fortynd det til 100 μL reduceret serummedium pr. brønd. Der tilsættes 3 μL kationisk lipidtransfekt reagens pr. brønd til det andet 1,5 mL rør og fortyndes med 100 μL reduceret serummedium. Inkuber begge reaktioner i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Kombiner begge reaktioner (A og B) til et DNA-lipidkompleks og inkuber i 20 minutter ved stuetemperatur. Forsigtigt tilføje 200 μL af DNA-lipid kompleks til hver brønd.
- De transfected celler inkuberes ved 37 °C med 5% CO2 i 48 timer uden at skifte medium.
3. Immunolabeling af cellestrukturer
- Der fremstilles en fastgørelsesopløsning (4% (w/v) paraformaldehyd i PBS, 1 mL/brønd), gennemtrængningsopløsningen (0,5% (w/v) Triton X-100 i PBS, 1 mL/brønd) og en blokeringsopløsning (5% (v/v) kvægserumalbumin i PBS, 1 ml/brønd).
- Fjern mediet med en vakuumanordning. Tilsæt 2 mL PBS til hver brønd for at fjerne ekstra medium. Indsug PBS helt.
BEMÆRK: For at undgå at vaske celler væk med PBS skal du sørge for at pipette PBS ikke direkte på glasdækslet. - Ret celler med 4% (w/v) paraformaldehyd (PFA) opløst i PBS i 10 minutter ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Alternativt kan du fiksere celler i 3% (v/v) glyoxal-ethanol18. - Kassér PFA og vask celler to gange i PBS (2 mL hver) ved at undgå direkte pipetter på glasdækslet glider. Gennemtræng de faste celler med Triton X-100 0,5% (w/v) i PBS i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Permeabiliseringsopløsningen fjernes, og der vaskes to gange med PBS som angivet i trin 3.2.
- Bloker cellerne ved at tilføje 1 mL på 5% (v/v) BSA i PBS i 1 time ved stuetemperatur. Cellerne inkuberes med 200 μL af det primære antistof (anti-podocinantistof 1:200 i 1% (v/v) BSA i PBS) natten over ved 4 °C.
BEMÆRK: Alternativt kan du inkubere det primære antistof i 1 time ved stuetemperatur. - Det primære antistof fjernes, og der vaskes tre gange med PBS som i trin 3.2. Tilsæt det sekundære antistof (ged anti-kanin Alexa 488 1:1000 i 1% (v / v) BSA i PBS) i 1 time ved stuetemperatur. Hold cellerne i mørke ved hjælp af en kasse.
- Kassér det sekundære antistof og vask med PBS tre gange.
- PBS fjernes, og cellerne inkuberes med 200 μL antinephrinantistof 1:100 i 1% (v/v) BSA i PBS i 1 time ved stuetemperatur. Vask med PBS tre gange. Hold cellerne i mørke ved hjælp af en kasse.
- Fjern PBS og inkuber med det sekundære antistof æsel anti-marsvin 633, 1:200, i 1 time ved stuetemperatur. Vask med PBS tre gange. Hold cellerne i mørke ved hjælp af en kasse.
4. Udvidelse mikroskopi
- Under forberedelse
- For at danne afstandsstykkerne til geleringskammeret glider det afskårne glasdæksel #1,0 og #1,5 i 5 mm striber (fire hver pr. glasrutsjebane) med en diamantkniv. Placer de #1,5 mm dække slip striber, så de danner en firkant på 2,5 cm længde på et glas dias og læg dem i et farvning kammer(Figur 2A1-C1). Pipette en dråbe ddH2O ind i hjørnerne af pladsen for at klæbe glasdækslet slip striber til hinanden og til glasrutschebanen(Figur 2A2-C2).
BEMÆRK: Undgå fuldstændig tørring af ddH2O, da vedhæftningskraften går tabt. Hvis det er nødvendigt, påføres flere dråber ddH2O. Vent i ca. 20 minutter, så #1,5 mm dæksedler er stabilt fastgjort, før du starter med trin 4.1.2. - Placer fire #1,0 glasdæksedler pr. dæksedlen på #1,5 mm dæksedlerne. Sæt striberne på ved at pipette en dråbe på hver #1,5 mm dæksedler (Figur 2A3-C3).
