Floresan Etiketli Sarkom Proteinleri kullanılarak Pluripotent Kök Hücre Türevli Kardiyomiyositlerin Sarkomer Kısaltılması.
Summary
Bu yöntem, floresan etiketli sarkomere proteinleri ile pluripotent kök hücre türevi kardiyomiyositler kullanarak sarkomere kısaltmasını incelemek için kullanılabilir.
Abstract
Pluripotent kök hücre türevli kardiyomiyositler (PSC-CM) hem embriyonik hem de indüklenmiş pluripotent kök (ES/iPS) hücrelerinden üretilebilir. Bu hücreler kardiyak hastalık modellemesi için umut verici kaynaklar sağlar. Kardiyomiyopatiler için sarkom kısaltma, yetişkin kardiyomiyositlerle hastalık fenotiplerini incelemek için kullanılan standart fizyolojik değerlendirmelerden biridir. Bununla birlikte, mevcut yöntemler PSC-CM’lerin sözleşmelliğini değerlendirmek için uygun değildir, çünkü bu hücreler faz kontrastlı mikroskopi altında görünmeyen az gelişmiş sarkomlara sahiptir. Bu sorunu gidermek ve PSC-CM’ler ile sarkom kısaltması yapmak için floresan etiketli sarkomere proteinleri ve floresan canlı görüntüleme kullanılmıştır. İnce Z hatları ve bir M-hattı sırasıyla her iki uçta ve bir sarkomun merkezinde yer almaktadır. Z-line proteinler — α-Actinin (ACTN2), Teletonin (TCAP) ve aksin ilişkili LIM proteini (PDLIM3) — ve bir M-line protein — Myomesin-2 (Myom2) — floresan proteinlerle etiketlendi. Bu etiketli proteinler endojen alellerden knock-in olarak veya adeno ilişkili virüslerden (AAV’ ler) ifade edilebilir. Burada fare ve insan pluripotent kök hücrelerini kardiyomiyositlere ayırt etme, AAV üretme, canlı görüntüleme yapma ve analiz etme yöntemlerini tanıtıyoruz. Ayrıca, floresan etiketli proteinlerle sarkom kısaltmasının analizini kolaylaştıran PSC-CM’lerin desenli kültürü için polidimetilsiloksan (PDMS) pulları üretme yöntemlerini de açıklıyoruz. Sarkom kısaltmasını değerlendirmek için, dayak hücrelerinin hızlandırılmış görüntüleri elektriksel uyarım (0,5-1 Hz) altında yüksek kare hızında (saniyede 50-100 kare) kaydedildi. Hücre kasılması boyunca sarkom uzunluğunu analiz etmek için, kaydedilen zaman atlamalı görüntüler ImageJ / Fiji için bir eklenti olan SarcOptiM’e tabi tutuldu. Stratejimiz, PSC-CM’lerdeki kardiyak hastalık fenotiplerini araştırmak için basit bir platform sağlar.
Introduction
Kardiyovasküler hastalıklar dünya çapında mortalitenin önde gelen nedenidir1 ve kardiyomiyopati kardiyak ilişkili ölümlerin üçüncü nedenini temsil eder2. Kardiyomiyopati, kalp kaslarını etkileyen toplu bir hastalık grubudur. İndüklenen pluripotent stem (iPS) hücrelerinin son gelişmeleri ve iPS hücrelerinin kardiyomiyositlere (PSC-CM) yönelik yönlendirilmiş farklılaşması, kardiyomiyopatinin in vitro modeli olarak hasta genomlu kardiyomiyositlerin incelenmesine kapı açmıştır. Bu hücreler kardiyak hastalıkların patofizyolojisini anlamak, moleküler mekanizmalarını ortaya çıkarmak ve farklı terapötik adayları test etmek için kullanılabilir3. Bu nedenle, hasta kaynaklı iPS hücreleri üretilmiştir (örneğin, hipertrofik kardiyomiyopati [HCM]4,5,aritmojenik sağ ventrikül kardiyomiyopatisi [ARVC]6, genişlemiş kardiyomiyopati [DCM]7ve mitokondriyal ilişkili kardiyomiyopatiler8,9). Kardiyomiyopatinin özelliklerinden biri sarkomların işlev bozukluğu ve bozulması olduğundan, sarkom fonksiyonunu düzgün bir şekilde ölçen geçerli bir araca ihtiyaç vardır.
