Summary
Baroreflex er en hjertefrekvensreguleringsmekanisme av det autonome nervesystemet som respons på blodtrykksendringer. Vi beskriver en kirurgisk teknikk for å implantere telemetritransmittere for kontinuerlig og samtidig måling av elektrokardiogram og blodtrykk hos mus. Dette kan bestemme spontan baroreflex-sensitivitet, en viktig prognostisk markør for hjerte- og karsykdom.
Abstract
Blodtrykk (BP) og hjertefrekvens (HR) styres begge av det autonome nervesystemet (ANS) og er tett sammenflettet på grunn av refleksmekanismer. Baroreflex er en viktig homeostatisk mekanisme for å motvirke akutte, kortsiktige endringer i arteriell BP og for å opprettholde BP i et relativt smalt fysiologisk område. BP registreres av baroreceptorer lokalisert i aortabuen og carotis sinus. Når BP endres, overføres signaler til sentralnervesystemet og kommuniseres deretter til de parasympatiske og sympatiske grenene i det autonome nervesystemet for å justere HR. En økning i BP forårsaker en refleksreduksjon i HR, en nedgang i BP forårsaker en refleksøkning i HR.
Baroreflex-følsomhet (BRS) er det kvantitative forholdet mellom endringer i arteriell BP og tilsvarende endringer i HR. Kardiovaskulære sykdommer er ofte forbundet med nedsatt baroreflexfunksjon. I ulike studier er redusert BRS rapportert ved f.eks. hjertesvikt, hjerteinfarkt eller koronarsykdom.
Bestemmelse av BRS krever informasjon fra både BP og HR, som kan registreres samtidig ved hjelp av telemetriske enheter. Den kirurgiske prosedyren beskrives som begynner med innsetting av trykksensoren i venstre halspulsåre og plassering av spissen i aortabuen for å overvåke arterielt trykk etterfulgt av subkutan plassering av senderen og EKG-elektrodene. Vi beskriver også postoperativ intensivbehandling og smertestillende behandling. Etter en to-ukers periode med gjenoppretting etter operasjonen, utføres langsiktige EKG- og BP-registreringer i bevisste og uhemmede mus. Til slutt inkluderer vi eksempler på høykvalitetsopptak og analyse av spontan baroreceptorfølsomhet ved hjelp av sekvensmetoden.
Introduction
Den arterielle baroreceptorrefleksen er det viktigste tilbakemeldingskontrollsystemet hos mennesker som gir en kortsiktig - og muligens også langsiktig 1,2 - kontroll av arterielt blodtrykk (ABP). Denne refleksen bufrer forstyrrelser i BP som oppstår som respons på fysiologiske eller miljømessige utløsere. Det gir raske refleksendringer i hjertefrekvens, slagvolum og total perifer arteriell motstand. Refleksen har sitt utspring i sensoriske nerveender i aortabuen og carotisbihulene. Disse nerveterminalene utgjør arterielle baroreceptorer. Somata av nerveterminaler i aortabuen ligger i nodose ganglion, mens de av nerveterminaler i carotis sinus ligger i petrosal ganglion. Refleksen utløses av økt blodtrykk, som strekker og aktiverer baroreceptornerveterminalene (figur 1A). Aktivering resulterer i aksjonspotensielle volleyer som overføres sentralt via afferente aortadepressor og carotis sinusnerver til kardiovaskulære hjernestammekjerner som nucleus tractus solitarii og den dorsale kjernen i vagalnerven. Endringer i afferente nerveaktivitet modulerer i sin tur den autonome efferente aktiviteten. Økt aktivitet av baroreceptornerver reduserer sympatisk og øker parasympatisk nerveaktivitet. Dermed er konsekvensene av aktivering av baroreceptorer en reduksjon i hjertefrekvens, hjerteutgang og vaskulær motstand som sammen motvirker og bufrer økningen i blodtrykk3. I motsetning til dette øker redusert aktivitet av baroreceptornerver sympatisk og reduserer parasympatisk nerveaktivitet, noe som øker hjertefrekvensen, hjerteutgangen og vaskulær motstand og dermed motvirker reduksjonen i blodtrykket.
Tallrike studier på mennesker og dyr har vist at baroreceptorrefleksen kan justeres under fysiologiske forhold som trening4, søvn5, varmestress6 eller graviditet7. I tillegg er det tegn på at baroreflex er kronisk svekket i kardiovaskulære sykdommer, som hypertensjon, hjertesvikt, hjerteinfarkt og hjerneslag. Faktisk brukes baroreflex dysfunksjon også som en prognostisk markør i flere kardiovaskulære sykdommer 8,9,10. Videre er dysfunksjon av baroreflex også tilstede i lidelser i ANS. Gitt betydningen av baroreceptorrefleksen for helse- og sykdomstilstander, er in vivo-estimering av denne refleksen en viktig komponent i autonom og kardiovaskulær forskning med visse alvorlige kliniske implikasjoner.
Genetiske muselinjer er viktige verktøy i kardiovaskulær forskning. In vivo studier av slike muselinjer gir verdifull innsikt i kardiovaskulær fysiologi og patofysiologi og fungerer i mange tilfeller som prekliniske modellsystemer for hjerte- og karsykdommer. Her gir vi en protokoll for telemetrisk in vivo EKG og BP-registrering i bevisste, uhemmede, fritt bevegelige mus og beskriver hvordan baroreflex-følsomhet kan bestemmes fra disse opptakene ved hjelp av sekvensmetoden (figur 1B). Den anvendte metoden kalles sekvensmetoden, fordi beat-to-beat-serien av systolisk BP (SBP) og RR-intervaller screenes for korte sekvenser på tre eller flere slag under spontan økning eller reduksjon i SBP med reflekstilpasning av HR. Denne metoden er gullstandarden for baroreflex følsomhetsbestemmelse siden bare spontane refleksmekanismer undersøkes. Teknikken er overlegen eldre teknikker som involverte invasive prosedyrer som injeksjon av vasoaktive legemidler for å indusere BP-endringer.
Figur 1: Skjematisk fremstilling av baroreflex og baroreflex sensitivitetsvurdering ved hjelp av sekvensmetoden . (A) Forløp av baroreflex under en akutt økning i blodtrykket. En kortsiktig økning i ABP registreres av baroreceptorer lokalisert i aortabuen og carotis sinus. Denne informasjonen overføres til sentralnervesystemet og induserer en reduksjon i sympatisk nerveaktivitet parallelt med en økning i parasympatisk aktivitet. Frigjøring av acetylkolin fra nerveender lokalisert i sinoatrialknuteregionen induserer en reduksjon av den andre budbringeren cAMP i pacemakerceller fra sinoatrialknute og dermed en reduksjon i hjertefrekvensen. En kortsiktig reduksjon i blodtrykket har motsatt effekt. (B) Skjematiske BP-spor under en opp-sekvens (øvre venstre panel) og nedsekvens (øvre høyre panel) av tre påfølgende slag. En opp-sekvens er assosiert med en parallell økning i RR-intervaller (nedre venstre panel) som tilsvarer en reduksjon i HR. En nedsekvens er assosiert med en parallell reduksjon i RR-intervaller (nedre høyre panel) som tilsvarer en økning i HR. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Protocol
Utføre alle dyreforsøk i samsvar med lokale institusjonelle retningslinjer og nasjonale lover om dyreforsøk. For dette eksperimentet ble studiene godkjent av Regierung von Oberbayern og var i samsvar med tyske lover om dyreforsøk. WT dyr (C57BL/6J bakgrunn) og dyr av en syk sinus syndrom musemodell som viser økt BRS sensitivitet (Hcn4tm3(Y527F; R669E; T670A)Biel)11 (blandet C57BL/6N og 129/SvJ bakgrunn) ble brukt i denne studien.
