Sarcomere Afkortning af pluripotente stamcelle-afledte kardiomyocytter ved hjælp af fluorescerende-tagged Sarcomere proteiner.
Summary
Denne metode kan bruges til at undersøge sarkomforkortelser ved hjælp af pluripotente stamcelleafledte kardiomyocytter med fluorescerende-mærkede sarkomproteiner.
Abstract
Pluripotente stamcelleafledte kardiomyocytter (PSC-CMs) kan fremstilles af både embryonale og inducerede pluripotente stamceller (ES/iPS). Disse celler giver lovende kilder til hjertesygdom modellering. For kardiomyopatier er sarkomere afkortning en af de standard fysiologiske vurderinger, der bruges sammen med voksne kardiomyocytter til at undersøge deres sygdomsphoenotyper. De tilgængelige metoder er imidlertid ikke egnede til at vurdere PSC-CMs’ kontraktilitet, da disse celler har underudviklede sarkomenter, der er usynlige under fasekontrastmikroskopi. For at løse dette problem og udføre sarkomforkortelse med PSC-CMs blev der anvendt fluorescerende tagged sarkomproteiner og fluorescerende live-imaging. Tynde Z-linjer og en M-line opholde sig i begge ender og i midten af en sarkom, henholdsvis. Z-line proteiner — α-Actinin (ACTN2), Telethonin (TCAP) og actin-associeret LIM-protein (PDLIM3) — og et M-line protein — Myomesin-2 (Myom2) — blev mærket med fluorescerende proteiner. Disse mærkede proteiner kan udtrykkes fra endogene alleler som knock-ins eller fra adeno-associerede vira (AAV’er). Her introducerer vi metoderne til at differentiere mus og menneskelige pluripotente stamceller til kardiomyocytter, til at producere AAV’er og til at udføre og analysere live-imaging. Vi beskriver også metoderne til fremstilling af polydimethylsiloxan (PDMS) frimærker til en mønstret kultur af PSC-CMs, som letter analysen af sarkomere afkortning med fluorescerende-mærkede proteiner. For at vurdere sarkomforkortelse blev time-lapse-billeder af de bankende celler optaget med en høj framerate (50-100 billeder i sekundet) under elektrisk stimulering (0,5-1 Hz). For at analysere sarkomlængden i løbet af cellesammentrækning blev de optagede time-lapse-billeder udsat for SarcOptiM, en plug-in til ImageJ / Fiji. Vores strategi giver en enkel platform til undersøgelse af hjertesygdomme fænotyper i PSC-CMs.
Introduction
Hjerte-kar-sygdomme er den hyppigste årsag til dødelighed på verdensplan1 og kardiomyopati udgør den tredje årsag til hjerte-relaterede dødsfald2. Kardiomyopati er en kollektiv gruppe af sygdomme, der påvirker hjertemusklerne. Den seneste udvikling af inducerede pluripotente stamceller (iPS) og den rettet differentiering af iPS-celler mod kardiomyocytter (PSC-CMs) har åbnet døren for at studere kardiomyocytter med patientgenom som en in vitro-model af kardiomyopati. Disse celler kan bruges til at forstå patofysiologien af hjertesygdomme, til at belyse deres molekylære mekanismer og til at teste forskellige terapeutiske kandidater3. Der er en enorm interesse, således patient-afledte iPS celler er blevet genereret (f.eks hypertrofisk kardiomyopati [HCM]4,5, arytmogenic højre ventrikulær kardiomyopati [ARVC]6, udvidede kardiomyopati [DCM]7, og mitokondrie-relaterede kardiomyopatier8,9). Fordi et af kendetegnene ved kardiomyopati er dysfunktion og forstyrrelse af sarkomenter, er der brug for et gyldigt værktøj, der ensartet måler sarkomfunktion.
Sarkomere afkortning er den mest anvendte teknik til at vurdere sarkomfunktion og kontraktiliteten af voksne kardiomyocytter afledt af dyremodeller og mennesker. For at udføre sarkomforkortende, er veludviklede sarkomere, der er synlige under fasekontrast, påkrævet. PSC-CMs dyrkede imidlertid in vitro-display underudviklede og uorganiserede sarkomenter og kan derfor ikke bruges til korrekt at måle sarkomforkortelser10. Denne vanskelighed ved at foretage en korrekt vurdering af PSC-CMs ‘ kontraktilitet hindrer deres brug som platform til vurdering af hjertefunktioner in vitro. For indirekte at vurdere PSC-CMs-kontraktilitet er der anvendt mikroskopi af atomkraft, mikro-post-arrays, mikroskopi og impedansmålinger til måling af virkningerne af den bevægelse, som disse celler udøver på deres omgivelser11,12,13. Mere sofistikerede og mindre invasive videomikroskopioptagelser af faktisk cellulær bevægelse (f.eks. SI8000 fra SONY) kan bruges til alternativt at vurdere deres kontraktilitet, men denne metode måler ikke direkte sarkomere bevægelse eller kraftgenerering kinetik14.