Sarkom kısaltma, sarkom fonksiyonunu ve hayvan modellerinden ve insanlardan elde edilen yetişkin kardiyomiyositlerin sözleşmeliğini değerlendirmek için en yaygın kullanılan tekniktir. Sarkom kısaltması yapmak için faz kontrastı altında görülebilen iyi gelişmiş sarkomlar gereklidir. Bununla birlikte, PSC-CM’ler in vitro ekran az gelişmiş ve dağınık sarkomları kültüre eder ve bu nedenle, sarkom kısaltmasını düzgün bir şekilde ölçmek için kullanılamaz10. PSC-CM’lerin sözleşmelerinin sözleşmeye uygun şekilde değerlendirilmesindeki bu zorluk, kardiyak fonksiyonları in vitroolarak değerlendirmek için bir platform olarak kullanımlarını engeller. PSC-CM’lerin sözleşmelliğini dolaylı olarak değerlendirmek için atomik kuvvet mikroskopisi, mikro-post dizileri, çekiş kuvveti mikroskopisi ve empedans ölçümleri, bu hücrelerin uyguladıkları hareketin çevreleri üzerindeki etkilerini ölçmek için kullanılmıştır11,12,13. Gerçek hücresel hareketin daha sofistike ve daha az invaziv video-mikroskopi kayıtları (örneğin, SONY’den SI8000) sözleşmelerini alternatif olarak değerlendirmek için kullanılabilir, ancak bu yöntem doğrudan sarkom hareketini ölçmez veya üretimi zorlar kinetik14.
PSC-CM’lerde sarkomer hareketini doğrudan ölçmek için sarkom proteinine floresan etiketleme gibi yeni yaklaşımlar ortaya çıkıyor. Örneğin, Lifeact sarkom hareketi15,16ölçmek için filamentli aktinin (F-actin) etiketlemek için kullanılır. Genetiği değiştirilmiş iPS hücreleri, sarkom proteinlerini (örneğin, α-actinin [ACTN2] ve Myomesin-2 [MYOM2]) floresan protein17 , 18,19ile etiketlemek için başka bir seçenektir.
Bu yazıda Myom2-TagRFP (fare embriyonik sapı [ES] hücreleri) ve ACTN2-mCherry (insan iPS hücreleri) kullanılarak sarkom kısaltmasını ölçmek için zaman atlamalı görüntülemenin nasıl gerçekleştirildiğini açıklıyoruz. Ayrıca desenli bir kültürün sarkom hizalamasını kolaylaştırdığını gösteriyoruz. Ek olarak, hasta kaynaklı iPS hücrelerine yaygın olarak uygulanabilen adeno ilişkili virüsler (AAV’ ler) kullanarak sarkom etiketlemesinin alternatif bir yöntemini açıklıyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
PSC-CM’ler, kalp hastalıklarını modellemek ve ilaçların etkilerini test etmek için bir in vitro platform olarak kullanılma potansiyeline sahiptir. Bununla birlikte, PSC-CMs işlevlerini değerlendirmek için önce doğru, birleşik bir yöntem oluşturulmalıdır. Fonksiyonel testlerin çoğu PSC-CM’ler ile çalışır, örneğin elektrofizyoloji, kalsiyum geçici ve metabolizma26ve ilk hasta kaynaklı PSC-CM çalışmalarından biri long-QT sendromuhakkındaydı …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Jichi Tıp Üniversitesi Rejeneratif Tıp Bölümü’ndeki tüm laboratuvar üyelerini yararlı tartışma ve teknik yardım için kabul etmek istiyoruz. Bu çalışma Japonya Tıbbi Araştırma ve Geliştirme Ajansı’nın (AMED) hibeleri ile desteklenmiştir; JP18bm0704012 ve JP20bm0804018), Japonya Bilimi Destekleme Derneği (JSPS; JP19KK0219) ve Japon Dolaşım Topluluğu (Temel Araştırma Hibesi) H.U.