1. Oppsett av utstyr
- Fjern en telemetrisk sender fra den sterile pakken og forkort EKG-ledningene til lengden som passer for musens størrelse. For en 12 uker gammel mannlig svart seks mus (C57BL / 6J), som veier ~ 30 g, forkort den positive bly (rød) til en lengde på ~ 45 mm og den negative bly (fargeløs) til en lengde på ~ 40 mm ved hjelp av saks.
MERK: Disse verdiene er gitt som orientering og må tilpasses etter behov (figur 2). - Fjern ca. 6 mm av EKG-ledningens silikonslange ved hjelp av en skalpell for å eksponere ledningen. Dekk spissene på ledningen med overdreven slange, og la en ~ 2 mm del av EKG-ledningen være avdekket for å registrere elektriske signaler. Fest silikonslangen med ikke-absorberbart 5-0 silkesuturmateriale (figur 2A).
- Skriv ned senderens serienummer i driftsprotokollen (tilleggsfil 1).
- Hydratiser senderen i varm, steril 0,9 % NaCl-oppløsning.
- Vei musen og registrer vekten.
- Autoklav alle kirurgiske instrumenter før operasjonen. Steriliser dem under operasjonen og mellom drift av forskjellige dyr ved tørr varme ved hjelp av en varm glassperlesterilisator.
MERK: Kirurgiske instrumenter må kjøles ned til romtemperatur før bruk for å forhindre hudforbrenninger. - Desinfiser arbeidsbenken for å sikre aseptiske forhold.
2. Kirurgisk implantasjon av telemetriske transmittere for kombinert EKG og blodtrykksmålinger
- Disseksjon av venstre arteria carotis communis.
- Bedøv musen ved intraperitoneal injeksjon av anestesiblanding (100 mg/kg ketamin, 15 mg/kg xylazin, 1 mg/kg acepromazin). Utfør en tåklemmetest for å sikre at musen er fullt bedøvet før operasjonen påbegynnes.
- Bruk en trimmer til å barbere operasjonsområdet fra under haken mot de tverrgående brystmusklene.
- Plasser musen i ryggleie på en temperaturkontrollert operasjonsplate satt til 37 °C. Fest lemmer med kirurgisk tape og overvåk kroppstemperaturen kontinuerlig med et rektalt termometer (figur 2C). Hvis kroppstemperaturen faller under 37 °C, dekk dyrets kropp med sterilt bomullsgasbind under operasjonen.
- Påfør øyesalve for å beskytte dyrets øyne under anestesi.
- Påfør hårfjerningskrem på det tidligere barberte kirurgiske området. Fjern hår og hårfjerningskrem med en bomullspute og varmt vann etter 3-4 min. Pass på at huden er ren og fri for rester av hår og hårfjerningskrem, slik at såret ikke blir forurenset under operasjonen.
- Desinfiser huden med flere vekslende runder med povidon-jod eller klorhexidinskrubb etterfulgt av alkohol.
- Plasser dyret under et dissekerende mikroskop og plasser et sterilt drap rundt operasjonsområdet.
- Lag et 1-1,5 cm midtlinjesnitt gjennom nakkehuden, og start rett under haken. Gjør en innsats for å gjøre snittet så rett som mulig. (Figur 2D).
MERK: Under de følgende trinnene må operasjonsområdet holdes fuktig ved regelmessig påføring av steril, varm (37 °C) 0,9 % NaCl. - Lag et subkutant rom på begge sider av snittet ved å skille huden fra underliggende bindevev med butt disseksjonssaks. Vær forsiktig så du ikke klemmer huden for sterkt med tangen, da dette kan forårsake nekrose og føre til nedsatt sårheling etter operasjonen.
- Separat parotid og submandibulære kjertler ved hjelp av bomullsspissapplikatorer for å eksponere muskulaturen som ligger over luftrøret.
- Trekk venstre spyttkjertel tilbake med buet disseksjonstang, for å identifisere venstre halspulsåre som ligger lateralt til luftrøret (figur 2E).
- Forsiktig dissekere halspulsåren fra tilstøtende vev ved hjelp av buede tang. Vær veldig forsiktig så du ikke skader vagalnerven som løper langs fartøyet. Fortsett stump disseksjon for å eksponere venstre halspulsåre ca. 10 mm og skille den helt fra karfascie og nervus vagus (figur 2F).
- Pass en ikke-absorberbar, 5-0 silkesutur under den isolerte delen av halspulsåren mens du løfter blodkaret litt med buet tang for å redusere friksjonen mellom suturen og halspulsåren, da dette lett kan skade vaskulærveggen.
- Plasser suturen kranialt, like proximalt til bifurkasjonen av halspulsåren, danner en knute og binder den for å permanent ligere fartøyet (figur 2G). Fest begge ender av kranial okklusjon sutur til operasjonsbordet med kirurgisk tape.
- Før en andre okklusjonsutur under halspulsåren og plasser den kaudalt ved ~5 mm avstand til kranialsuturen (figur 2H). Det er nødvendig for midlertidig okklusjon av blodstrømmen under kanylering av arterien. Bind derfor en løs knute og fest begge suturendene med kirurgisk tape.
- Plasser en tredje sutur (sikker sutur) mellom kranial- og kaudal okklusjonsutur og lag en løs knute (figur 2I). Denne suturen er nødvendig for å holde kateteret på plass mens cannulating arterien. Teip den ene enden av suturen til operasjonsbordet.
- Kanylering av venstre arteria carotis communis.
MERK: Sensorområdet til blodtrykkskateteret er plassert 4 mm fra den distale enden og består av et rør som inneholder en ikke-komprimerbar væske og en biokompatibel gel (figur 2B). Siden dette området er svært følsomt, må du sørge for at det er fritt for luftbobler og ikke berøre det på noe tidspunkt under prosedyren.- Bøy spissen av en 24 G nål i en vinkel på ~100° for å bruke den som kateterintroduksjon.
- Trekk forsiktig den kaudale okklusjonsuturen og fest den med spenning for midlertidig å stoppe blodstrømmen og for å løfte arterien litt.
- Stikk forsiktig inn arterien proksimalt for kranial okklusjonsutur med den bøyde nålen (figur 2J). Ta tak i kateteret med kanyleringstang, før det inn i den lille punkteringen og la den gli sakte inn i karet. Trekk forsiktig tilbake den bøyde nålen samtidig (figur 2K).
- Når kateteret når den kaudale okklusjonsuturen strammes den sikre suturen litt for å holde kateteret på plass (figur 2L).
- Løsne den kaudale okklusjonsuturen slik at kateteret kan beveges ytterligere til spissen er plassert i aortabuen.
MERK: Sørg for å bestemme riktig innsettingslengde på kateteret, da dette avhenger av musens størrelse. For hannmus med C57BL/6J-bakgrunn ved 12 ukers alder og ~30 g kroppsvekt, anbefaler vi å sette inn kateteret til det integrerte hakket når den kraniale okklusjonsuturen. Korrekt innsettingsdybde og plassering av kateteret for den spesifikke muselinjen kan verifiseres etter avliving av dyret. - Når det er plassert riktig, fest kateteret med alle tre suturene og kutt endene så kort som mulig. Ikke trekk knutene for stramt, da dette kan skade det skjøre blodtrykkskateteret.
