Саркомерное укорочение кардиомиоцитов, полученных из плюрипотентных стволовых клеток, с использованием флуоресцентно-помеченных саркомерных белков.
Summary
Этот метод может быть использован для исследования укорочения саркомера с использованием плюрипотентных кардиомиоцитов, полученных из стволовых клеток, с флуоресцентными белками саркомера.
Abstract
Плюрипотентные кардиомиоциты, полученные из стволовых клеток (PSC-CMs), могут быть получены как из эмбриональных, так и из индуцированных плюрипотентных стволовых (ES / iPS) клеток. Эти клетки являются перспективными источниками для моделирования сердечных заболеваний. Для кардиомиопатий укорочение саркомера является одной из стандартных физиологических оценок, которые используются со взрослыми кардиомиоцитами для изучения фенотипов их заболевания. Однако имеющиеся методы не подходят для оценки сократимости PSC-CMs, так как эти клетки имеют недостаточно развитые саркомеры, которые невидимы при фазово-контрастной микроскопии. Для решения этой проблемы и выполнения укорочения саркомера с помощью PSC-CMs использовались флуоресцентные помеченные белки саркомера и флуоресцентная живая визуализация. Тонкие Z-линии и М-линия находятся на обоих концах и в центре саркомера соответственно. Белки Z-линии — α-актинин (ACTN2), телетонин (TCAP) и актин-ассоциированный белок LIM (PDLIM3) — и один белок M-линии — Myomesin-2 (Myom2) — были помечены флуоресцентными белками. Эти помеченные белки могут быть экспрессированы из эндогенных аллелей в виде нокаутов или из аденоассоциированных вирусов (AAV). Здесь мы представляем методы дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток мыши и человека к кардиомиоцитам, для производства AAV, а также для выполнения и анализа живой визуализации. Описаны также методы получения полидиметилсилоксановых (PDMS) штампов для узорчатой культуры PSC-CMs, что облегчает анализ укорочения саркомера флуоресцентно-помеченными белками. Для оценки укорочения саркомера были записаны покадровые изображения бьющихся клеток с высокой частотой кадров (50-100 кадров в секунду) при электрической стимуляции (0,5-1 Гц). Для анализа длины саркомера в ходе сокращения клеток записанные покадровые изображения были подвергнуты SarcOptiM, плагину для ImageJ / Fiji. Наша стратегия предоставляет простую платформу для исследования фенотипов сердечных заболеваний в PSC-CMs.
Introduction
Сердечно-сосудистые заболевания являются основной причиной смертности во всем мире1, а кардиомиопатия представляет собой третью причину смертности, связанной с сердцем2. Кардиомиопатия – это коллективная группа заболеваний, поражающих сердечную мышцу. Последние разработки индуцированных плюрипотентных стволовых (iPS) клеток и направленная дифференцировка iPS-клеток в сторону кардиомиоцитов (PSC-CMs) открыли двери для изучения кардиомиоцитов с геномом пациента в качестве модели кардиомиопатии in vitro. Эти клетки могут быть использованы для понимания патофизиологии сердечных заболеваний, для выяснения их молекулярных механизмов и для тестирования различных терапевтических кандидатов3. Существует огромный интерес, таким образом, были сгенерированы iPS-клетки, полученные от пациента (например, гипертрофическая кардиомиопатия [HCM]4,5,аритмогенная кардиомиопатия правого желудочка [ARVC]6,дилатационная кардиомиопатия [DCM]7и кардиомиопатии, связанные с митохондриями,8,9). Поскольку одной из характеристик кардиомиопатии является дисфункция и нарушение саркомер, необходим действительный инструмент, который равномерно измеряет функцию саркомера.