Materials
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145-25 | |
| 2-Mercaptoethanol (55mM) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | |
| 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC) polymer, | NOF Corp. | LIPIDURE-CM5206 | |
| 2-Propanol | Fujifilm wako | 166-04836 | |
| 35-mm imaging dish with a polymer coverslip (µ-Dish 35 mm, high) | ibidi | 81156 | |
| AAVproR Helper Free System (AAV6) (vectors; pHelper, pRC6, pAAV-CMV-Vector) |
Takara | 6651 | |
| ACTN2-mCherry (AR12, AR21) hiPSCs | N.A. | We inserted IRES-puromycin resistant casette to 3' UTR of TNNT2 locus and mCherry around the stop codon of ACTN2 in 610B1 hiPSC line, following a method describe elsewhere (Anzai, Methods Mol Biol, in press) | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| B-27 Supplement, minus insulin | Thermo Fisher Scientific | A18956-01 | |
| B27 supplement (50X), minus Vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587-010 | |
| Benzonase (25 U/µL) | Merck Millipore | 70746 | |
| Blasticidin S Hydrochloride | Fujifilm wako | 029-18701 | |
| BMP-4, Human, Recombinant, | R&D Systems, Inc. | 314-BP-010 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4503-100g | |
| C59, Wnt Antagonist (WntC59) | abcam | ab142216 | |
| CAD drawing software, | Robert McNeel and Associates, WA, USA | Rhinoceros 6.0 | |
| Centrifugal ultrafiltration unit (100k MWCO), Vivaspin-20 | Sartorius | VS2042 | |
| CHIR99021 | Cayman | 13122 | |
| Chromium etchant | Nihon Kagaku Sangyo Co., Ltd., Japan | N14B | |
| Chromium mask coated with AZP1350 | Clean Surface Technology Co., Japan | CBL2506Bu-AZP | |
| Dr. GenTLE Precipitation Carrier (20mg/mL Glycogen, 3 M Sodium Acetate (pH 5.2)) | Takara | 9094 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) – high glucose | Sigma-Aldrich | D6429-500 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) – high glucose, without sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Ethanol (99.5) | Fujifilm wako | 057-00456 | |
| Fetal Bovine Serum | Moregate | 59301104 | |
| FGF-10, Human, Recombinant, | R&D Systems, Inc. | 345-FG-025 | |
| Fibroblast Growth Factor(basic), human, recombinant | Fujifilm wako | 060-04543 | |
| Gelatin from porcine skin powder | Sigma-Aldrich | G1890-100g | |
| Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM) | Sigma-Aldrich | G5154-500 | |
| GLASS BOTTOM culture plates | MatTek | P24G-1.5-13-F/H | |
| Ham’s F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11765-062 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Thermo Fisher Scientific | 12440-061 | |
| L-alanine-L-glutamine (GlutaMAX Supplement, 200mM) | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| L(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt | Fujifilm wako | 196-01252 | |
| Laminin-511 E8 fragment (LN511-E8, iMatrix-511) | Nippi | 892012 | |
| Mask aligner | Union Optical Co., Ltd., Japan | PEM-800 | |
| Maskless lithography tool | NanoSystem Solutions, Inc., Japan | D-Light DL-1000 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF (0.45-µm filter) | Merck Millipore | SLHVR33RS | |
| Myom2-RFP (SMM18) | N.A. | Developed in our previous paper (Chanthra, Sci Rep, 2020) | |
| N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| ORCA-Flash4.0 V3 digital CMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | |
| PD0325901 | Stemgent | 04-0006-10 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Petri dish | Sansei medical co. Ltd | 01-004 | |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1) | Nippon Gene | 311-90151 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer | Dow Corning Corp., MI, USA | SILPOT 184 | |
| polyethylenimine MAX (MW. 40,000) | Polyscience | 24765-1 | |
| Positive photoresist developer | Tokyo Ohka Kogyo Co., Ltd., Japan | NMD-3 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | |
| Proteinase K | Takara | 9034 | |
| Puromycin Dihydrochloride | Fujifilm wako | 166-23153 | |
| Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A Protein | R&D Systems, Inc. | 338-AC-050 | |
| Recombinant trypsin-like protease (rTrypsin; TrypLE express) | Thermo Fisher Scientific | 12604-039 | |
| RPMI1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875-119 | |
| Silicon wafer | Matsuzaki Seisakusyo Co., Ltd., Japan | N.A. | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
| Spin-coater | Mikasa Co., Ltd., Japan | MS-A100 | |
| Spininng confocal microscopy | Oxford Instruments | Andor Dragonfly Spinning Disk System | |
| StemSure LIF, Mouse, recombinant, Solution (10^6U) | Fujifilm wako | 195-16053 | |
| SU-8 3010 | Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA | SU-8 3010 | |
| SU-8 developer | Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA | SU-8 developer | |
| Tris-EDTA | Nippon Gene | 314-90021 | |
| Vascular Endothelial Growth Factor-A165(VEGF), Human, recombinant | Fujifilm wako | 226-01781 |
Referências
- Mensah, G. A., Roth, G. A., Fuster, V. The Global Burden of Cardiovascular Diseases and Risk Factors. Journal of the American College of Cardiology. 74 (20), 2529-2532 (2019).
- Wexler, R. K., Elton, T., Pleister, A., Feldman, D. Cardiomyopathy: an overview. American Family Physician. 79 (9), 778-784 (2009).