Figur 2 Implantasjon av kombinert EKG- og blodtrykkssender - kanylering av venstre halspulsåre. (A) Telemetritransmitteren består av et trykkkateter, to biopotensielle elektroder og enhetens kropp. (B) Skjematisk fremstilling av trykkkateteret. Sensorområdet består av en ikke-komprimerbar væske og en biokompatibel gel. Kateteret må settes inn i halspulsåren til hakket er på nivået av kranial okklusjon sutur for å sikre riktig posisjon i blodkaret. (C) Bedøvet C57BL/6J mus klargjort for kirurgisk transmitterimplantasjon. (VG Nett) Bildesekvens som viser kirurgisk inngrep ved kanylering av venstre halspulsåre. (D) Cervical hud snitt. (E) Eksponert luftrør for å identifisere venstre halspulsåre som ligger lateralt til luftrøret. (F) Stump disseksjon for å isolere arterien fra tilstøtende vev og vagusnerven. (G) Permanent ligering av venstre halspulsåre med kranial okklusjonsutur. (H) Spenning påført caudal okklusjonsutur for midlertidig å stoppe blodstrømmen. (I) Fest suturen for å holde kateteret på plass under kanylering. (J) Kanyle med buet spiss for innføring av kateteret i blodkaret. (K) Trykkkateter settes inn i halspulsåren. (L) Kateterspissen er plassert i aortabuen og kateteret festet med den midterste suturen. Skala bar i D - L viser 4 mm. Gjengitt fra16. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Plassering av telemetrienhetens hoveddel i en underhudslomme på musens venstre flanke (figur 3).
- Lag en subkutan tunnel fra nakken rettet mot dyrets venstre flanke og form en liten pose ved hjelp av en liten, butt dissekerende saks (figur 3B).
- Skyll tunnelen med en 1 ml sprøyte fylt med varm, steril 0,9 % NaCl-oppløsning og før ~300 mikrol av oppløsningen inn i posen (figur 3C).
- Løft huden forsiktig med butt tang og før senderens hoveddel inn i posen (figur 3D). Under dette trinnet, vær veldig forsiktig så du ikke trekker blodtrykkskateteret ut av halspulsåren.
- Plassering av EKG-ledningene i Einthoven II-konfigurasjon.
- Lag en tynn tunnel til høyre brystmuskel med stump dissekerende saks og plasser den negative (fargeløse) ledningen i tunnelen ved hjelp av stump tang. Fest den terminale enden av ledningen med et sting til brystmuskelen ved hjelp av 6-0 absorberbart suturmateriale (figur 3E).
- Lag en løkke i den positive (røde) ledningen, plasser spissen i venstre kaudale ribberegion og fest posisjonen med en sutur ved hjelp av 6-0 absorberbart suturmateriale.
MERK: Det er viktig at begge ledningene ligger flatt mot kroppen i hele lengden for å unngå vevsirritasjon (figur 3F). - Lukk huden med enkle knuter med 5-0 ikke-absorberbart suturmateriale (figur 3H). I tillegg må du påføre en liten mengde vevlim på hver knute for å hindre dyret i å bite suturen og forhindre dehiscens.
- Påfør povidon-jodhydrogel 10% på såret for å forhindre sårinfeksjon i gjenopprettingsfasen.
- For forebyggende smertelindring injiseres 5 mg/kg karprofen i 0,9 % NaCl subkutant mens musen fortsatt er i narkose.
- Sett en varmeplattform på 39 ± 1 °C og plasser musen i et eget bur. Plasser halvparten av buret på plattformen i 12 timer etter operasjonen og overfør musen i det varme området. Når dyret våkner fra anestesi, har det muligheten til å holde seg i det varme området eller flytte til den kjøligere delen av buret.
Figur 3: Implantasjon av kombinert EKG- og blodtrykkssender - subkutan plassering av EKG-elektroder og utstyrslegeme . (A) Mus etter innsetting av blodtrykkskateteret. Kateterposisjonen sikres av okklusjonsuturene. (B) Danner en subkutan lomme på dyrets venstre flanke med butt saks. (C) Posen vannes med ~300 μL varmt, sterilt saltvann. (D) Enhetens kropp er plassert i underhudslommen. (E) Den terminale enden av den negative elektroden (fargeløs) er festet til høyre brystmuskel med absorberbart suturmateriale. (F) Fiksering av den positive elektroden (rød) til venstre interkostalmuskulatur. (G) Plassering av en permanent sutur på brystmuskelen for å sikre posisjonen til EKG-elektrodene. (H) Mus etter lukking av huden. De subkutane posisjonene til EKG-elektrodespissene er indikert med røde sirkler. For demonstrasjonsformål ble et dødt dyr brukt til å ta disse bildene. Følg steril praksis mens du bruker et levende dyr. Gjengitt fra16. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
- Postoperativ behandling
- For postoperativ smertelindring injiser 5 mg/kg karprofen i 0,9% NaCl subkutant hver 12. time i 3-5 dager til såret har grodd.
- Injiser 10 μL/g varm ringerlaktatoppløsning intraperitonealt for å beskytte dyret mot dehydrering.
- La musen komme seg i 2-3 uker før du kjører de første telemetriske målingene. Overvåk nøye generelle helsemessige forhold, sårheling, kroppsvekt og mat- og vanninntak i gjenopprettingsperioden.
- På slutten av forsøket, avlive musen ved innånding av karbondioksid (CO2).
MERK: Cervical dislokasjon eller halshugging anbefales ikke som eutanasimetode siden dette kan skade deler av EKG- og BP-senderenheten.
- Innsamling av data.
- Ta forholdsregler for å unngå akustisk og elektronisk støy under dataregistrering. I tillegg begrense tilgangen til personell under dataregistrering og fullføre alle dyreholdsprosedyrer før forsøket.
- Plasser dyrets bur på telemetrimottakerplaten og slå på den telemetriske senderen ved å bringe en magnet nær dyret.
- Få kontinuerlig EKG, blodtrykk og aktivitetsregistreringer over 72 timer (12-timers mørk/lys syklus) med datainnsamlingsprogramvare (figur 4).
- Analyse av døgnrytmen til hjertefrekvens, blodtrykk og aktivitet.
- Kontroller tilstedeværelsen av en regelmessig døgnrytme av HR, BP og aktivitet ved hjelp av datainnsamlingsprogramvare12 (figur 5).
- Dataanalyse inkludert bestemmelse av baroreceptorfølsomhet ved hjelp av sekvensmetoden med EKG og BP analyseprogramvare.
- Eksporter BP- og HR-data fra datainnsamlingsprogramvare til EKG- og BP-analyseprogramvare (tilleggsfil 2). Bruk følgende sekvens med kommandoer: Åpne EKG- og BP-analyseprogramvare > Fil > Rådata fra omformer > Konverter ikke-IOX-rådata. I det nye vinduet klikker du på Fil > Last inn Dataquest ART4-data. Igjen åpnes et nytt vindu, velg datafil for eksport > Nytt vindu åpnes, velg dyr fra "emner" -listen og velg EKG og BP fra "bølgeformliste" og trykk OK. Velg dyr som data skal konverteres fra, ved å klikke Konverter data > Opprett IOX binær nettstedsfil.
- Åpne IOX-binærområdefilen i EKG- og BP-analyseprogramvare ved å bruke følgende kommandosekvens: Fil > Last inn IOX-data > Velg BP- og EKG-sporing > trykk på det grønne merket.