Укорочение саркомера является наиболее широко используемым методом оценки функции саркомера и сократимости взрослых кардиомиоцитов, полученных от животных моделей и людей. Для выполнения укорочения саркомера требуются хорошо развитые саркомы, которые видны при фазово-контрастном. Однако PSC-CMs, культивируемые in vitro, демонстрируют недоразвитые и дезорганизованные саркомеры и, следовательно, не могут быть использованы для правильного измерения укорочения саркомера10. Эта трудность правильной оценки сократимости PSC-CMs препятствует их использованию в качестве платформы для оценки сердечных функций in vitro. Для косвенной оценки сократимости PSC-CMs использовались атомно-силовая микроскопия, микропостойные массивы, микроскопия силы тяги и измерения импеданса для измерения влияния движения, оказываемого этими клетками на их окружение11,12,13. Более сложные и менее инвазивные видеомикроскопические записи фактического клеточного движения (например, SI8000 от SONY) могут быть использованы для альтернативной оценки их сократимости, однако этот метод не измеряет непосредственно саркомерное движение или кинетику генерации силы14.
Для непосредственного измерения движения саркомера в PSC-CMs появляются новые подходы, такие как флуоресцентная маркировка белка саркомера. Например, Lifeact используется для маркировки нитевидных актинов (F-актина) для измерения саркомерного движения15,16. Генетически модифицированные iPS-клетки являются еще одним вариантом маркировки саркомерных белков (например, α-актинина [ACTN2] и миомезина-2 [MYOM2]) флуоресцентным белком17,18,19.
В этой статье мы описываем, как выполнить покадровую визуализацию для измерения укорочения саркомера с использованием Myom2-TagRFP (эмбриональные стволовые клетки мыши [ES]) и ACTN2-mCherry (человеческие iPS-клетки). Мы также показываем, что узорчатая культура облегчает выравнивание саркомера. Кроме того, мы описываем альтернативный метод маркировки саркомера с использованием аденоациациированных вирусов (AAV), который может быть широко применен к iPS-клеткам, полученным от пациента.
Protocol
Representative Results
Discussion
PSC-CMs имеют большой потенциал для использования в качестве платформы in vitro для моделирования сердечных заболеваний и тестирования эффектов лекарств. Тем не менее, сначала необходимо разработать точный, унифицированный метод оценки функций PSC-CMs. Большинство функциональных тестов р…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить всех членов лаборатории в отделе регенеративной медицины Медицинского университета Джичи за полезную дискуссию и техническую помощь. Это исследование было поддержано грантами Японского агентства медицинских исследований и разработок (AMED; JP18bm0704012 и JP20bm0804018), Японское общество содействия развитию науки (JSPS; JP19KK0219) и Японское общество циркуляции (грант на фундаментальные исследования) для H.U.
Materials
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145-25 | |
| 2-Mercaptoethanol (55mM) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | |
| 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC) polymer, | NOF Corp. | LIPIDURE-CM5206 | |
| 2-Propanol | Fujifilm wako | 166-04836 | |
| 35-mm imaging dish with a polymer coverslip (µ-Dish 35 mm, high) | ibidi | 81156 | |
| AAVproR Helper Free System (AAV6) (vectors; pHelper, pRC6, pAAV-CMV-Vector) |
Takara | 6651 | |
| ACTN2-mCherry (AR12, AR21) hiPSCs | N.A. | We inserted IRES-puromycin resistant casette to 3' UTR of TNNT2 locus and mCherry around the stop codon of ACTN2 in 610B1 hiPSC line, following a method describe elsewhere (Anzai, Methods Mol Biol, in press) | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| B-27 Supplement, minus insulin | Thermo Fisher Scientific | A18956-01 | |
| B27 supplement (50X), minus Vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587-010 | |
| Benzonase (25 U/µL) | Merck Millipore | 70746 | |
| Blasticidin S Hydrochloride | Fujifilm wako | 029-18701 | |
| BMP-4, Human, Recombinant, | R&D Systems, Inc. | 314-BP-010 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4503-100g | |
| C59, Wnt Antagonist (WntC59) | abcam | ab142216 | |
| CAD drawing software, | Robert McNeel and Associates, WA, USA | Rhinoceros 6.0 | |
| Centrifugal ultrafiltration unit (100k MWCO), Vivaspin-20 | Sartorius | VS2042 | |
| CHIR99021 | Cayman | 13122 | |