- Parrotta, E. I., Lucchino, V., Scaramuzzino, L., Scalise, S., Cuda, G. Modeling Cardiac Disease Mechanisms Using Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes: Progress, Promises and Challenges. International Journal of Molecular Sciences. , 30 (2020).
- Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).
- Lan, F., et al. Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).
- Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494 (7435), 105-110 (2013).
- Gramlich, M., et al. Antisense-mediated exon skipping: a therapeutic strategy for titin-based dilated cardiomyopathy. EMBO Molecular Medicine. 7 (5), 562-576 (2015).
- Wang, G., et al. Modeling the mitochondrial cardiomyopathy of Barth syndrome with induced pluripotent stem cell and heart-on-chip technologies. Nature Medicine. 20 (6), 616-623 (2014).
- Li, S., et al. Mitochondrial Dysfunctions Contribute to Hypertrophic Cardiomyopathy in Patient iPSC-Derived Cardiomyocytes with MT-RNR2 Mutation. Stem Cell Reports. 10 (3), 808-821 (2018).
- Cho, G. -. S., et al. Neonatal Transplantation Confers Maturation of PSC-Derived Cardiomyocytes Conducive to Modeling Cardiomyopathy. Cell Reports. 18 (2), 571-582 (2017).
- Yang, X., et al. Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 296-304 (2014).
- Ribeiro, A. J. S., et al. Multi-Imaging Method to Assay the Contractile Mechanical Output of Micropatterned Human iPSC-Derived Cardiac Myocytes. Circulation Research. 120 (10), 1572-1583 (2017).
- Sewanan, L. R., Campbell, S. G. Modelling sarcomeric cardiomyopathies with human cardiomyocytes derived from induced pluripotent stem cells. The Journal of Physiology. 598 (14), 2909-2922 (2020).
- Kopljar, I., et al. Chronic drug-induced effects on contractile motion properties and cardiac biomarkers in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. British Journal of Pharmacology. 174 (21), 3766-3779 (2017).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
- Ribeiro, A. J. S., et al. Contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (41), 12705-12710 (2015).
- Roberts, B., et al. Fluorescent Gene Tagging of Transcriptionally Silent Genes in hiPSCs. Stem Cell Reports. 12 (5), 1145-1158 (2019).
- Chanthra, N., et al. A Novel Fluorescent Reporter System Identifies Laminin-511/521 as Potent Regulators of Cardiomyocyte Maturation. Scientific Reports. 10 (1), 4249 (2020).
- Ribeiro, M. C., et al. A cardiomyocyte show of force: A fluorescent alpha-actinin reporter line sheds light on human cardiomyocyte contractility versus substrate stiffness. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 141, 54-64 (2020).
- Yamanaka, S., Zahanich, I., Wersto, R. P., Boheler, K. R. Enhanced Proliferation of Monolayer Cultures of Embryonic Stem (ES) Cell-Derived Cardiomyocytes Following Acute Loss of Retinoblastoma. PLoS ONE. 3 (12), 3896 (2008).
- Miyazaki, T., Isobe, T., Nakatsuji, N., Suemori, H. Efficient Adhesion Culture of Human Pluripotent Stem Cells Using Laminin Fragments in an Uncoated Manner. Scientific Reports. 7 (1), 41165 (2017).
- Prasad, K. -. M. R., Xu, Y., Yang, Z., Acton, S. T., French, B. A. Robust cardiomyocyte-specific gene expression following systemic injection of AAV: in vivo gene delivery follows a Poisson distribution. Gene Therapy. 18 (1), 43-52 (2011).
- Arakawa, H., et al. Protein evolution by hypermutation and selection in the B cell line DT40. Nucleic Acids Research. 36 (1), e1 (2007).
- Konno, A., Hirai, H. Efficient whole brain transduction by systemic infusion of minimally purified AAV-PHP.eB. Journal of Neuroscience Methods. 346, 108914 (2020).
- Anzai, T., et al., Yoshida, Y., et al. Generation of Efficient Knock-in Mouse and Human Pluripotent Stem Cells Using CRISPR-Cas9. Methods of Molecular Biology. , (2020).
- Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. A Brief Review of Current Maturation Methods for Human Induced Pluripotent Stem Cells-Derived Cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).
- Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).
- Flores, L. R., Keeling, M. C., Zhang, X., Sliogeryte, K., Gavara, N. Lifeact-GFP alters F-actin organization, cellular morphology and biophysical behaviour. Scientific Reports. 9 (1), 3241 (2019).
- Sparrow, A. J., et al. Measurement of Myofilament-Localized Calcium Dynamics in Adult Cardiomyocytes and the Effect of Hypertrophic Cardiomyopathy Mutations. Circulation Research. 124 (8), 1228-1239 (2019).