MERK: Følgende databehandlingsparametere er optimalisert for data innhentet fra villtypemus og skal i prinsippet passe til alle musemodeller som brukes i preklinisk felt. Imidlertid kan tilpasning av disse parametrene være nødvendig når du arbeider med spesifikke eksperimentelle modeller, for eksempel mus med ekstremt høye eller lave HR- og / eller BP-verdier, eller forskjellige gnagerarter. Under alle omstendigheter må databehandlingsparametere gjennomgås nøye for å sikre at de passer til den spesifikke modellen som studeres. - For innstillinger for EKG-, BP- og BRS-analyse, se tilleggsfil 3,4. For BRS-analyse hos mus, juster BRS-parametrene for å oppdage bare sekvenser av tre (eller flere) slag som viser en forsinkelse mellom SBP og RR på ett slag, og sett terskelen for SBP og RR-endring til 0,5 mmHg og 2 ms. Sørg for at korrelasjonskoeffisienten til helningen til regresjonslinjen fra RR/SBP-plott er større enn 0,75 og analyser bare seksjoner som viser stabil sinusrytme. Angi parametere for EKG-, BP- og BRS-analyse i henhold til dette ved å bruke følgende kommandosekvens: Still inn > analyseinnstillinger > nytt vindu åpnes
- EKG-innstillinger (høyreklikk i vinduet "EKG-modus og signalfiltrering" (tilleggsfil 3)). Angi parametrene som beskrevet her. Modus: EKG, kun RR, Filtermodus: auto, i henhold til innstilt HR, Forventet hjertefrekvens: bpm > 300, Baseline fjerning Filterbredde (ms): 100,00, Støyfjerning filterbredde: 1,00 ms, Hakkfilter: 50,0 Hz, Spike fjerning filter: av, Drop-out deteksjonsmodus: av, Maks RR lengder (ms): 900,00, RR fra justerte R topper: av, RR_only innstillinger modus: Xsmall: mus, R toppbredde (ms): 10,00, PR bredde (ms): 20,00, RT bredde (ms): 50,00, maks inter beat artefakt (%): 50,00, R til annet amplitudeforhold: 3,00, R topptegn: positiv, og Beregn ekstra parameter: av
- For blodtrykksinnstillingene (BP, Trykkinnstillinger) høyreklikker du i vinduet "BP-analysator" (tilleggsfil 4). Angi parametrene som beskrevet her. Filterbredde for støyfjerning (ms): 10,00, Avledet filterbredde (ms): 6,00, Hakkfilter: 50,0 Hz, Filter: av, Valideringsterskel (cal. enhet): 12,00, Terskel for avvisning (cal. enhet): 8,00, Derivat ved oppstart upstroke (cal U/s): 10,00, Avvisningsgrenser: av, Forsinkelse fra referanse EKG: brukerdefinert vindu, Min forsinkelse fra EKG Rpeak (ms): 10,00, Maks forsinkelse fra EKG Rpeak (ms): 250,00, Conduct_time_1 fra merke: ikke beregnet, Conduct_time_2 fra merke: ikke beregnet, BR (pustefrekvens): av, BRS (Baroreflex-følsomhet): på, Minste påfølgende taktnummer: 3, Latency taktnummer: 1, Trykkverdi: SBP, Merk for å beregne pulsintervall: R, Minste trykkvariasjon (caIU): 0,50, Minste intervallvariasjon (ms): 2,00, Minimumskorrelasjon: 0,75
- Skjerm aktivitetssignalet for en 3-timers sekvens med lav aktivitet. Utfør BRS-analysen i dette tidsvinduet siden høy aktivitet hos dyrene forstyrrer BP- og RR-korrelasjonen.
- Utfør en BP- og RR-analyse i løpet av dette 3-timers tidsvinduet mens du deler 3-timersanalysen inn i trinn på 10 minutter.
- Utfør BRS-analyse ved hjelp av følgende sekvens med kommandoer: Åpne BRS-analysevinduet > Vis > BRS-analyse. Dette åpner BRS-analysepanelet. Kontroller manuelt hver sekvens som vises i BRS-analysepanelet, og ekskluder ektopiske slag, bihulepauser, arytmiske hendelser eller støyende data. Sørg for å ugyldiggjøre hvert eneste slag av slike sekvenser for å kunne ekskludere dem fra analysen.
- Eksportere resultatene av BRS-analysen til en regnearkfil (resultatfil). Endre parameterne som eksporteres til regnearkfilen, ved å bruke følgende rekkefølge med kommandoer (tilleggsfiler 5-7):
- Still inn > parametere i liste / til fil > seksjoner > txt (tilleggsfil 5). Velg " beats" -delen og enhver annen seksjon som inneholder informasjon av interesse bortsett fra den ugyldige beats-delen.
- Still inn > parametere i liste / til fil > trinn > txt (tilleggsfil 6). Velg trinnverdier som skal eksporteres.
- Still inn > parametere i liste / til fil > slag -> txt (tilleggsfil 7).
- Forsikre deg om at beats-delen av filen inneholder minst følgende data for hvert enkelt slag. ECG_RR, ECG_HR, BP_SBP, BP_BRS_deltaP, BP_BRS_# (=påfølgende taktintervaller for sekvensen), BP_BRS_slope, BP_BRS_correl, BP_BRS_shiftl (=RR for påfølgende takt)
- Klikk deretter på Fil > Lagre resultatfil.
- Sorter de eksporterte dataene for opp- og nedsekvenser ved hjelp av filterfunksjonen i Excel (tilleggsfil 8). Beregn antall sekvenser, gjennomsnittlig BRS-helning, standardavvik og standardfeil for BRS-helning for opp og ned sekvenser separat. Beregn også den totale mengden sekvenser per 1000 slag.
MERK: En regnearkmal (TemplateBRS) for automatisert sortering og analyse av opp- og nedsekvenser finnes i tillegget (tilleggsfil 8) og forenkler analysen. Ved å justere filterfunksjonen kan du sortere sekvenser etter forskjellige taktnumre (f.eks. sekvenser med tre eller fire takter). For ytterligere detaljer, se Tilleggsfiler 9-13.- Åpne resultatfilen og TemplateBRS Excel-filen (tilleggsfil 8). Kopier dataene for følgende kolonner fra resultatfilen: (trykk)_BRS_deltaP, (trykk)_BRS_# og (trykk)_BRS_slope (tilleggsfil 9). Lim inn dataene i de respektive kolonnene i regnearkene "Opp-sekvenser" og "Nedsekvenser" i TemplateBRS-filen (tilleggsfil 10). I tillegg kopierer du dataene for kolonnen (trykk)_BRS_SBP fra resultatfilen (tilleggsfil 11) og limer den inn i regnearket "Alle sekvenser" i TemplateBRS-filen (tilleggsfil 12).
MERK: Tallet i kolonnen (Trykk)_BRS_# er bare oppført i siste takt i en sekvens og viser sekvenslengden. Opp- og nedsekvenser kan skilles fra hverandre med fortegnet for (trykk)_deltaP verdien. Negative verdier for andre og tredje takt i en sekvens med tre slag indikerer en nedsekvens. Positive verdier indikerer henholdsvis en opp-sekvens. - Filtrer de kopierte dataene med standard filterinnstillinger. Klikk på filterikonet i kolonnen (Trykk)_BRS_# og trykk "ok" (tilleggsfil 13). Bruk dette trinnet på regnearkene "Opp-sekvenser" og "Ned-sekvenser".