| Chromium etchant | Nihon Kagaku Sangyo Co., Ltd., Japan | N14B | |
| Chromium mask coated with AZP1350 | Clean Surface Technology Co., Japan | CBL2506Bu-AZP | |
| Dr. GenTLE Precipitation Carrier (20mg/mL Glycogen, 3 M Sodium Acetate (pH 5.2)) | Takara | 9094 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) – high glucose | Sigma-Aldrich | D6429-500 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) – high glucose, without sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Ethanol (99.5) | Fujifilm wako | 057-00456 | |
| Fetal Bovine Serum | Moregate | 59301104 | |
| FGF-10, Human, Recombinant, | R&D Systems, Inc. | 345-FG-025 | |
| Fibroblast Growth Factor(basic), human, recombinant | Fujifilm wako | 060-04543 | |
| Gelatin from porcine skin powder | Sigma-Aldrich | G1890-100g | |
| Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM) | Sigma-Aldrich | G5154-500 | |
| GLASS BOTTOM culture plates | MatTek | P24G-1.5-13-F/H | |
| Ham’s F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11765-062 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Thermo Fisher Scientific | 12440-061 | |
| L-alanine-L-glutamine (GlutaMAX Supplement, 200mM) | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| L(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt | Fujifilm wako | 196-01252 | |
| Laminin-511 E8 fragment (LN511-E8, iMatrix-511) | Nippi | 892012 | |
| Mask aligner | Union Optical Co., Ltd., Japan | PEM-800 | |
| Maskless lithography tool | NanoSystem Solutions, Inc., Japan | D-Light DL-1000 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF (0.45-µm filter) | Merck Millipore | SLHVR33RS | |
| Myom2-RFP (SMM18) | N.A. | Developed in our previous paper (Chanthra, Sci Rep, 2020) | |
| N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| ORCA-Flash4.0 V3 digital CMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | |
| PD0325901 | Stemgent | 04-0006-10 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Petri dish | Sansei medical co. Ltd | 01-004 | |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1) | Nippon Gene | 311-90151 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer | Dow Corning Corp., MI, USA | SILPOT 184 | |
| polyethylenimine MAX (MW. 40,000) | Polyscience | 24765-1 | |
| Positive photoresist developer | Tokyo Ohka Kogyo Co., Ltd., Japan | NMD-3 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | |
| Proteinase K | Takara | 9034 | |
| Puromycin Dihydrochloride | Fujifilm wako | 166-23153 | |
| Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A Protein | R&D Systems, Inc. | 338-AC-050 | |
| Recombinant trypsin-like protease (rTrypsin; TrypLE express) | Thermo Fisher Scientific | 12604-039 | |
| RPMI1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875-119 | |
| Silicon wafer | Matsuzaki Seisakusyo Co., Ltd., Japan | N.A. | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
| Spin-coater | Mikasa Co., Ltd., Japan | MS-A100 | |
| Spininng confocal microscopy | Oxford Instruments | Andor Dragonfly Spinning Disk System | |
| StemSure LIF, Mouse, recombinant, Solution (10^6U) | Fujifilm wako | 195-16053 | |
| SU-8 3010 | Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA | SU-8 3010 | |
| SU-8 developer | Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA | SU-8 developer | |
| Tris-EDTA | Nippon Gene | 314-90021 | |
| Vascular Endothelial Growth Factor-A165(VEGF), Human, recombinant | Fujifilm wako | 226-01781 |
Referências
- Mensah, G. A., Roth, G. A., Fuster, V. The Global Burden of Cardiovascular Diseases and Risk Factors. Journal of the American College of Cardiology. 74 (20), 2529-2532 (2019).
- Wexler, R. K., Elton, T., Pleister, A., Feldman, D. Cardiomyopathy: an overview. American Family Physician. 79 (9), 778-784 (2009).
- Parrotta, E. I., Lucchino, V., Scaramuzzino, L., Scalise, S., Cuda, G. Modeling Cardiac Disease Mechanisms Using Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes: Progress, Promises and Challenges. International Journal of Molecular Sciences. , 30 (2020).
- Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).
- Lan, F., et al. Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).
- Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494 (7435), 105-110 (2013).
- Gramlich, M., et al. Antisense-mediated exon skipping: a therapeutic strategy for titin-based dilated cardiomyopathy. EMBO Molecular Medicine. 7 (5), 562-576 (2015).