BEMÆRK: Gelens tykkelse skal være mindst 0,15 mm for at lette håndteringen under protokollens forløb. Men for at undgå overdreven gel oven på cellerne, holde afstandsstykket højde tæt på cellen substrat. Ved at bruge #1,5 og #1,0 dække slip striber som afstandsstykke, vil afstandsstykket højde være ca 0,3 mm. Cellerne klæber til dækglasset (højde 0,12 mm). Derfor vil gelen være tyk nok til at håndtere, men overdreven gel på toppen af cellerne undgås ved hjælp af #1,0 og #1,5 dække glas striber som afstandsstykker. - Til geleringskammerlåget skal du pakke et dækglas (#1,5) med paraffinfilm. Undgå folder eller snavs på paraffinfilmen(figur 2A5-C5).
- For at danne afstandsstykkerne til geleringskammeret glider det afskårne glasdæksel #1,0 og #1,5 i 5 mm striber (fire hver pr. glasrutsjebane) med en diamantkniv. Placer de #1,5 mm dække slip striber, så de danner en firkant på 2,5 cm længde på et glas dias og læg dem i et farvning kammer(Figur 2A1-C1). Pipette en dråbe ddH2O ind i hjørnerne af pladsen for at klæbe glasdækslet slip striber til hinanden og til glasrutschebanen(Figur 2A2-C2).
- Forankring og polymerisering (gelering)
- Forbered forankringsbufferen (se tabel 1). Til forankringsbehandling skal PBS udskiftes med 250 μL forankringsbuffer pr. brønd direkte på glasdækslet og inkuberes i 3 timer ved stuetemperatur. Hold substrat i mørke ved hjælp af en kasse.
BEMÆRK: Alternativt kan du inkubere natten over ved stuetemperatur. Forbered frisk forankringsbuffer til hvert eksperiment og vent i 10-15 minutter, indtil den er opløst korrekt. 6-((Acryloyl)amino)hexanosyre, succinimidylester (AcX) bør udskiftes hver 4-5. måned for at sikre tilstrækkelig forankring. - Fjern forankringsbufferen og vask en gang med 1,5 mL PBS pr. brønd.
- For at plette actinfibre skal du optø en ExM-kompatibel falloidopløsning og inkubere falloidinen (5 μL falloidin fortyndet i 195 μL på 1% (v/v) BSA i PBS/well) i 45 minutter ved stuetemperatur. Hold prøverne i mørke ved hjælp af en kasse.
- I mellemtiden opløses natriumkrylat i ddH2O ved hjælp af en omrøringsanordning. På isen fremstilles monomeropløsningen (se tabel 1).
BEMÆRK: Opløst natriumkrylat skal være en klar og farveløs opløsning. Hvis opløsningen er gul, skal den erstattes med ny natriumkrylat. - Geleringsopløsningen fremstilles på is (se tabel 1). Pipette ammoniumperoxidsulfat (APS) i geleringsopløsningen lige før geleringsopløsningen påføres geleringskammeret.
- Fjern phalloidin fra cellerne og vask med 1,5 mL PBS to gange ved stuetemperatur. Lad 1,5 mL PBS stå i brønden for at lette fjernelsen af prøven på glasdækslet.
- Placer cellerne på dækglasset i geleringskammeret ved hjælp af pincet og en kanyle for at løfte dækglasset glide fra 6-brøndspladen.
BEMÆRK: Cellerne skal være på toppen af glasdækslet. Glasdækslet må ikke berøre afstandsstykkerne. - Tilsæt APS til geleringsopløsningen og vortex kort tid. Pipetter 200 μL geleringsopløsning på prøven(figur 2A4-C4). Luk forsigtigt geleringskammeret ved at undgå luftbobler i gelen (Figur 2A5-C5).
- Geleringskammeret inkuberes i mindst 1 time ved 37 °C for at polymerisere gelen i det våde farvningskammer.
- Forbered forankringsbufferen (se tabel 1). Til forankringsbehandling skal PBS udskiftes med 250 μL forankringsbuffer pr. brønd direkte på glasdækslet og inkuberes i 3 timer ved stuetemperatur. Hold substrat i mørke ved hjælp af en kasse.
- Homogenisering (fordøjelse)
- Tag farvningskammeret ud af inkubatoren. For at åbne geleringskammerlåget skal du introducere et barberblad mellem låget og afstandsstykket. Fjern låget forsigtigt. Fjern afstandsstykket med barberbladet, og fjern al ekstra gel ved at skære det med barberbladet.