MERK: Regnearket filtrerer etter sekvenser med tre takter. Hvis du ber om andre sekvenslengder, må innstillingen for denne kolonnen endres i rullegardinmenyen. Beregninger for antall sekvenser, gjennomsnittlig BRS-stigningstall, standardavvik og standardfeil for BRS-helling vises i de grønne boksene i regnearkene "Opp-sekvenser" og "Nedsekvenser". Beregninger for totalt antall sekvenser per 1000 slag vises i den grønne boksen i regnearket "Alle sekvenser".
- Åpne resultatfilen og TemplateBRS Excel-filen (tilleggsfil 8). Kopier dataene for følgende kolonner fra resultatfilen: (trykk)_BRS_deltaP, (trykk)_BRS_# og (trykk)_BRS_slope (tilleggsfil 9). Lim inn dataene i de respektive kolonnene i regnearkene "Opp-sekvenser" og "Nedsekvenser" i TemplateBRS-filen (tilleggsfil 10). I tillegg kopierer du dataene for kolonnen (trykk)_BRS_SBP fra resultatfilen (tilleggsfil 11) og limer den inn i regnearket "Alle sekvenser" i TemplateBRS-filen (tilleggsfil 12).
Representative Results
Positivt resultat for EKG- og BP-rådata
Ved hjelp av denne protokollen kan høykvalitets EKG- og BP-data samles inn (figur 4 og tilleggsfil 14), noe som ikke bare muliggjør presis BRS-analyse, men også for analyse av et bredt spekter av EKG- eller BP-avledede parametere, f.eks. EKG-intervaller (figur 4B, øvre panel), blodtrykksparametere (figur 4B, nedre panel), hjertefrekvens og blodtrykksvariabilitet, arytmideteksjon etc12,13,14,15.
Figur 4: Telemetriske EKG- og BP-registreringer. (A) Representativt, høykvalitets EKG-spor (øvre panel) og tilsvarende høykvalitets rå BP-opptak (nedre panel). (B) Forstørrelse av EKG-spor (øvre panel). P-bølge, QRS-kompleks, T-bølge og RR-intervall er indikert. Forstørrelse av tilsvarende BP-data (nedre panel). Diastolisk BP (DBP) og systolisk BP (SBP) er indisert. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Positive resultater for døgnrytmen
En frisk mus som er tilstrekkelig restituert etter operasjonen, viser en fysiologisk økning i aktivitet, HR og BP i aktivitetsfasen (mørk) (figur 5). Mange forskjellige faktorer kan forstyrre denne vanlige døgnrytmen. Disse inkluderer psykologisk stress, akustisk eller elektrisk støy og smerte. For eksempel vil en akutt smertetilstand umiddelbart etter operasjonen resultere i en økning i hjertefrekvensen med samtidig reduksjon i aktivitet. Derfor er døgnrytmen en viktig indikator for dyrs helse og trivsel og bør rutinemessig kontrolleres før BRS-analyse.
Figur 5: Analyse av langsiktige telemetrimålinger for å bestemme døgnrytmevariasjoner. Døgnrytme av hjertefrekvens (A), aktivitet (B), systolisk blodtrykk (C) og diastolisk blodtrykk (D) var i gjennomsnitt fra 9 mannlige C57BL/6J-hannmus av villtype i løpet av 12 timers lyse og mørke sykluser. Grå områder skildrer aktivitetsfasen (mørk) og hvite områder skildrer hvilefasen til dyrene. Alle parametere er fysiologisk forhøyet under dyrets aktivitet (mørk) fase. Data er representert som gjennomsnitt +/- SEM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Positive resultater for BRS-analyse
Etter å ha utført analysen som beskrevet i protokollseksjon 2.8, vil programvaren oppdage henholdsvis opp- og nedsekvenser. Metoden som brukes kalles sekvensmetode siden endringer i SBP- og RR-intervaller undersøkes på beat-to-beat-basis under korte sekvenser på tre eller flere slag med spontan stigning eller fall i SBP (figur 6). En kontinuerlig økning i SBP over tre hjerteslag forårsaker en refleksøkning i parasympatisk aktivitet og bremser følgelig HR, noe som tilsvarer lengre RR-intervaller. Ventetiden for refleks HR-tilpasning er ett slag. En slik sekvens er vist i figur 6A og er definert som en opp-sekvens. I motsetning til dette er en kontinuerlig reduksjon i SBP over tre slag med parallell økning i HR (reduksjon i RR-intervall) definert som en nedsekvens (figur 6B). For å evaluere korrelasjonen mellom RR og SBP plottes begge parametrene mot hverandre, og stigningstallet (ms/mmHg) til den lineære regresjonslinjen beregnes for hver sekvens (figur 6A,B, nedre paneler). Etter sortering etter opp- og nedsekvenser kan gjennomsnittlig antall sekvenser per 1000 slag (figur 6C) og gjennomsnittlig gevinst av spontan BRS beregnes for henholdsvis opp- og nedsekvenser (figur 6D,E). Gevinsten av spontan BRS reflekteres av helningen til den lineære regresjonslinjen beregnet fra RR/SBP-relasjonen. Avviket fra normale BRS-verdier kan ha ulike årsaker. Disse inkluderer endringer i ANS-inngang eller endringer i responsen til sinoatrialknuten til autonom nervesysteminngang. I figur 6 er økt BRS i en musemodell for sykt sinussyndrom (SSS) med overdreven respons fra sinoatriell knutepunkt på vagal inngang vist11.
Figur 6: Estimering av BRS ved hjelp av sekvensmetoden. (A) Representativt BP-spor av en villtype C57BL/6J-mus under en oppsekvens på tre påfølgende slag (øvre panel) assosiert med en parallell økning i RR-intervall (midtpanel) som tilsvarer en reduksjon i HR. RR-intervallene ble plottet mot SBP (nedre panel). Helningen på regresjonslinjen (rød linje) for opp-sekvensen som er avbildet i øvre og midtre panel (WT, svarte sirkler) var 4,10 ms/mmHg. Et representativt RR/SBP-forhold mellom musemodellen for syk sinussyndrom ga en økt helning på 6,49 ms/mmHg, noe som indikerer forhøyet BRS (SSS, grå sirkler). (B) Representativ nedsekvens av en villtype mus med et fall i SBP (øvre panel) og en påfølgende reduksjon i RR-intervall (midtpanel) som resulterer i en BRS-helning på 4,51 ms / mmHg (nedre panel; WT, svarte sirkler). Et representativt RR/SBP-forhold mellom musemodellen for syk sinussyndrom (SSS, grå sirkler) med helning på 7,10 ms/mmHg. Orienteringen til de røde pilspissene indikerer retningen til sekvensene (opp eller ned sekvens). (C) Totalt antall sekvenser per 1000 slag for WT- og SSS-mus. (D) Gjennomsnittlig helning av RR/SBP-forholdet for opp-sekvenser for WT- og SSS-mus. (E) Gjennomsnittlig helning av RR/SBP-forholdet for nedsekvenser for WT- og SSS-mus. Statistikk i (C-E) ble utført fra resultater fra seks mannlige WT-dyr og åtte hanndyr fra musemodellen for syk sinussyndrom. Boksplott viser medianlinjen, perc 25/75 og min/maks-verdien. Åpne symboler representerer middelverdien. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Negativt resultat for rådatakvalitet
Spesielt i faser med høyere aktivitet kan signalkvaliteten reduseres (figur 7 og tilleggsfiler 15,16). Dette kan skyldes midlertidig forskyvning eller feil plassering av enten BP-kateteret eller EKG-ledningene eller begge deler på grunn av dyrets bevegelse. Skjelettmuskelaktivitet kan også påvises fra EKG-ledningene og indusere støy (figur 7B, øvre panel). Med programvareinnstillingene beskrevet ovenfor, oppdages ikke disse slåttene av lav kvalitet og er derfor ekskludert fra analyse. Likevel er manuell inspeksjon av de analyserte rådataene obligatorisk.
