Sarcomere Forkortelse av Pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter ved hjelp av fluorescerende taggede sarcomere-proteiner.
Summary
Denne metoden kan brukes til å undersøke sarkomerforkortelse ved hjelp av pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter med fluorescerende taggede sarcomere-proteiner.
Abstract
Pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter (PSC-CMs) kan produseres fra både embryonale og induserte pluripotente stammeceller (ES/iPS). Disse cellene gir lovende kilder til modellering av hjertesykdom. For kardiomyopatier er sarkomerforkortelse en av de standard fysiologiske vurderingene som brukes med voksne kardiomyocytter for å undersøke sykdommens fenotyper. De tilgjengelige metodene er imidlertid ikke hensiktsmessige for å vurdere kontraktiliteten til PSC-CMs, da disse cellene har underutviklede sarkomer som er usynlige under fasekontrastmikroskopi. For å løse dette problemet og for å utføre sarcomere forkortelse med PSC-CMs, ble fluorescerende merket sarcomere proteiner og fluorescerende levende bildebehandling brukt. Tynne Z-linjer og en M-linje ligger i begge ender og i midten av en sarcomere, henholdsvis. Z-line proteiner – α-Actinin (ACTN2), Telethonin (TCAP) og aktin-assosiert LIM-protein (PDLIM3) – og ett M-linjeprotein – Myomesin-2 (Myom2) – ble merket med fluorescerende proteiner. Disse taggede proteinene kan uttrykkes fra endogene alleler som knock-ins eller fra adeno-assosierte virus (AAVs). Her introduserer vi metodene for å skille mus og menneskelige pluripotente stamceller til kardiomyocytter, for å produsere AAVs, og for å utføre og analysere levende bildebehandling. Vi beskriver også metodene for å produsere polydimetylsiloksan (PDMS) frimerker for en mønstret kultur av PSC-CMs, noe som letter analysen av sarcomere forkortelse med fluorescerende merkede proteiner. For å vurdere sarkomerforkortelse ble tidsforløpbilder av de bankende cellene registrert med høy bildefrekvens (50-100 bilder per sekund) under elektrisk stimulering (0,5-1 Hz). For å analysere sarcomere lengde i løpet av cellekontraksjon, ble de innspilte tidsforløpbildene utsatt for SarcOptiM, en plugin-modul for ImageJ / Fiji. Vår strategi gir en enkel plattform for å undersøke hjertesykdom fenotyper i PSC-CMs.
Introduction
Kardiovaskulære sykdommer er den ledende årsaken til dødelighet over hele verden1 og kardiomyopati representerer den tredje årsaken til hjerterelaterte dødsfall2. Kardiomyopati er en kollektiv gruppe sykdommer som påvirker hjertemuskulaturen. Den nylige utviklingen av induserte pluripotente stamceller (iPS) og rettet differensiering av iPS-celler mot kardiomyocytter (PSC-CMs) har åpnet døren for å studere kardiomyocytter med pasientgenom som en in vitro-modell av kardiomyopati. Disse cellene kan brukes til å forstå patofysiologien til hjertesykdommer, for å belyse deres molekylære mekanismer, og for å teste forskjellige terapeutiske kandidater3. Det er en enorm mengde interesse, og dermed har pasientavledede iPS-celler blitt generert (f.eks. hypertrofisk kardiomyopati [HCM]4,5 ,arytmogenehøyre ventrikulær kardiomyopati [ARVC]6, utvidet kardiomyopati [DCM]7og mitokondrierelaterte kardiomyopatier8,9). Fordi en av egenskapene til kardiomyopati er dysfunksjon og forstyrrelse av sarkomer, er det nødvendig med et gyldig verktøy som jevnt måler sarkomerfunksjon.