- Sæt rutsjebanen med gelen og dækglasset i en skål fyldt med PBS. Ved at ryste forsigtigt, fjern det fritliggende dækglas fra gelen. For nemt at fjerne gelen fra skålen skal du sætte rutsjebanen under gelen for at fastgøre gelen til diaset.
- Med gelen på rutsjebanen skal du dele gelen i små stykker (kvart af gelen er opdelt i to til tre stykker) ved hjælp af barberbladet. Skub forsigtigt et stykke gel ind i en brønd med en 6-brønds plade med glasbund og omslut det med en pensel. Hold gelen fugtet med en lille mængde PBS ved hjælp af penslen for at undgå dehydrering af gelen.
BEMÆRK: Cellerne vender nedad. - Brug et omvendt mikroskop til at tage oversigtsbilleder med lav numerisk blænde for at bestemme ekspansionsfaktoren efter udvidelsen.
- Forbered fordøjelsesbufferen (se tabel 1). Fortynd Proteinase K til 4 U/mL i fordøjelsesbufferen for at modtage fordøjelsesopløsningen.
BEMÆRK: Fordøjelsesbuffer uden Proteinase K kan opbevares ved 4 °C i 1-2 uger. - Der tilsættes 500 μL af fordøjelsesopløsningen til hver brønd, og gelen nedsænkes i opløsningen. Lad det fordøje natten over ved stuetemperatur og luk låget og hold prøverne i mørke.
BEMÆRK: Alternativt kan den fordøjes ved 37 °C i 1 time.
- Udvidelse
- Fjern fordøjelsesopløsningen med en pipette, og kassér den. Der tilsættes 1 mL ddH2O. Inkubat den nedsænkede gel i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Fjern vandet og tilsæt 1 mL frisk ddH2O. Vent i 10 minutter og fortsæt med at udveksle vand hvert 10. minut, indtil et plateau af ekspansion er nået.
BEMÆRK: Prøveudvidelse op til 4,5 gange er opnåelig. Gelen bliver optisk klar.
- Imaging
- Fjern vandet fra gelen og start mikroskopi direkte. Brug et omvendt mikroskop til primært at bruge et luftmål (lav forstørrelse) til at finde afbildede celler i tilstanden før udvidelse (trin 4.3.4).
- Skift til en 40x (olie / vand) og 63x mål for bedre opløsning. Excite med bølgelængde af interesse og tage billedet via kameraet.
- Validering
- Tag et overblikbillede af eksemplet. Find og match de samme strukturer i prøven, som blev afbildet i trin 4.3.4. Brug kanalen med det bedste signal-til-støj-forhold til validering (Figur 3 A-B).
BEMÆRK: Juster billedparametrene for at opnå samme lysstyrke som i det billede, der er erhvervet i ikke-udvidet tilstand (trin 4.3.4). - Overlejr før- og efterudvidelsesbilleder ved at rotere og flytte dem med ImageJ. Brug afstandsmåleværktøjet i ImageJ til at måle afstandene mellem klart identificerbare strukturer. Mål mindst 10 forskellige strukturer.
BEMÆRK: Alternativt kan du bruge et Python-script til at måle afstande som beskrevet i14. - Beregn udvidelsesfaktoren ved at dividere målinger efter/før udvidelse.
- Hvis du vil bestemme forvrængninger, skal du tage billeder med en højere numerisk blændeåbning (Figur 4A-B). Overlejr disse billeder, og analyser dem med ImageJ eller som beskrevet i15.
BEMÆRK: Bestemmelse af forvrængninger skal udføres rutinemæssigt, men ikke nødvendigvis på hver prøve.
- Tag et overblikbillede af eksemplet. Find og match de samme strukturer i prøven, som blev afbildet i trin 4.3.4. Brug kanalen med det bedste signal-til-støj-forhold til validering (Figur 3 A-B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Konceptet og timingen af denne proExM-protokol er afbildet i figur 1. På dag 5 er transfected celler faste og farves med fluorescerende antistoffer rettet mod det protein af interesse (Figur 1A,B). På dag 6 fører behandling med AcX til dannelse af amingrupper på alle proteiner (herunder fluorophorer) (Figur 1A,B)12. Ved polymerisering af hydrogelen binder disse amingrupper kovalent til hydrogelen (dag 6). Efter polymerisering af gelen udføres homogenisering (fordøjelse) med proteinase K, hvilket resulterer i ødelæggelse af strukturelle proteiner i cellen (dag 6, figur 1A,B). Fluorescerende mærkede antistoffer forbliver for det meste bevaret efter fordøjelsen. På grund af afbrydelsen af strukturelle proteiner resulterer vanddialyse af hydrogelen i isotropisk udvidelse af cellen i hydrogelen på dag 7(figur 1A,B). Billeddannelse af prøven udføres med et konventionelt fluorescensmikroskop (Figur 1A). Datavalidering for at bestemme ekspansionsfaktoren og udelukke fordrejninger bør udføres (Figur 1A).