For direkte at måle sarkom bevægelse i PSC-CMs, nye tilgange, såsom fluorescerende-tagging til sarkomere protein, er ved at opstå. For eksempel bruges Lifeact til at mærke filamentous actin (F-actin) til at måle sarkom bevægelse15,16. Genetisk modificerede iPS-celler er en anden mulighed for tagging af sarkomproteiner (f.eks. α-actinin [ACTN2] og Myomesin-2 [MYOM2]) med fluorescerende protein17,18,19.
I dette papir beskriver vi, hvordan man udfører time-lapse imaging til måling af sarkomforkortelser ved hjælp af Myom2-TagRFP (musefosterstamceller [ES] og ACTN2-mCherry (humane iPS-celler). Vi viser også, at en mønstret kultur letter sarkomere tilpasning. Derudover beskriver vi en alternativ metode til sarkommærkning ved hjælp af adeno-associerede vira (AAV’er), som i vid udstrækning kan anvendes på patientafledte iPS-celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
PSC-CMs har et stort potentiale til at blive brugt som en in vitro platform til model hjertesygdom og til at teste virkningerne af narkotika. Ikke desto mindre skal der først etableres en nøjagtig og ensartet metode til vurdering af PSC-CMs-funktioner. De fleste af funktionelle tests arbejder med PSC-CMs, f.eks elektrofysiologi, calcium forbigående, og stofskifte26, og en af de første patient-afledte PSC-CM undersøgelser handlede om lang-QT syndrom27. Men kont…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne anerkende alle laboratoriemedlemmer i Afdelingen for Regenerativ Medicin ved Jichi Medical University for den nyttige diskussion og teknisk bistand. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra Japan Agency for Medical Research and Development (AMED; JP18bm0704012 og JP20bm0804018), Japan Society for the Promotion of Science (JSPS; JP19KK0219), og den japanske Circulation Society (Grant for Basic Research) til H.U.
Materials
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145-25 | |
| 2-Mercaptoethanol (55mM) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | |
| 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC) polymer, | NOF Corp. | LIPIDURE-CM5206 | |
| 2-Propanol | Fujifilm wako | 166-04836 | |
| 35-mm imaging dish with a polymer coverslip (µ-Dish 35 mm, high) | ibidi | 81156 | |
| AAVproR Helper Free System (AAV6) (vectors; pHelper, pRC6, pAAV-CMV-Vector) |
Takara | 6651 | |
| ACTN2-mCherry (AR12, AR21) hiPSCs | N.A. | We inserted IRES-puromycin resistant casette to 3' UTR of TNNT2 locus and mCherry around the stop codon of ACTN2 in 610B1 hiPSC line, following a method describe elsewhere (Anzai, Methods Mol Biol, in press) | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| B-27 Supplement, minus insulin | Thermo Fisher Scientific | A18956-01 | |
| B27 supplement (50X), minus Vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587-010 | |
| Benzonase (25 U/µL) | Merck Millipore | 70746 | |
| Blasticidin S Hydrochloride | Fujifilm wako | 029-18701 | |
| BMP-4, Human, Recombinant, | R&D Systems, Inc. | 314-BP-010 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4503-100g | |
| C59, Wnt Antagonist (WntC59) | abcam | ab142216 | |
| CAD drawing software, | Robert McNeel and Associates, WA, USA | Rhinoceros 6.0 | |
| Centrifugal ultrafiltration unit (100k MWCO), Vivaspin-20 | Sartorius | VS2042 | |
| CHIR99021 | Cayman | 13122 | |
| Chromium etchant | Nihon Kagaku Sangyo Co., Ltd., Japan | N14B | |
| Chromium mask coated with AZP1350 | Clean Surface Technology Co., Japan | CBL2506Bu-AZP | |
| Dr. GenTLE Precipitation Carrier (20mg/mL Glycogen, 3 M Sodium Acetate (pH 5.2)) | Takara | 9094 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) – high glucose | Sigma-Aldrich | D6429-500 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) – high glucose, without sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Ethanol (99.5) | Fujifilm wako | 057-00456 | |
| Fetal Bovine Serum | Moregate | 59301104 | |
| FGF-10, Human, Recombinant, | R&D Systems, Inc. | 345-FG-025 | |
| Fibroblast Growth Factor(basic), human, recombinant | Fujifilm wako | 060-04543 | |
| Gelatin from porcine skin powder | Sigma-Aldrich | G1890-100g | |
| Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM) | Sigma-Aldrich | G5154-500 | |
| GLASS BOTTOM culture plates | MatTek | P24G-1.5-13-F/H | |
| Ham’s F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11765-062 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Thermo Fisher Scientific | 12440-061 | |