Sarcomere forkortelse er den mest brukte teknikken for å vurdere sarcomere-funksjon og kontraktiliteten til voksne kardiomyocytter avledet fra dyremodeller og mennesker. For å utføre sarcomere forkortelse, er det nødvendig med velutviklede sarkomer som er synlige under fasekontrast. PSC-CMer dyrket imidlertid in vitro-skjerm underutviklede og uorganiserte sarkomer, og kan derfor ikke brukes til å måle sarkomere som forkorter10på riktig måte. Denne vanskeligheten med å vurdere kontraktiliteten til PSC-CMs på riktig måte hindrer bruken som en plattform for å vurdere hjertefunksjoner in vitro. For å vurdere PSC-CMs kontraktilitet indirekte, har atomkraftmikroskopi, mikropostmatriser, trekkraftmikroskopi og impedansmålinger blitt brukt til å måle effekten av bevegelsen som utøves av disse cellene på omgivelsene11,12,13. Mer sofistikerte og mindre invasive videomikroskopiopptak av faktisk cellulær bevegelse (f.eks. SI8000 fra SONY) kan brukes til å alternativt vurdere deres kontraktilitet, men denne metoden måler ikke direkte sarcomere bevegelse eller kraftgenerering kinetikk14.
For å måle sarcomere-bevegelse direkte i PSC-CMs, dukker det opp nye tilnærminger, for eksempel fluorescerende merking til sarcomere-protein. Lifeact brukes for eksempel til å merke filamentøs aktin (F-aktin) for å måle sarcomere bevegelse15,16. Genmodifiserte iPS-celler er et annet alternativ for merking av sarcomere-proteiner (f.eks. α-aktinin [ACTN2] og Myomesin-2 [MYOM2]) av fluorescerende protein17,18,19.
I dette dokumentet beskriver vi hvordan du utfører tidsforløpavbildning for måling av sarkomereforkortelse ved hjelp av Myom2-TagRFP (musembryonal stamme [ES] celler) og ACTN2-mCherry (humane iPS-celler). Vi viser også at en mønstret kultur legger til rette for sarkomere tilpasning. I tillegg beskriver vi en alternativ metode for sarcomere merking, ved hjelp av adeno-assosierte virus (AAVs), som kan brukes mye på pasientavledede iPS-celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
PSC-CMer har et stort potensial for å bli brukt som en in vitro-plattform for å modellere hjertesykdom og for å teste effekten av legemidler. Likevel må det først etableres en nøyaktig, enhetlig metode for å vurdere PSC-CMs-funksjoner. De fleste funksjonstester fungerer med PSC-CMs, for eksempel elektrofysiologi, kalsiumtransient og metabolisme26, og en av de første pasientavledede PSC-CM-studiene handlet om long-QT syndrom27. Imidlertid er kontraktilitet, …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gjerne anerkjenne alle laboratoriemedlemmene i Divisjonen for regenerativ medisin ved Jichi Medical University for nyttig diskusjon og teknisk assistanse. Denne studien ble støttet av tilskuddene fra Japan Agency for Medical Research and Development (AMED; JP18bm0704012 og JP20bm0804018), Japan Society for the Promotion of Science (JSPS; JP19KK0219), og Det japanske sirkulasjonsselskapet (Stipend for grunnforskning) til H.U.
Materials
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145-25 | |
| 2-Mercaptoethanol (55mM) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | |
| 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC) polymer, | NOF Corp. | LIPIDURE-CM5206 | |
| 2-Propanol | Fujifilm wako | 166-04836 | |
| 35-mm imaging dish with a polymer coverslip (µ-Dish 35 mm, high) | ibidi | 81156 | |
| AAVproR Helper Free System (AAV6) (vectors; pHelper, pRC6, pAAV-CMV-Vector) |
Takara | 6651 | |
| ACTN2-mCherry (AR12, AR21) hiPSCs | N.A. | We inserted IRES-puromycin resistant casette to 3' UTR of TNNT2 locus and mCherry around the stop codon of ACTN2 in 610B1 hiPSC line, following a method describe elsewhere (Anzai, Methods Mol Biol, in press) | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| B-27 Supplement, minus insulin | Thermo Fisher Scientific | A18956-01 | |
| B27 supplement (50X), minus Vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587-010 | |
| Benzonase (25 U/µL) | Merck Millipore | 70746 | |
| Blasticidin S Hydrochloride | Fujifilm wako | 029-18701 | |
| BMP-4, Human, Recombinant, | R&D Systems, Inc. | 314-BP-010 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4503-100g | |
| C59, Wnt Antagonist (WntC59) | abcam | ab142216 | |
| CAD drawing software, | Robert McNeel and Associates, WA, USA | Rhinoceros 6.0 | |