For at udføre udvidelse af cellen isotropisk er geleringstrinnet vigtigt. Figur 2 viser det laterale og øverste billede af et geleringskammer. Glasdæksler bygger geleringskammerets afstandsstykker(figur 2A1-3/C1-3). Dækglasset med de faste og farvede celler er placeret med cellerne opad på en glasrutsjebane(Figur 2A4-C4). Geleringskammerets låg er pakket ind i parafilm og er lukket boblefrit (Figur 2A5-C5).
Denne ExM-protokol muliggør udvidelse af op til fire gange. For at bestemme ekspansionsfaktoren er det vigtigt at billedceller før og efter ekspansion (Figur 3A + B). Utilstrækkelig forankring og homogenisering kan føre til forvrængninger og brud på cellerne. Figur 4A + B viser repræsentative eksempler på bristede celler i forskellige forstørrelsesbilleder.
Denne metode kan bruges til at undersøge samlokalisering af F-actin og actin-adapterproteiner, f.eks. podocin og nephrin (Figur 5). Podocin er afbildet med grønt, mens actin er mærket med blåt (Figur 5). Nephrin er markeret med grønt. Hvide områder angiver samlokalisering.
Figur 1: Koncept og timing af denne ExM-protokol. (A) I kolonnen "protokol" er hvert trin i protokollen skitseret. (A + B) Efter såning og transfektering af celler udføres immunfluorescerende mærkning (Immunolabeling). (A + B) Det lille molekyle AcX (rød prik) binder sig til alle proteiner og forankrer dem til hydrogel (Forankring). (A + B) Via polymerisering er alle proteiner, herunder fluorophorer, kovalent bundet via AcX til hydrogel (polymerisering). (A + B) Homogenisering fører til fordøjelsen af strukturelle matrixproteiner. (A + B) Ekspansion opnås ved dialyse i vand. (A) Billeddannelse og validering af billedbehandling afslutter eksperimentet. (A)Hele protokollen kræver 7 dage (kolonne "dag") med mange inkubationstrin (samlet tid pr. dag kolonne "samlet tid"), men den faktiske bænktid er meget mindre som angivet i den respektive kolonne "bænktid". Ændret fra14. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2:Opbygning af vallakkammeret. Sidevisning (A1) og øverste visning (B1 + C1) af en glasrutsjebane med fire #1,5 dækstriber. Ved at tilføje en dråbe vand mellem glasrutsjebanen og dækslet slip striber, vil striberne overholde glasrutschebanen(sidevisning A2, øverste visning B2, C2). Dråber af vand på #1,5 dække striber føre til vedhæftning af #1,0 dække striber lagt oven på #1,5 dække striber(sidevisning A3, top view B3, C3). Prøven på dækslets slip placeres midt på rektanglet ved hjælp af tang. Gelen er pipetteret ovenpå(sidevisning A4, øverste visning B4, C4). (A5) Sidevisning og topvisning (B5 og C5) af det samlede geleringskammer, herunder det lukkede låg, der er bygget af en dæksedlen indpakket i parafilm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3:Celler før ogefter ekspansion. Boksen angiver, i hvilket område de udvidede celler i figur 3B ligger. (B) Celler efter ekspansion farves for actin i rødt og podocin i grønt. Podocin co-lokaliserer med actin i cellen periferien. Skalabjælke = 5 μm, ekspansionsfaktor = 2. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Forvrængninger og brud på celler( A + B) Repræsentative mikroskopiske billeder af cos7-celler, immunfarvede til actin (rød). Celler blev rettet, farves, forankret, fordøjet og udvidet. (A) Brud på celler. Pile indikerede bristede områder. Skalabjælke = 5 μm, ekspansionsfaktor = 4. (B) Brud og forvrængning af celler. Hvide pile indikerede bristede områder. Skalabjælke = 5 μm, ekspansionsfaktor = 4. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5:Podocin omgås nephrin og actin. Cos7 celler immunfluorescently mærket for podocin, actin, og nephrin. (A) Cos7 celler farves for podocin (grøn), actin (blå), og nephrin (rød) med ExM. Podocin co-lokaliserer med actin og nephrin. Skalalinje = 200 nm, ekspansionsfaktor = 4. (B) Forstørrelse af det angivne område i (A), Skalalinje = 40 nm. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Forankringsbuffer | endelig koncentration | ||
