Celfractionering van U937-cellen door isopycnic density gradient purification
Summary
Dit fractioneringsprotocol stelt onderzoekers in staat om cytoplasmatische, nucleaire, mitochondriale en membraaneiwitten uit zoogdiercellen te isoleren. De laatste twee subcellulaire fracties worden verder gezuiverd via isopycnic dichtheidsgradiënt.
Abstract
Dit protocol beschrijft een methode om subcellulaire eiwitfracties uit zoogdiercellen te verkrijgen met behulp van een combinatie van detergentia, mechanische lysis en isopycnic density gradient centrifugation. Het grote voordeel van deze procedure is dat het niet afhankelijk is van het enige gebruik van oplosbare reinigingsmiddelen om subcellulaire fracties te verkrijgen. Dit maakt het mogelijk om het plasmamembraan te scheiden van andere membraangebonden organellen van de cel. Deze procedure zal de bepaling van eiwitlokalisatie in cellen vergemakkelijken met een reproduceerbare, schaalbare en selectieve methode. Deze methode is met succes gebruikt om cytosolische, nucleaire, mitochondriale en plasmamembraaneiwitten te isoleren uit de menselijke monocytencellijn, U937. Hoewel geoptimaliseerd voor deze cellijn, kan deze procedure dienen als een geschikt startpunt voor de subcellulaire fractionering van andere cellijnen. Mogelijke valkuilen van de procedure en hoe ze te vermijden worden besproken, evenals veranderingen die mogelijk moeten worden overwogen voor andere cellijnen.
Introduction
Subcellulaire fractionering is een procedure waarbij cellen worden gelyseerd en gescheiden in hun samenstellende componenten door middel van verschillende methoden. Deze techniek kan door onderzoekers worden gebruikt om eiwitlokalisatie in zoogdiercellen te bepalen of voor verrijking van eiwitten met een lage abundantie die anders niet detecteerbaar zouden zijn. Hoewel er momenteel methoden voor subcellulaire fractionering bestaan, net als commerciële kits die kunnen worden gekocht, lijden ze aan verschillende beperkingen die deze procedure probeert te overwinnen. De meeste celfractioneringsmethoden zijn uitsluitend op detergent gebaseerd 1,2, afhankelijk van het gebruik van buffers met toenemende hoeveelheden wasmiddel om verschillende cellulaire componenten op te lossen. Hoewel deze methode snel en handig is, resulteert het in onzuivere fracties. Deze zijn ontworpen om onderzoekers in staat te stellen gemakkelijk een of twee componenten van de cel te isoleren, maar zijn niet complex genoeg om meerdere subcellulaire fracties tegelijkertijd uit een monster te isoleren. Alleen vertrouwen op detergentia resulteert meestal in membraan-ingesloten organellen en het plasmamembraan worden willekeurig opgelost, waardoor scheiding van deze componenten moeilijk wordt. Een extra complicatie van het gebruik van deze kits is het onvermogen van onderzoekers om ze te wijzigen / optimaliseren voor specifieke toepassingen, omdat de meeste componenten gepatenteerde formuleringen zijn. Ten slotte kunnen deze kits onbetaalbaar zijn, met beperkingen in het aantal toepassingen waardoor ze minder dan ideaal zijn voor grotere monsters.
Ondanks de beschikbaarheid van kits voor de isolatie van mitochondriën die niet afhankelijk zijn van detergentia, zijn ze niet ontworpen om het plasmamembraan te isoleren en leveren ze aanzienlijk lagere hoeveelheden monster op dan standaard isolatieprotocollen 3,4. Hoewel differentiële centrifugatiemethoden tijdrovender zijn, resulteren ze vaak in verschillende fracties die niet kunnen worden verkregen met uitsluitend op detergenten gebaseerde kits1. Scheiding zonder het enige gebruik van oplosbare reinigingsmiddelen maakt ook verdere zuivering mogelijk met behulp van ultracentrifugatie en isolynische dichtheidsgradiënten, wat resulteert in minder kruisbesmetting. Dit fractioneringsprotocol demonstreert de isolatie van subcellulaire fracties uit U937-monocyten met behulp van een combinatie van op detergentie en hoge snelheid gebaseerde centrifugatiebenaderingen. Deze methode zal de isolatie van de nucleaire, cytoplasmatische, mitochondriale en plasmamembraancomponenten van een zoogdiercel vergemakkelijken met minimale besmetting tussen de fracties.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deze methode is een aangepaste versie van een eerder gepubliceerde benadering van subcellulaire fractionering zonder het gebruik van snelle centrifugatie11. Deze aangepaste methode vereist meer gespecialiseerde apparatuur om de beste resultaten te bereiken, maar is uitgebreider en consistent reproduceerbaar.