- Wang, G., et al. Modeling the mitochondrial cardiomyopathy of Barth syndrome with induced pluripotent stem cell and heart-on-chip technologies. Nature Medicine. 20 (6), 616-623 (2014).
- Li, S., et al. Mitochondrial Dysfunctions Contribute to Hypertrophic Cardiomyopathy in Patient iPSC-Derived Cardiomyocytes with MT-RNR2 Mutation. Stem Cell Reports. 10 (3), 808-821 (2018).
- Cho, G. -. S., et al. Neonatal Transplantation Confers Maturation of PSC-Derived Cardiomyocytes Conducive to Modeling Cardiomyopathy. Cell Reports. 18 (2), 571-582 (2017).
- Yang, X., et al. Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 296-304 (2014).
- Ribeiro, A. J. S., et al. Multi-Imaging Method to Assay the Contractile Mechanical Output of Micropatterned Human iPSC-Derived Cardiac Myocytes. Circulation Research. 120 (10), 1572-1583 (2017).
- Sewanan, L. R., Campbell, S. G. Modelling sarcomeric cardiomyopathies with human cardiomyocytes derived from induced pluripotent stem cells. The Journal of Physiology. 598 (14), 2909-2922 (2020).
- Kopljar, I., et al. Chronic drug-induced effects on contractile motion properties and cardiac biomarkers in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. British Journal of Pharmacology. 174 (21), 3766-3779 (2017).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
- Ribeiro, A. J. S., et al. Contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (41), 12705-12710 (2015).
- Roberts, B., et al. Fluorescent Gene Tagging of Transcriptionally Silent Genes in hiPSCs. Stem Cell Reports. 12 (5), 1145-1158 (2019).
- Chanthra, N., et al. A Novel Fluorescent Reporter System Identifies Laminin-511/521 as Potent Regulators of Cardiomyocyte Maturation. Scientific Reports. 10 (1), 4249 (2020).
- Ribeiro, M. C., et al. A cardiomyocyte show of force: A fluorescent alpha-actinin reporter line sheds light on human cardiomyocyte contractility versus substrate stiffness. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 141, 54-64 (2020).
- Yamanaka, S., Zahanich, I., Wersto, R. P., Boheler, K. R. Enhanced Proliferation of Monolayer Cultures of Embryonic Stem (ES) Cell-Derived Cardiomyocytes Following Acute Loss of Retinoblastoma. PLoS ONE. 3 (12), 3896 (2008).
- Miyazaki, T., Isobe, T., Nakatsuji, N., Suemori, H. Efficient Adhesion Culture of Human Pluripotent Stem Cells Using Laminin Fragments in an Uncoated Manner. Scientific Reports. 7 (1), 41165 (2017).
- Prasad, K. -. M. R., Xu, Y., Yang, Z., Acton, S. T., French, B. A. Robust cardiomyocyte-specific gene expression following systemic injection of AAV: in vivo gene delivery follows a Poisson distribution. Gene Therapy. 18 (1), 43-52 (2011).
- Arakawa, H., et al. Protein evolution by hypermutation and selection in the B cell line DT40. Nucleic Acids Research. 36 (1), e1 (2007).
- Konno, A., Hirai, H. Efficient whole brain transduction by systemic infusion of minimally purified AAV-PHP.eB. Journal of Neuroscience Methods. 346, 108914 (2020).
- Anzai, T., et al., Yoshida, Y., et al. Generation of Efficient Knock-in Mouse and Human Pluripotent Stem Cells Using CRISPR-Cas9. Methods of Molecular Biology. , (2020).
- Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. A Brief Review of Current Maturation Methods for Human Induced Pluripotent Stem Cells-Derived Cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).
- Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).
- Flores, L. R., Keeling, M. C., Zhang, X., Sliogeryte, K., Gavara, N. Lifeact-GFP alters F-actin organization, cellular morphology and biophysical behaviour. Scientific Reports. 9 (1), 3241 (2019).
- Sparrow, A. J., et al. Measurement of Myofilament-Localized Calcium Dynamics in Adult Cardiomyocytes and the Effect of Hypertrophic Cardiomyopathy Mutations. Circulation Research. 124 (8), 1228-1239 (2019).