Figur 7: Eksempler på råsignaler av lav kvalitet. (A) EKG-signal (øvre panel) registreres med god kvalitet, men BP-signalkvaliteten (nedre panel) er lav. (B) Kvaliteter av EKG (øvre panel) og BP (nedre panel) signal er ikke tilstrekkelig. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Negative resultater for BRS-analyse
BRS-analyseinnstillingene som er oppført i protokollseksjon 2.8.3 er generelt avgjørende for rask og korrekt deteksjon av opp- og nedsekvenser. Minste korrelasjonskoeffisient for regresjonslinjen er satt til 0,75. Hvis du setter for lave verdier for minste korrelasjonskoeffisient, resulterer det i falske deteksjoner av sekvenser som ikke reflekterer baroreflexaktivitet, men heller skyldes arytmiske beats (figur 8). Ved BRS-analyse skal kun episoder med stabil sinusrytme analyseres. Ektopiske slag eller andre arytmiske hendelser, for eksempel sinuspauser, kan bli funnet med HRV-alternativet for EKG- og BP-analyseprogramvare og må ugyldiggjøres.
Figur 8: Sekvenser som ikke gjenspeiler baroreflexaktivitet . (A) EKG-spor av en mus med mild sinusarytmi. (B) BP-opptak som viser en spontan økning i SBP. (C) Tilsvarende RR-intervaller indikerer en reduksjon av HR ved økning av BP. (D) Plott av SBP og tilsvarende RR-intervaller. Den lave korrelasjonskoeffisienten til regresjonslinjen indikerer at HR-reduksjon ikke var forårsaket av aktivitet av baroreflex, men heller av sinusarytmi. (E) Rått EKG-spor som viser en sinuspause. (F) Tilsvarende rå BP-signal. Sinuspausen forårsaker et fall i diastolisk blodtrykk. Systolisk blodtrykk av den etterfølgende takten er nesten upåvirket. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfil 1: Protokoll for kirurgi. Mal for dokumentasjon av kirurgisk inngrep og postoperativ behandling. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 2: Konvertering av Dataquest ART-data til IOX-data for analyse i ecgAUTO-programvare. Velg dyr i emnelisten (venstre) og Trykk og EKG i bølgeformlisten (høyre). Trykk OK for å konvertere data. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 3: EKG-innstillinger for BRS-analyse. Angi parametere som oppført, trykk ok og bruk konfigurasjonen. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 4: BP-innstillinger for BRS-analyse. Angi parametere som oppført, trykk ok og bruk konfigurasjonen. Lagre konfigurasjonen som en konfigurasjonsfil for å kunne laste innstillingene enkelt. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 5: Parametere i liste/til-fil-vindu for "seksjoner". Velg seksjoner som skal eksporteres under seksjonene > txt header (valgt) og trykk Bruk!. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 6: Parametere i liste/til-filvindu for "trinn". Velg trinndata som skal eksporteres under trinnene > txt-overskrift (valgt) og trykk på Bruk!. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 7: Parametere i liste/til-fil-vindu for "beats". Velg verdier som skal eksporteres under beats > txt-overskriften (valgt) og trykk på Bruk!. For BRS-analyse er de kryssede parametrene nødvendige. Legg merke til rekkefølgen på valget angitt av tallene. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 8: TemplateBRS regnearkfil. Regnearkmal for automatisert sortering og analyse av opp- og nedsekvenser. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 9: Kopiering av relevante data fra resultatfilen I. Kopier kolonnene (trykk)_BRS_deltaP, (trykk)_BRS_# og (trykk)_BRS_slope fra resultatfilen. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 10: Regnearkmalfil (TemplateBRS) for datasortering og analyse I. Lim inn de kopierte dataene i de respektive kolonnene i regnearket "Opp-sekvenser" og "Nedsekvenser" i TemplateBRS-regnearkfilen. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 11: Kopiering av relevante data fra resultatfilen II. Kopier kolonnen (trykk)_BRS_SBP fra resultatfilen. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 12: En regnearkmalfil (TemplateBRS) for datasortering og analyse II. Lim inn de kopierte SBP-dataene i regnearket "Alle sekvenser" i TemplateBRS-regnearkfilen for å beregne totalt antall sekvenser. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 13: Filtrere og analysere sekvensene. I regnearket "Opp sekvenser" i TemplateBRS-regnearkfilen åpner du rullegardinmenyen til kolonnefilteret (Trykk)_BRS_# og trykker OK uten å endre noen parametere. Dette vil automatisk sortere dataene og oppdatere beregningene for sekvenser med 3 slag. Gjenta dette for regnearket "Nedsekvenser". Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 14: Skjermbilde av et opptak av høy kvalitet oppdaget med EKG- og BP-analyseprogramvare. Det øvre sporet (EKG) viser deteksjon av hver R-topp og det nedre sporet (BP) viser deteksjon av hvert diastolisk trykk (DP) og systolisk trykk (SP) topp. Områder under vellykket oppdagede topper er markert med rødt. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 15: Skjermbilde av BP-opptak med lav kvalitet der BP-parametere bare delvis registreres. Det øvre sporet (EKG) viser deteksjon av hver R-topp, men det nedre sporet (BP) viser gap mellom oppdagede BP-topper. Oppdagede topper av diastolisk trykk (DP) og systolisk trykk (SP) er merket med røde områder. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 16: Skjermbilde av et EKG- og BP-opptak av lav kvalitet der EKG- og BP-parametere ikke kunne oppdages. Det øvre sporet (EKG) viser et område (lilla bakgrunn) der EKG-parametere ikke kunne detekteres. BP-deteksjon (lavere spor) mislyktes også på grunn av lav signalkvalitet. Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Metodens betydning med hensyn til alternative metoder