De ontwikkeling van het initiële protocol was noodzakelijk vanwege het onvermogen om mitochondriale en membraanmonsters te scheiden voor de analyse van eiwitlokali…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door NIH R15-HL135675-01 en NIH 2 R15-HL135675-02 aan T.J.L.
Materials
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | |
| Bullet Blender Tissue Homogenizer | Next Advance | 61-BB50-DX | |
| digitonin | Sigma | D141 | |
| end-over-end rotator | ThermoFisher | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | E9884 | |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | E3889 | |
| GAPDH (14C10) | Cell Signalling Technologies | 2118 | |
| HEPES | VWR | 97064-360 | |
| Hexylene glycol | Sigma | 68340 | |
| Igepal | Sigma | I7771 | Non-ionic, non-denaturing detergent |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| Mannitol | Sigma | M9647 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Na, K-ATPase a1 (D4Y7E) | Cell Signalling Technologies | 23565 | |
| Open-Top Polyclear Tubes, 16 x 52 mm | Seton Scientific | 7048 | |
| OptiPrep (Iodixanol) Density Gradient Medium | Sigma | D1556-250ML | |
| phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| Protease Inhibitor Cocktail, General Use | VWR | M221-1ML | |
| refrigerated centrifuge | ThermoFisher | ||
| S50-ST Swinging Bucket Rotor | Eppendorf | ||
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma | 436143 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | |
| sodium orthovanadate (SOV) | Sigma | 567540 | |
| sonicator | ThermoFisher | ||
| Sorvall MX120 Plus Micro-Ultracentrifuge | ThermoFisher | ||
| Stainless Steel Beads 3.2 mm | Next Advance | SSB32 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Tris-buffered Saline (TBS) | VWR | 97062-370 | |
| Tween 20 | non-ionic detergent in western blotting buffers | ||
| VDAC (D73D12) | Cell Signalling Technologies | 4661 |
Referências
- Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells. MethodsX. 2, 440-445 (2015).
- Il Hwang, S., Han, D. K. Subcellular fractionation for identification of biomarkers: Serial detergent extraction by subcellular accessibility and solubility. Methods in Molecular Biology. 1002, 25-35 (2013).
- Clayton, D. A., Shadel, G. S. Isolation of mitochondria from cells and tissues. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (10), 1040-1041 (2014).
- Stimpson, S. E., Coorssen, J. R., Myers, S. J. Optimal isolation of mitochondria for proteomic analyses. Analytical Biochemistry. 475, 1-3 (2015).
- Sundström, C., Nilsson, K. Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937). International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).
- Hodge, T., Colombini, M. Regulation of metabolite flux through voltage-gating of VDAC channels. Journal of Membrane Biology. 157 (3), 271-279 (1997).
- Therien, A. G., Blostein, R. Mechanisms of sodium pump regulation. American journal of physiology. Cell physiology. 279 (3), 541-566 (2000).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of the America. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Barber, R. D., Harmer, D. W., Coleman, R. A., Clark, B. J. GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues. Physiological Genomics. 21 (3), 389-395 (2005).
- Bradbury, E. M., Cary, P. D., Crane-Robinson, C., Rattle, H. W. E. Conformations and interactions of histones and their role in chromosome structure. Annals of the New York Academy of Sciences. 222, 266-289 (1973).
- McCaig, W. D., Deragon, M. A., Haluska, R. J., Hodges, A. L., Patel, P. S., LaRocca, T. J. Cell fractionation of U937 cells in the absence of high-speed centrifugation. Journal of Visualized Experiments. (143), e59022 (2019).
- McCaig, W. D., et al. Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis. Cell Death Discovery. 4, 55 (2018).