| NaHCO3 | 150 mM | ||
| Acryloyl-X, SE (AcX) | 0,1 mg/ml | ||
| Monomer løsning | Koncentration af stamopløsning g/100 ml | mængde (ml) | endelig koncentration (g/100 ml) |
| natriumkrylat | 38 | 2.25 | 8.6 |
| Acrylamid | 50 | 0.5 | 2.5 |
| N,N'-Methylenbisacrylamid | 2 | 0.75 | 0.15 |
| Natriumchlorid | 29.2 | 4 | 11.7 |
| Pbs | 10x | 1 | 1x |
| Vand | 0.75 | ||
| Samlede | 9.4 | ||
| Geleringsløsning | Koncentration af stamopløsning | beløb (μl) | endelig koncentration (mg/ml) |
| monomer løsning | Na | 190 | Na |
| Aps | 10% | 4 | 0.1 |
| TEMED | >99% | 4 | 0.1 |
| Vand | Na | 2 | Na |
| Samlede | 200 | ||
| Fordøjelsesløsning | endelig koncentration | ||
| Tris Cl, pH 8,0 | 1 M | ||
| EDTA pH 8,0 | 0,5 mio. | ||
| Triton X-100 | 0.005% | ||
| Guanidin HCL | 8 M | ||
| Vand | |||
| proteinase K | 4 U/ml |
Tabel 1: Løsninger til ExM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den præsenterede metode gør det muligt for investigator at visualisere cellulære proteiner, f.eks. podocin, nephrin og cytoskeletale komponenter, f.eks. Inden for denne protokol, transfected cos7 celler bruges som en model til at studere samspillet mellem slids membran proteiner med F-actin. Desværre udtrykker udødeliggjorte podocytcellelinjer ikke tilstrækkelige endogene mængder spaltede membranproteiner19.
Med denne metode kan cellulære proteiner visualiseres med nanoskalaopløsning ved hjælp af et konventionelt fluorescensmikroskop. De mest kritiske trin i protokollen er: 1) tilstrækkelig forankring af protein amin grupper til hydrogel med AcX, 2) tilstrækkelig polymerisering af hydrogel, 3) optimal timing for fordøjelsen og 4) udvælgelse af kompatible fluorophorer.
Forankring af cellulære proteiner til hydrogel er afgørende for denne metode for at bevare proteinets position inden for hydrogel under ekspansion. AcX er et lille molekyle, der binder sig til amingrupper af proteiner i celler og væv. AcX skaber et carbon-carbon dobbeltbånd med proteiner, der muliggør inkorporering af proteinerne i hydrogelen i polymeriseringstrinnet20. AcX integrerer også antistoffer, så mærkning med immunfluorescensantistoffer kan udføres før AcX-behandling. Utilstrækkelig forankring kan føre til brud og forvrængninger af celler. På grund af modifikation af amingrupper ved fikseringsmidler skal man optimere fikserings- eller fikseringstidspunktet. Desuden kan utilstrækkelige opbevarings- eller ikke-optimerede forankringsforhold resultere i brud og forvrængninger. Baseret på vores erfaring mister AcX sin optimale effekt, når den bruges i mere end 3-4 måneder.
Polymerisering af gelen er temperaturafhængig. Vi anbefaler derfor at holde polymeriseringsopløsningerne på is, før vi pipetter det ind i geleringskammeret. Desuden bør geleringstrinnets håndteringstid holdes kort (mindre end 5 minutter) for at undgå for tidlig geldannelse. Grundig blanding af polymeriseringsopløsningen forhindrer ujævn polymerisering. Luftbobler vil påvirke ekspansionsprocessen, når prøven berøres, og kan forhindres ved at tilføje mere polymeriseringsopløsning.
