Cellefraksjonering av U937-celler ved isopycnic tetthetsgradientrensing

Summary

Denne fraksjoneringsprotokollen vil tillate forskere å isolere cytoplasmatiske, kjernefysiske, mitokondrielle og membranproteiner fra pattedyrceller. De to sistnevnte subcellulære fraksjonene blir videre renset via isopycnic tetthetsgradient.

Abstract

Denne protokollen beskriver en metode for å oppnå subcellulære proteinfraksjoner fra pattedyrceller ved bruk av en kombinasjon av vaskemidler, mekanisk lysis og isopynisk tetthetsgradient sentrifugering. Den største fordelen med denne prosedyren er at den ikke er avhengig av eneste bruk av oppløsende vaskemidler for å oppnå subcellulære fraksjoner. Dette gjør det mulig å skille plasmamembranen fra andre membranbundne organeller i cellen. Denne prosedyren vil lette bestemmelsen av proteinlokalisering i celler med en reproduserbar, skalerbar og selektiv metode. Denne metoden har blitt brukt til å isolere cytosoliske, kjernefysiske, mitokondrielle og plasmamembranproteiner fra den humane monocytcellelinjen, U937. Selv om den er optimalisert for denne cellelinjen, kan denne prosedyren tjene som et passende utgangspunkt for subcellulær fraksjonering av andre cellelinjer. Potensielle fallgruver i prosedyren og hvordan du kan unngå dem diskuteres, og det samme er endringer som kanskje må vurderes for andre cellelinjer.

Introduction

Subcellulær fraksjonering er en prosedyre der celler lyses og separeres i deres bestanddeler gjennom flere metoder. Denne teknikken kan brukes av forskere til å bestemme proteinlokalisering i pattedyrceller eller for anrikning av proteiner med lav overflod som ellers ikke ville kunne oppdages. Mens metoder for subcellulær fraksjonering for tiden eksisterer, som kommersielle sett som kan kjøpes, lider de av flere begrensninger som denne prosedyren forsøker å overvinne. De fleste cellefraksjoneringsmetoder er utelukkende vaskemiddelbaserte^1,2, avhengig av bruk av buffere som inneholder økende mengder vaskemiddel for å oppløse forskjellige cellulære komponenter. Selv om denne metoden er rask og praktisk, resulterer den i urene fraksjoner. Disse er designet for å tillate forskere å enkelt isolere en eller to komponenter i cellen, men er ikke komplekse nok til å isolere flere subcellulære fraksjoner fra en prøve samtidig. Å stole utelukkende på vaskemidler resulterer vanligvis i membranlukkede organeller og plasmamembranen blir ukritisk oppløselig, noe som gjør separasjon av disse komponentene vanskelig. En ekstra komplikasjon ved bruk av disse settene er manglende evne til forskere å endre / optimalisere dem for spesifikke applikasjoner, da de fleste komponentene er proprietære formuleringer. Endelig kan disse settene være uoverkommelig dyre, med begrensninger i antall bruksområder som gjør dem mindre enn ideelle for større prøver.

Til tross for tilgjengeligheten av sett for isolering av mitokondrier som ikke er avhengige av vaskemidler, er de ikke designet for å isolere plasmamembranen og gi betydelig lavere mengder prøve enn standard isolasjonsprotokoller ^3,4. Mens differensielle sentrifugeringsmetoder er mer tidkrevende, resulterer de ofte i forskjellige fraksjoner som ikke kan oppnås med utelukkende vaskemiddelbaserte sett¹. Separasjon uten bruk av løselige vaskemidler tillater også ytterligere rensing ved bruk av ultracentrifugation og isopycnic tetthetsgradienter, noe som resulterer i mindre krysskontaminering. Denne fraksjoneringsprotokollen demonstrerer isoleringen av subcellulære fraksjoner fra U937-monocytter ved bruk av en kombinasjon av vaskemiddel- og høyhastighets sentrifugeringsbaserte tilnærminger. Denne metoden vil lette isoleringen av kjernefysiske, cytoplasmatiske, mitokondrielle og plasmamembrankomponenter i en pattedyrcelle med minimal forurensning mellom fraksjonene.

Protocol

1. Forbered buffere og reagenser Forbered friske løsninger av fosfatase og proteasehemmere.Tilsett 17,4 mg fenylmetansulfonylfluorid (PMSF)til 1 ml 100% etanol for å fremstille et lager på 100 mM.MERK: Bruk verneutstyr ved håndtering av PMSF, da det er farlig ved inntak eller innånding og ved kontakt med hud eller øyne. Det er etsende for øyne og hud. I henhold til produsentens instruksjoner, lag en kommersielt tilgjengelig proteasehemmercocktail (100x). Tilsett 91,9 mg …

Representative Results

Et skjematisk flytskjema for denne prosedyren (figur 1) oppsummerer visuelt trinnene som ble tatt for å fraksjonere U9375-celler dyrket i suspensjon. Fraksjoner samlet fra toppen av isopycnic tetthetsgradienten i like store mengder (1 ml) viser rensing av mitokondrielle og membranfraksjoner (figur 2). Ved bruk av et antistoff mot VDAC, et protein lokalisert til den ytre mitokondrielle membranen6, viser at mitokond…

Discussion

Denne metoden er en modifisert versjon av en tidligere publisert tilnærming til subcellulær fraksjonering uten bruk av høyhastighets sentrifugering¹¹. Denne modifiserte metoden krever mer spesialisert utstyr for å oppnå de beste resultatene, men er mer omfattende og konsekvent reproduserbar.

Utviklingen av den opprinnelige protokollen var nødvendig på grunn av manglende evne til å skille mitokondrielle og membranprøver for analyse av proteinlokalisering under n…

Materials

Benzonase Nuclease	Sigma-Aldrich	E1014
Bullet Blender Tissue Homogenizer	Next Advance	61-BB50-DX
digitonin	Sigma	D141
end-over-end rotator	ThermoFisher
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma	E9884
ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA)	Sigma	E3889
GAPDH (14C10)	Cell Signalling Technologies	2118
HEPES	VWR	97064-360
Hexylene glycol	Sigma	68340
Igepal	Sigma	I7771	Non-ionic, non-denaturing detergent
KCl	Sigma	P9333
Mannitol	Sigma	M9647
MgCl2	Sigma	M8266
NaCl	Sigma	S9888
Na, K-ATPase a1 (D4Y7E)	Cell Signalling Technologies	23565
Open-Top Polyclear Tubes, 16 x 52 mm	Seton Scientific	7048
OptiPrep (Iodixanol) Density Gradient Medium	Sigma	D1556-250ML
phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)	Sigma	P7626
Protease Inhibitor Cocktail, General Use	VWR	M221-1ML
refrigerated centrifuge	ThermoFisher
S50-ST Swinging Bucket Rotor	Eppendorf
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma	436143
Sodium deoxycholate	Sigma	D6750
sodium orthovanadate (SOV)	Sigma	567540
sonicator	ThermoFisher
Sorvall MX120 Plus Micro-Ultracentrifuge	ThermoFisher
Stainless Steel Beads 3.2 mm	Next Advance	SSB32
Sucrose	Sigma	S0389
Tris-buffered Saline (TBS)	VWR	97062-370
Tween 20			non-ionic detergent in western blotting buffers
VDAC (D73D12)	Cell Signalling Technologies	4661