Fraccionamiento celular de células U937 por purificación de gradiente de densidad isopícnica
Summary
Este protocolo de fraccionamiento permitirá a los investigadores aislar proteínas citoplasmáticas, nucleares, mitocondriales y de membrana de células de mamíferos. Las dos últimas fracciones subcelulares se purifican aún más a través del gradiente de densidad isopícnica.
Abstract
Este protocolo describe un método para obtener fracciones de proteínas subcelulares de células de mamíferos utilizando una combinación de detergentes, lisis mecánica y centrifugación de gradiente de densidad isopícnica. La principal ventaja de este procedimiento es que no se basa únicamente en el uso de detergentes solubilizantes para obtener fracciones subcelulares. Esto hace posible separar la membrana plasmática de otros orgánulos unidos a la membrana de la célula. Este procedimiento facilitará la determinación de la localización de proteínas en las células con un método reproducible, escalable y selectivo. Este método se ha utilizado con éxito para aislar proteínas citosólicas, nucleares, mitocondriales y de membrana plasmática de la línea celular de monocitos humanos, U937. Aunque optimizado para esta línea celular, este procedimiento puede servir como un punto de partida adecuado para el fraccionamiento subcelular de otras líneas celulares. Se discuten las posibles dificultades del procedimiento y cómo evitarlas, al igual que las alteraciones que pueden necesitar ser consideradas para otras líneas celulares.
Introduction
El fraccionamiento subcelular es un procedimiento en el que las células se lisan y se separan en sus componentes constituyentes a través de varios métodos. Esta técnica puede ser utilizada por los investigadores para determinar la localización de proteínas en células de mamíferos o para el enriquecimiento de proteínas de baja abundancia que de otro modo serían indetectables. Si bien actualmente existen métodos para el fraccionamiento subcelular, al igual que los kits comerciales que se pueden comprar, sufren de varias limitaciones que este procedimiento intenta superar. La mayoría de los métodos de fraccionamiento celular son exclusivamente a base de detergente1,2, basándose en el uso de tampones que contienen cantidades crecientes de detergente para solubilizar diferentes componentes celulares. Si bien este método es rápido y conveniente, da como resultado fracciones impuras. Estos están diseñados para permitir a los investigadores aislar fácilmente uno o dos componentes de la célula, pero no son lo suficientemente complejos como para aislar múltiples fracciones subcelulares de una muestra al mismo tiempo. Depender únicamente de detergentes generalmente da como resultado orgánulos encerrados en la membrana y la membrana plasmática se solubiliza indiscriminadamente, lo que dificulta la separación de estos componentes. Una complicación adicional del uso de estos kits es la incapacidad de los investigadores para alterarlos / optimizarlos para aplicaciones específicas, ya que la mayoría de los componentes son formulaciones patentadas. Finalmente, estos kits pueden ser prohibitivamente caros, con limitaciones en el número de usos que los hacen menos que ideales para muestras más grandes.
A pesar de la disponibilidad de kits para el aislamiento de mitocondrias que no dependen de detergentes, no están diseñados para aislar la membrana plasmática y producir cantidades significativamente menores de muestra que los protocolos de aislamiento estándar 3,4. Si bien los métodos de centrifugación diferencial requieren más tiempo, a menudo dan lugar a distintas fracciones que no se pueden obtener con kits exclusivamente a base de detergente1. La separación sin el uso exclusivo de detergentes solubilizantes también permite una purificación adicional mediante ultracentrifugación y gradientes de densidad isopícnica, lo que resulta en una menor contaminación cruzada. Este protocolo de fraccionamiento demuestra el aislamiento de fracciones subcelulares de monocitos U937 utilizando una combinación de detergente y enfoques basados en centrifugación de alta velocidad. Este método facilitará el aislamiento de los componentes nucleares, citoplasmáticos, mitocondriales y de membrana plasmática de una célula de mamífero con una contaminación mínima entre las fracciones.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este método es una versión modificada de un enfoque previamente publicado para el fraccionamiento subcelular sin el uso de centrifugación de alta velocidad11. Este método modificado requiere un equipo más especializado para lograr los mejores resultados, pero es más completo y consistentemente reproducible.
El desarrollo del protocolo inicial fue necesario debido a la incapacidad de separar muestras mitocondriales y de membrana para el análisis de la localizació…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por NIH R15-HL135675-01 y NIH 2 R15-HL135675-02 a T.J.L.
Materials
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | |
| Bullet Blender Tissue Homogenizer | Next Advance | 61-BB50-DX | |
| digitonin | Sigma | D141 | |
| end-over-end rotator | ThermoFisher | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | E9884 | |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | E3889 | |
| GAPDH (14C10) | Cell Signalling Technologies | 2118 | |
| HEPES | VWR | 97064-360 | |
| Hexylene glycol | Sigma | 68340 | |
| Igepal | Sigma | I7771 | Non-ionic, non-denaturing detergent |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| Mannitol | Sigma | M9647 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| Na, K-ATPase a1 (D4Y7E) | Cell Signalling Technologies | 23565 | |
| Open-Top Polyclear Tubes, 16 x 52 mm | Seton Scientific | 7048 | |
| OptiPrep (Iodixanol) Density Gradient Medium | Sigma | D1556-250ML | |
| phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| Protease Inhibitor Cocktail, General Use | VWR | M221-1ML | |
| refrigerated centrifuge | ThermoFisher | ||
| S50-ST Swinging Bucket Rotor | Eppendorf | ||
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma | 436143 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | |
| sodium orthovanadate (SOV) | Sigma | 567540 | |
| sonicator | ThermoFisher | ||
| Sorvall MX120 Plus Micro-Ultracentrifuge | ThermoFisher | ||
| Stainless Steel Beads 3.2 mm | Next Advance | SSB32 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Tris-buffered Saline (TBS) | VWR | 97062-370 | |
| Tween 20 | non-ionic detergent in western blotting buffers | ||
| VDAC (D73D12) | Cell Signalling Technologies | 4661 |
Referências
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