Efter inkorporering af de cellulære proteiner i hydrogelen er det mekaniske homogeniseringstrin (eller fordøjelsen) nødvendigt for at sikre ekspansion. Der findes forskellige metoder,f.eks. Inden for denne protokol anvendes protease Proteinase K til enzymatisk fordøjelse. Proteinase K anvendes ved en dosis , der er tilstrækkelig til at ødelægge strukturelle proteiner , samtidig med at de fleste andre proteiner, herunder fluorescerende antistoffer, bevares12. Hvis fordøjelsen er ufuldstændig, er prøveudvidelsen utilstrækkelig. Desuden kan prøven rive under udvidelsesprocessen (Figur 3). Hvis der ikke er sket en tilstrækkelig prøveudvidelse, anbefales det at udskifte vandet. Alternativt kan tiden for den enzymatiske fordøjelse justeres, eller en ny aliquot af Proteinase K åbnes.
Hvis prøven fordøjes for meget, mindskes fluorescenssignalerne. I dette tilfælde skal fordøjelsestiden reduceres. I ExM generelt reduceres fluorescenssignalintensiteten pr. volumenenhed på grund af prøvens volumetriske udvidelse14. Derfor skal længere eksponeringstider under billeddannelse overvejes.
Det er vigtigt at vælge ExM-kompatible fluorophorer. Cyaninefarvestoffer nedbrydes under polymeriseringstrin13. Fluorescensproteiner baseret på bakteriofytokromer ødelægges også i vid udstrækning13. Men de fleste GFP-lignende proteiner vil blive bevaret13. Derudover kan streptavidin også anvendes præ-ekspansion, mærkning post-translationelle ændringer såsom S-nitrolysation via et lille molekyle tag13.
Phalloidin, et lille mærkningsmolekyle til at målrette actin cytoskeleton, er ikke kompatibelt med ExM21. For at overvinde utilstrækkelig forankring af falloidin er der indført trivalent forankring (TRITON)21. Denne fremgangsmåde tilbyder samtidig målretning, mærkning og podning af biomolekyler21.
Denne metode kan ændres til farvning af RNA-molekyler (ExFish)22. I iterativ ekspansion mikroskopi (iExM) eller X10 mikroskopi, opløsningen på 60-70 nm kan udvides til ca 25 nm ved at anvende en anden svulmelig gel inden for den første udvidede hydrogel eller gennemføre en enkelt udvidelse trin ved hjælp af en anden hydrogel15,16. Ultrastrukturudvidelsesmikroskopi (U-ExM) muliggør superopløsning af proteiner, der bevarer deres tilskrivning til et ultrastrukturelt element (f.eks. mitokondrier, mikrotubuli)23. En kombination af ExFish (RNA og DNA) og proExM metoder er tidligere blevet udført samt22,24. Den præsenterede protokol bruger transfected cos7 celler som en model til at undersøge slids membran proteiner. Vi forventer, at andre bosiddende dyrkede nyreceller, f.eks. HEK293T-celler, kan bruges på samme måde til denne protokol. Afhængigt af cellelinjen kan det være nødvendigt at justere de forskellige dyrknings- og transinfektionsforhold.
ExM forbedrer opløsningen af immunfarvede prøver med ca. 4 gange og når en lateral rumlig opløsning på 70 nm13. Sammenlignet med andre superopløsningsteknikker udføres ExM på et konventionelt fluorescensmikroskop13,14. Derfor er intet dyrt udstyr eller specifikt uddannet personale nødvendigt for at udføre ExM-metoden14. Selvom ikke alle fluorophorer er kompatible med ExM, er der generelt mange tilgængelige antistoffer med optimerede fluorophorer med foto-fysiske egenskaber, der er nødvendige for superopløsningsmikroskopi14. Den største ulempe ved denne metode er, at ExM er uforenelig med levende prøver12,14.