| Centrifugal ultrafiltration unit (100k MWCO), Vivaspin-20 | Sartorius | VS2042 | |
| CHIR99021 | Cayman | 13122 | |
| Chromium etchant | Nihon Kagaku Sangyo Co., Ltd., Japan | N14B | |
| Chromium mask coated with AZP1350 | Clean Surface Technology Co., Japan | CBL2506Bu-AZP | |
| Dr. GenTLE Precipitation Carrier (20mg/mL Glycogen, 3 M Sodium Acetate (pH 5.2)) | Takara | 9094 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) – high glucose | Sigma-Aldrich | D6429-500 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) – high glucose, without sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Ethanol (99.5) | Fujifilm wako | 057-00456 | |
| Fetal Bovine Serum | Moregate | 59301104 | |
| FGF-10, Human, Recombinant, | R&D Systems, Inc. | 345-FG-025 | |
| Fibroblast Growth Factor(basic), human, recombinant | Fujifilm wako | 060-04543 | |
| Gelatin from porcine skin powder | Sigma-Aldrich | G1890-100g | |
| Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM) | Sigma-Aldrich | G5154-500 | |
| GLASS BOTTOM culture plates | MatTek | P24G-1.5-13-F/H | |
| Ham’s F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11765-062 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Thermo Fisher Scientific | 12440-061 | |
| L-alanine-L-glutamine (GlutaMAX Supplement, 200mM) | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| L(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt | Fujifilm wako | 196-01252 | |
| Laminin-511 E8 fragment (LN511-E8, iMatrix-511) | Nippi | 892012 | |
| Mask aligner | Union Optical Co., Ltd., Japan | PEM-800 | |
| Maskless lithography tool | NanoSystem Solutions, Inc., Japan | D-Light DL-1000 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF (0.45-µm filter) | Merck Millipore | SLHVR33RS | |
| Myom2-RFP (SMM18) | N.A. | Developed in our previous paper (Chanthra, Sci Rep, 2020) | |
| N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| ORCA-Flash4.0 V3 digital CMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | |
| PD0325901 | Stemgent | 04-0006-10 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Petri dish | Sansei medical co. Ltd | 01-004 | |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1) | Nippon Gene | 311-90151 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer | Dow Corning Corp., MI, USA | SILPOT 184 | |
| polyethylenimine MAX (MW. 40,000) | Polyscience | 24765-1 | |
| Positive photoresist developer | Tokyo Ohka Kogyo Co., Ltd., Japan | NMD-3 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | |
| Proteinase K | Takara | 9034 | |
| Puromycin Dihydrochloride | Fujifilm wako | 166-23153 | |
| Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A Protein | R&D Systems, Inc. | 338-AC-050 | |
| Recombinant trypsin-like protease (rTrypsin; TrypLE express) | Thermo Fisher Scientific | 12604-039 | |
| RPMI1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875-119 | |
| Silicon wafer | Matsuzaki Seisakusyo Co., Ltd., Japan | N.A. | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
| Spin-coater | Mikasa Co., Ltd., Japan | MS-A100 | |
| Spininng confocal microscopy | Oxford Instruments | Andor Dragonfly Spinning Disk System | |
| StemSure LIF, Mouse, recombinant, Solution (10^6U) | Fujifilm wako | 195-16053 | |
| SU-8 3010 | Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA | SU-8 3010 | |
| SU-8 developer | Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA | SU-8 developer | |
| Tris-EDTA | Nippon Gene | 314-90021 | |
| Vascular Endothelial Growth Factor-A165(VEGF), Human, recombinant | Fujifilm wako | 226-01781 |
Referências
- Mensah, G. A., Roth, G. A., Fuster, V. The Global Burden of Cardiovascular Diseases and Risk Factors. Journal of the American College of Cardiology. 74 (20), 2529-2532 (2019).
- Wexler, R. K., Elton, T., Pleister, A., Feldman, D. Cardiomyopathy: an overview. American Family Physician. 79 (9), 778-784 (2009).
- Parrotta, E. I., Lucchino, V., Scaramuzzino, L., Scalise, S., Cuda, G. Modeling Cardiac Disease Mechanisms Using Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes: Progress, Promises and Challenges. International Journal of Molecular Sciences. , 30 (2020).
- Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).
- Lan, F., et al. Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).
- Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494 (7435), 105-110 (2013).