I dette arbeidet presenterer vi en detaljert protokoll for å kvantifisere spontan BRS ved hjelp av sekvensmetoden. Denne tilnærmingen benytter spontane BP- og refleks-HR-endringer målt ved EKG- og BP-telemetri. Fordelen med denne metoden er at begge parametrene kan registreres i bevisste, fritt bevegelige, uhemmede dyr uten å forstyrre dyr ved å gå inn i rommet der målingene utføres eller til og med ved fysisk interaksjon som kreves for injeksjon av legemidler. Dette punktet er svært viktig siden det har blitt tydelig vist at slike forstyrrelser alvorlig forstyrrer HR- og BP-registreringer. For eksempel krever injeksjon av medisiner fiksering av musene, noe som gir en maksimal stressrespons som øker HR opp til 650-700 bpm. For å omgå disse stressresponsene har BRS tidligere blitt bestemt i bedøvede mus. Standard anestetika brukt i veterinærmedisin som ketamin/xylazin eller isofluran induserer imidlertid bradykardi og påvirker autonome refleksresponser, noe som begrenser validiteten av disse tilnærmingene og tolkningen av resultatene. For delvis å overvinne disse begrensningene ble implanterbare legemiddelleveringsenheter, dvs. osmotiske pumper, som kan frigjøre legemidler i bukhulen, brukt. Med osmotiske pumper er det imidlertid ikke mulig å påføre en bolus med en definert dose medikament som begrenser anvendelsen av slike enheter. Alternativt komplekse infusjonskatetre17 kan implanteres i mus for å administrere legemidler. Imidlertid er disse katetrene vanskelige å håndtere og krever kirurgiske ferdigheter som er sammenlignbare med de som kreves for implantasjon av telemetriske enheter, samtidig som de produserer mindre vitenskapelig utfall sammenlignet med målinger av spontan BRS. Ved siden av de tekniske problemene knyttet til måling av BRS ved bruk av injeksjon av legemidler, er det noen begrensninger knyttet til legemiddelvirkningen i seg selv. Tradisjonelle tilnærminger for å bestemme BRS inkluderer bolusinjeksjoner av vasoaktive legemidler. Bolusinjeksjon av vasokonstriktorer (f.eks. fenylefrin) eller vasodilatorer (f.eks. natriumnitroprussid) har imidlertid blitt ansett som en overdreven og ikke-fysiologisk stimulans for refleks HR-tilpasning til endringer i BP18. Baroreceptorrefleksens spontane aktivitet kan også kvantifiseres ved hjelp av spektrale metoder. En av disse metodene vurderer BRS i frekvensdomenet ved beregning av forholdet mellom endringer i HR og endringer i blodtrykk i et bestemt frekvensbånd18,19. Andre spektralmetoder involverer bestemmelse av overføringsfunksjonen til BP og HR eller kvantifisering av sammenhengen mellom BP og HR20,21. Disse metodene krever også telemetrisk oppkjøp av spontane BP- og HR-parametere, og selv om de er hensiktsmessige for bestemmelse av spontan BRS, krever de intensive beregningsverktøy og er utfordrende å anvende. Videre lider alle spektrale metoder av begrensningen at ikke-stasjonære signaler utelukker anvendelsen av spektrale metoder. Spesielt kan spektrale topper indusert av respirasjonsrytmer reduseres hos mennesker ved å be pasienten om å slutte å puste, mens dette åpenbart ikke er mulig hos mus. Derfor er signal-støy-forholdet ofte ganske lavt hos mus. Gitt begrensningene i metodene diskutert ovenfor, favoriserer vi sekvensmetoden for å bestemme BRS hos mus. En betydelig fordel med denne metoden er at det er en ikke-invasiv teknikk som gir data om spontan BRS under virkelige forhold22. Et annet viktig poeng er at varigheten av sekvenser analysert ved hjelp av sekvensmetoden er ganske kort, og involverer 3-5 slag. Refleksregulering av HR av vagalnerven er veldig rask og godt innenfor tidsrammen for disse sekvensene. Derfor er sekvensmetoden godt egnet til å evaluere vagalnervens bidrag til BRS. Derimot er reguleringen av det sympatiske nervesystemet mye langsommere. Faktisk, i løpet av disse korte sekvensene kan aktiviteten til det sympatiske nervesystemet antas å være nesten konstant. Derfor er metoden tilpasset for selektivt å oppdage refleksendringer i HR drevet av vagusnerveaktivitet.
Tolkning av BRS-data
For tolkning av BRS-dysfunksjon eller BRS-data i seg selv er det viktig å vurdere de individuelle funksjonsnivåene som er involvert i baroreceptorrefleksen. På nevronnivå kan afferente, sentrale eller efferente komponenter i refleksen påvirkes23. På kardiovaskulært nivå kan redusert eller overdreven respons fra sinoatrialknuten på ANS-inngang være til stede11,24. En endring på hvert nivå kan føre til endringer i BRS. For å dissekere om nevronale og/eller hjertemekanismer er ansvarlige for observerte endringer i BRS, hjerte- eller nevronspesifikk gendelesjon, kan man bruke nedslags- eller genredigeringsmetoder.
Kritiske trinn i protokollen
Det mest sofistikerte og kritiske trinnet i denne protokollen er forberedelse og kanylering av venstre halspulsåre (trinn 2.3). Spenningen i den kaudale okklusjonsuturen må være tilstrekkelig høy til å stoppe blodstrømmen helt før kanylering. Ellers kan selv en liten lekkasje av blod under kanylering sterkt begrense synligheten eller til og med føre til at musen blør i hjel. Cannulation skal lykkes ved første forsøk. Men ved mislykket første forsøk er det fortsatt mulig å prøve kanylering forsiktig på nytt.
Midtlinjesnittet og den subkutane tunnelen fra halsen til venstre flanke (trinn 2.3) må være stor nok til at senderen enkelt kan settes inn uten kraft, men må også være så liten som mulig for å holde senderen på plass. Ellers må man låse den på plass med suturmateriale eller vevlim. Siden mus har en veldig delikat hud, kan nekrose av huden oppstå hvis tunnelen for senderen er for liten.
Hvis EKG-elektrodene er for lange til å passe inn i den subkutane tunnelen (trinn 2.4), er det nødvendig å danne en ny spiss ved å forkorte elektroden til riktig lengde. Elektroden må ligge flatt mot kroppen over hele ledningens lengde. For lenge vil elektroder forstyrre dyrene, og de vil prøve å åpne såret for å fjerne senderen, noe som resulterer i risiko for vevsirritasjon og sårdehiscens. Ledninger som er for korte kan selvfølgelig ikke forlenges, og det kan være at elektrodene i dette tilfellet ikke kan plasseres på en slik måte at de tilsvarer Einthoven II-konfigurasjonen. Vi anbefaler derfor å bestemme den optimale lengden på EKG-ledningene på en død mus av samme kjønn, vekt og genetisk bakgrunn.
Mus bør gis en lengre restitusjonstid etter transmitterimplantasjon hvis de ikke har en normal døgnrytme og dette ikke er fenotypen til muselinjen som studeres (trinn 2.7). En annen årsak til forstyrret døgnrytme kan være utilstrekkelig akustisk isolasjon av dyreavdelingen eller at personell kommer inn i rommet under målingen.
EKG-, BP- og BRS-dataanalyse er rett frem (trinn 2.8). Det mest kritiske trinnet er å ekskludere ektopiske beats, bihulepauser, arytmiske episoder eller seksjoner med signaler av lav kvalitet fra dataanalyse.