I fremtiden kan en forbedring af hydrogelens kemiske sammensætning føre til endnu højere rumlig opløsning12. Kombinationen af forskellige protokoller kan også muliggøre visualisering af proteiner, RNA, DNA eller lipider i komplekser i samme prøve med så høj opløsning12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Blanka Duvnjak og Nikola Kuhr for deres fremragende tekniske bistand.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylamide >99% | Sigma-Aldrich | A3553-100G | |
| 6-((Acryloyl)amino)hexanoic acid, succinimidyl ester, Acryloyl-X, SE | invitrogen | A-20770 | store up to 4 months |
| APS | Sigma-Aldrich | A3678-25G | |
| Deckgläser (cover glasses) | Engelbrecht | K12432 | 24x32mm #1.0 |
| Diamont cutter | VWR | 201-0392 | for cutting the cover slips |
| Guanidine HCl | Sigma-Aldrich | G3272-100G | 8M Stock can be kept at RT |
| Marten hair paintbrush | Leon Hardy | 3 (770) | |
| "Menzel" Deckgläser (cover glasses) | Thermo Fischer | 15654786 | 24x24mm #1.5 |
| N,N`-Methylenbisacrylamide | Sigma-Aldrich | M7256-25G | |
| Objektträger UniMark | Marienfeld | 703010 | |
| Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | |
| Sodium Acrylate | Sigma-Aldrich | 408220 | check purity |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Staining chamber | produced at the university's workshop | ||
| TEMED | ROTH | 2367.1 | |
| 6-Well glass bottom plates | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Antibodies | |||
| Actin-ExM 546 | chrometra | non-available | 1:40 |
| Anti Podocin produced in rabbit | Sigma | P-0372-200UL | 1:200 |
| Donkey anti guinea-pig CF633 | Sigma | SAB4600129-50UL | 1:200 |
| Goat anti rabbit 488 | Life Technologies | A11034 | 1:1000 |
| Guinea pig anti nephrin | Origene | BP5030 | 1:100 |
| Software | |||
| FIJI | |||
| Visiview | |||
| microscope | |||
| AXIO Observer Z1 | Zeiss | non-available |
References
- Matsushita, K., et al. Association of estimated glomerular filtration rate and albuminuria with all-cause and cardiovascular mortality in general population cohorts: a collaborative meta-analysis. Lancet. 375 (9731), 2073-2081 (2010).
- Faul, C., Asanuma, K., Yanagida-Asanuma, E., Kim, K., Mundel, P. Actin up: regulation of podocyte structure and function by components of the actin cytoskeleton. Trends in Cell Biology. 17 (9), 428-437 (2007).
- Saleem, M. A., et al. Co-localization of nephrin, podocin, and the actin cytoskeleton - Evidence for a role in podocyte foot process formation. American Journal of Pathology. 161 (4), 1459-1466 (2002).
- Kestila, M., et al. Positionally cloned gene for a novel glomerular protein - nephrin - is mutated in congenital nephrotic syndrome. Molecular Cell. 1 (4), 575-582 (1998).
- Huber, T. B., et al. Podocin-mediated recruitment of nephrin into lipid rafts is required for efficient nephrin signaling. Journal of the American Society of Nephrology. 14, 8 (2003).
- Boute, N., et al. NPHS2, encoding the glomerular protein podocin, is mutated in autosomal recessive steroid-resistant nephrotic syndrome. Nature Genetics. 24 (4), 349-354 (2000).
- Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. Super-resolution microscopy at a glance. Journal of Cell Science. 124 (10), 1607-1611 (2011).
- Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440 (7086), 935-939 (2006).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Testa, I., et al. Multicolor fluorescence nanoscopy in fixed and living cells by exciting conventional fluorophores with a single wavelength. Biophysical Journal. 99 (8), 2686-2694 (2010).
- Wassie, A. T., Zhao, Y., Boyden, E. S. Expansion microscopy: principles and uses in biological research. Nature Methods. 16 (1), 33-41 (2019).
- Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).
- Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy. Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).
- Truckenbrodt, S., et al. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. Embo Reports. 19 (9), (2018).
- Chang, J. B., et al.
- Chozinski, T. J., et al. nanoscale optical imaging of mouse and human kidney via expansion microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 10396 (2018).
- Richter, K. N., et al. Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy. The EMBO Journal. 37 (1), 139-159 (2018).
- Rinschen, M. M., et al. Quantitative deep mapping of the cultured podocyte proteome uncovers shifts in proteostatic mechanisms during differentiation. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 311 (3), 404-417 (2016).
- Asano, S. M., et al. Expansion microscopy: protocols for imaging proteins and RNA in cells and tissues. Current Protocols in Cell Biology. 80 (1), 56 (2018).
- Wen, G., et al. Evaluation of direct grafting strategies via trivalent anchoring for enabling lipid membrane and cytoskeleton staining in expansion microscopy. ACS Nano. 14 (7), 7860-7867 (2020).
- Chen, F., et al. Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy. Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).
- Gambarotto, D., et al. Imaging cellular ultrastructures using expansion microscopy (U-ExM). Nature Methods. 16 (1), 71-74 (2019).
- Zhao, Y., et al. Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy. Nature Biotechnology. 35 (8), 757-764 (2017).