- Gramlich, M., et al. Antisense-mediated exon skipping: a therapeutic strategy for titin-based dilated cardiomyopathy. EMBO Molecular Medicine. 7 (5), 562-576 (2015).
- Wang, G., et al. Modeling the mitochondrial cardiomyopathy of Barth syndrome with induced pluripotent stem cell and heart-on-chip technologies. Nature Medicine. 20 (6), 616-623 (2014).
- Li, S., et al. Mitochondrial Dysfunctions Contribute to Hypertrophic Cardiomyopathy in Patient iPSC-Derived Cardiomyocytes with MT-RNR2 Mutation. Stem Cell Reports. 10 (3), 808-821 (2018).
- Cho, G. -. S., et al. Neonatal Transplantation Confers Maturation of PSC-Derived Cardiomyocytes Conducive to Modeling Cardiomyopathy. Cell Reports. 18 (2), 571-582 (2017).
- Yang, X., et al. Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 296-304 (2014).
- Ribeiro, A. J. S., et al. Multi-Imaging Method to Assay the Contractile Mechanical Output of Micropatterned Human iPSC-Derived Cardiac Myocytes. Circulation Research. 120 (10), 1572-1583 (2017).
- Sewanan, L. R., Campbell, S. G. Modelling sarcomeric cardiomyopathies with human cardiomyocytes derived from induced pluripotent stem cells. The Journal of Physiology. 598 (14), 2909-2922 (2020).
- Kopljar, I., et al. Chronic drug-induced effects on contractile motion properties and cardiac biomarkers in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. British Journal of Pharmacology. 174 (21), 3766-3779 (2017).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
- Ribeiro, A. J. S., et al. Contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (41), 12705-12710 (2015).
- Roberts, B., et al. Fluorescent Gene Tagging of Transcriptionally Silent Genes in hiPSCs. Stem Cell Reports. 12 (5), 1145-1158 (2019).
- Chanthra, N., et al. A Novel Fluorescent Reporter System Identifies Laminin-511/521 as Potent Regulators of Cardiomyocyte Maturation. Scientific Reports. 10 (1), 4249 (2020).
- Ribeiro, M. C., et al. A cardiomyocyte show of force: A fluorescent alpha-actinin reporter line sheds light on human cardiomyocyte contractility versus substrate stiffness. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 141, 54-64 (2020).
- Yamanaka, S., Zahanich, I., Wersto, R. P., Boheler, K. R. Enhanced Proliferation of Monolayer Cultures of Embryonic Stem (ES) Cell-Derived Cardiomyocytes Following Acute Loss of Retinoblastoma. PLoS ONE. 3 (12), 3896 (2008).
- Miyazaki, T., Isobe, T., Nakatsuji, N., Suemori, H. Efficient Adhesion Culture of Human Pluripotent Stem Cells Using Laminin Fragments in an Uncoated Manner. Scientific Reports. 7 (1), 41165 (2017).
- Prasad, K. -. M. R., Xu, Y., Yang, Z., Acton, S. T., French, B. A. Robust cardiomyocyte-specific gene expression following systemic injection of AAV: in vivo gene delivery follows a Poisson distribution. Gene Therapy. 18 (1), 43-52 (2011).
- Arakawa, H., et al. Protein evolution by hypermutation and selection in the B cell line DT40. Nucleic Acids Research. 36 (1), e1 (2007).
- Konno, A., Hirai, H. Efficient whole brain transduction by systemic infusion of minimally purified AAV-PHP.eB. Journal of Neuroscience Methods. 346, 108914 (2020).
- Anzai, T., et al., Yoshida, Y., et al. Generation of Efficient Knock-in Mouse and Human Pluripotent Stem Cells Using CRISPR-Cas9. Methods of Molecular Biology. , (2020).
- Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. A Brief Review of Current Maturation Methods for Human Induced Pluripotent Stem Cells-Derived Cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).
- Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).
- Flores, L. R., Keeling, M. C., Zhang, X., Sliogeryte, K., Gavara, N. Lifeact-GFP alters F-actin organization, cellular morphology and biophysical behaviour. Scientific Reports. 9 (1), 3241 (2019).
- Sparrow, A. J., et al. Measurement of Myofilament-Localized Calcium Dynamics in Adult Cardiomyocytes and the Effect of Hypertrophic Cardiomyopathy Mutations. Circulation Research. 124 (8), 1228-1239 (2019).