Disclosures
Ingen
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av den tyske forskningsstiftelsen [FE 1929/1-1 og WA 2597/3-1]. Vi takker Sandra Dirschl for utmerket teknisk assistanse og Julia Rilling for veterinærråd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acepromazine maleate (Tranquisol KH) Solution Injectable 0.5 mg/mL | CP-Pharma, Germany | 1229 | anesthesia |
| B.Braun Injekt-F 1 mL syringe | Wolfram Droh GmbH, Germany | 9166017V | |
| Bepanthen eye and nose ointment | Bayer AG, Germany | ||
| Blunt dissecting scissors | Fine Science Tools GmbH, Germany | 14078-10 | |
| Carprofen (Carprosol) 50 mg/mL | CP-Pharma, Germany | 115 | preemptive and post-operative pain relief |
| Cutasept F skin desinfectant | BODE Chemie GmbH, Germany | 9803650 | |
| Cotton Tipped Applicator sterile | Paul Boettger GmbH & Co. KG, Germany | 09-119-9100 | |
| Forceps - Micro-Blunted Tips | Fine Science Tools GmbH, Germany | 11253-25 | |
| Forceps - straight | Fine Science Tools GmbH, Germany | 11008-13 | |
| Gauze swabs with cut edges, 7.5x7.5 cm, cotton | Paul Hartmann AG. Germany | 401723 | |
| HD?X11, Combined telemetric ECG and BP transmitters | Data Sciences International, United States | ||
| Homothermic blanket system with flexible probe | Harvard Apparatus, United States | ||
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools GmbH, Germany | 18000-45 | |
| Ketamine 10% | Ecuphar GmbH, Germany | 799-760 | anesthesia |
| Magnet | Data Sciences International, United States | transmitter turn on/off | |
| Needle holder, Olsen-Hegar with suture cutter | Fine Science Tools GmbH, Germany | 12502-12 | |
| Needle single use No. 17, 0.55 x 25 mm | Henke-Sass Wolf GmbH, Germany | 4710005525 | 24 G needle |
| Needle single use No. 20, 0.40 x 20 mm | Henke-Sass Wolf GmbH, Germany | 4710004020 | 27 G needle |
| Needle-suture combination, sterile, absorbable (6-0 USP, metric 0.7, braided) | Resorba Medical, Germany | PA10273 | lead fixation |
| Needle-suture combination, sterile, silk (5-0 USP, metric 1.5, braided) | Resorba Medical, Germany | 4023 | skin closure |
| OPMI 1FR pro, Dissecting microscope | Zeiss, Germany | ||
| Pilca depilatory mousse | Werner Schmidt Pharma GmbH, Germany | 6943151 | |
| PVP-Iodine hydrogel 10% | Ratiopharm, Germany | ||
| Ringer's lactate solution | B. Braun Melsungen AG, Germany | 401-951 | |
| Sensitive plasters, Leukosilk | BSN medical GmbH, Germany | 102100 | surgical tape |
| Sodium chloride solution 0.9% sterile Miniplasco Connect 5 ml | B. Braun Melsungen AG, Germany | ||
| Surgibond tissue adhesive | SMI, Belgium | ZG2 | |
| Suture, sterile, silk, non-needled (5-0 USP, metric 1 braided) | Resorba Medical, Germany | G2105 | lead preparation, ligation sutures |
| Trimmer, Wella Contura type 3HSG1 | Procter & Gamble | ||
| Vessel Cannulation Forceps | Fine Science Tools GmbH, Germany | 18403-11 | |
| Xylazine (Xylariem) 2% | Ecuphar GmbH, Germany | 797469 | anesthesia |
| Data acquisition and analysis | Source | ||
| DSI Data Exchange Matrix | Data Sciences International, United States | ||
| DSI Dataquest ART 4.33 | Data Sciences International, United States | data aquisition software | |
| DSI Ponemah | Data Sciences International, United States | data aquisition software | |
| DSI PhysioTel HDX-11 for mice | Data Sciences International, United States | ||
| DSI PhysioTel receivers RPC1 | Data Sciences International, United States | ||
| ecgAUTO v3.3.5.11 | EMKA Technologies | ECG and BP analysis software | |
| Microsoft Excel | Microsoft Corporation, United States |
References
- Landgren, S. On the excitation mechanism of the carotid baroceptors. Acta Physiologica Scandinavica. 26 (1), 1-34 (1952).
- Heyman, C., Neil, E.
- Lu, Y., et al. The ion channel ASIC2 is required for baroreceptor and autonomic control of the circulation. Neuron. 64 (6), 885-897 (2009).
- Fadel, P. J., Raven, P. B. Human investigations into the arterial and cardiopulmonary baroreflexes during exercise. Experimental Physiology. 97 (1), 39-50 (2012).
- Nagura, S., Sakagami, T., Kakiichi, A., Yoshimoto, M., Miki, K. Acute shifts in baroreflex control of renal sympathetic nerve activity induced by REM sleep and grooming in rats. The Journal of Physiology. 558, Pt 3 975-983 (2004).
- Crandall, C. G., Cui, J., Wilson, T. E. Effects of heat stress on baroreflex function in humans. Acta Physiologica Scandinavica. 177 (3), 321-328 (2003).
- Crandall, M. E., Heesch, C. M. Baroreflex control of sympathetic outflow in pregnant rats: effects of captopril. The American Journal of Physiology. 258 (6), Pt 2 1417-1423 (1990).
- Mortara, A., et al. Arterial baroreflex modulation of heart rate in chronic heart failure: clinical and hemodynamic correlates and prognostic implications. Circulation. 96 (10), 3450-3458 (1997).
- La Rovere, M. T., Bigger, J. T., Marcus, F. I., Mortara, A., Schwartz, P. J. Baroreflex sensitivity and heart-rate variability in prediction of total cardiac mortality after myocardial infarction. ATRAMI (Autonomic Tone and Reflexes After Myocardial Infarction) Investigators. Lancet. 351 (9101), 478-484 (1998).
- Robinson, T. G., Dawson, S. L., Eames, P. J., Panerai, R. B., Potter, J. F. Cardiac baroreceptor sensitivity predicts long-term outcome after acute ischemic stroke. Stroke. 34 (3), 705-712 (2003).
- Fenske, S., et al. cAMP-dependent regulation of HCN4 controls the tonic entrainment process in sinoatrial node pacemaker cells. Nature Communications. 11 (1), 5555 (2020).
- Fenske, S., et al. Comprehensive multilevel in vivo and in vitro analysis of heart rate fluctuations in mice by ECG telemetry and electrophysiology. Nature Protocols. 11 (1), 61-86 (2016).
- Thireau, J., Zhang, B. L., Poisson, D., Babuty, D. Heart rate variability in mice: a theoretical and practical guide. Experimental Physiology. 93 (1), 83-94 (2008).
- Cesarovic, N., Jirkof, P., Rettich, A., Arras, M. Implantation of radiotelemetry transmitters yielding data on ECG, heart rate, core body temperature and activity in free-moving laboratory Mice. Journal of Visualized Experiments. (57), e3260 (2011).
- Alam, M. A., Parks, C., Mancarella, S. long-term blood pressure measurement in freely moving mice using telemetry. Journal of Visualized Experiments. (111), e53991 (2016).
- Brox, V. Optical and electrophysiological approaches to examine the role of cAMP-dependent regulation of the sinoatrial pacemaker channel HCN4. Dissertation, LMU Munich. , Available from: https://edoc.ub.uni-muenchen.de/24431/1/Brox_Verena.pdf (2019).
- Just, A., Faulhaber, J., Ehmke, H. Autonomic cardiovascular control in conscious mice. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 279 (6), 2214-2221 (2000).
- Parati, G., Di Rienzo, M., Mancia, G. How to measure baroreflex sensitivity: from the cardiovascular laboratory to daily life. Journal of Hypertension. 18 (1), 7-19 (2000).
- Robbe, H. W., et al. Assessment of baroreceptor reflex sensitivity by means of spectral analysis. Hypertension. 10 (5), 538-543 (1987).
- Pinna, G. D., Maestri, R., Raczak, G., La Rovere, M. T. Measuring baroreflex sensitivity from the gain function between arterial pressure and heart period. Clinical Science. 103 (1), 81-88 (2002).
- Pinna, G. D., Maestri, R. New criteria for estimating baroreflex sensitivity using the transfer function method. Medical and Biological Engineering and Computing. 40 (1), 79-84 (2002).
- Laude, D., Baudrie, V., Elghozi, J. L. Applicability of recent methods used to estimate spontaneous baroreflex sensitivity to resting mice. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 294 (1), 142-150 (2008).
- Ma, X., Abboud, F. M., Chapleau, M. W. Analysis of afferent, central, and efferent components of the baroreceptor reflex in mice. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 283 (5), 1033-1040 (2002).
- Fleming, S., et al. Impaired Baroreflex Function in Mice Overexpressing Alpha-Synuclein. Frontiers in Neurology. 4 (103), (2013).