| L-alanine-L-glutamine (GlutaMAX Supplement, 200mM) | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| L(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt | Fujifilm wako | 196-01252 | |
| Laminin-511 E8 fragment (LN511-E8, iMatrix-511) | Nippi | 892012 | |
| Mask aligner | Union Optical Co., Ltd., Japan | PEM-800 | |
| Maskless lithography tool | NanoSystem Solutions, Inc., Japan | D-Light DL-1000 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF (0.45-µm filter) | Merck Millipore | SLHVR33RS | |
| Myom2-RFP (SMM18) | N.A. | Developed in our previous paper (Chanthra, Sci Rep, 2020) | |
| N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| ORCA-Flash4.0 V3 digital CMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | |
| PD0325901 | Stemgent | 04-0006-10 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Petri dish | Sansei medical co. Ltd | 01-004 | |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1) | Nippon Gene | 311-90151 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer | Dow Corning Corp., MI, USA | SILPOT 184 | |
| polyethylenimine MAX (MW. 40,000) | Polyscience | 24765-1 | |
| Positive photoresist developer | Tokyo Ohka Kogyo Co., Ltd., Japan | NMD-3 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | |
| Proteinase K | Takara | 9034 | |
| Puromycin Dihydrochloride | Fujifilm wako | 166-23153 | |
| Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A Protein | R&D Systems, Inc. | 338-AC-050 | |
| Recombinant trypsin-like protease (rTrypsin; TrypLE express) | Thermo Fisher Scientific | 12604-039 | |
| RPMI1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875-119 | |
| Silicon wafer | Matsuzaki Seisakusyo Co., Ltd., Japan | N.A. | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
| Spin-coater | Mikasa Co., Ltd., Japan | MS-A100 | |
| Spininng confocal microscopy | Oxford Instruments | Andor Dragonfly Spinning Disk System | |
| StemSure LIF, Mouse, recombinant, Solution (10^6U) | Fujifilm wako | 195-16053 | |
| SU-8 3010 | Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA | SU-8 3010 | |
| SU-8 developer | Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA | SU-8 developer | |
| Tris-EDTA | Nippon Gene | 314-90021 | |
| Vascular Endothelial Growth Factor-A165(VEGF), Human, recombinant | Fujifilm wako | 226-01781 |
Referências
- Mensah, G. A., Roth, G. A., Fuster, V. The Global Burden of Cardiovascular Diseases and Risk Factors. Journal of the American College of Cardiology. 74 (20), 2529-2532 (2019).
- Wexler, R. K., Elton, T., Pleister, A., Feldman, D. Cardiomyopathy: an overview. American Family Physician. 79 (9), 778-784 (2009).
- Parrotta, E. I., Lucchino, V., Scaramuzzino, L., Scalise, S., Cuda, G. Modeling Cardiac Disease Mechanisms Using Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes: Progress, Promises and Challenges. International Journal of Molecular Sciences. , 30 (2020).
- Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).
- Lan, F., et al. Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).
- Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494 (7435), 105-110 (2013).
- Gramlich, M., et al. Antisense-mediated exon skipping: a therapeutic strategy for titin-based dilated cardiomyopathy. EMBO Molecular Medicine. 7 (5), 562-576 (2015).
- Wang, G., et al. Modeling the mitochondrial cardiomyopathy of Barth syndrome with induced pluripotent stem cell and heart-on-chip technologies. Nature Medicine. 20 (6), 616-623 (2014).
- Li, S., et al. Mitochondrial Dysfunctions Contribute to Hypertrophic Cardiomyopathy in Patient iPSC-Derived Cardiomyocytes with MT-RNR2 Mutation. Stem Cell Reports. 10 (3), 808-821 (2018).
- Cho, G. -. S., et al. Neonatal Transplantation Confers Maturation of PSC-Derived Cardiomyocytes Conducive to Modeling Cardiomyopathy. Cell Reports. 18 (2), 571-582 (2017).
- Yang, X., et al. Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 296-304 (2014).
- Ribeiro, A. J. S., et al. Multi-Imaging Method to Assay the Contractile Mechanical Output of Micropatterned Human iPSC-Derived Cardiac Myocytes. Circulation Research. 120 (10), 1572-1583 (2017).
- Sewanan, L. R., Campbell, S. G. Modelling sarcomeric cardiomyopathies with human cardiomyocytes derived from induced pluripotent stem cells. The Journal of Physiology. 598 (14), 2909-2922 (2020).
- Kopljar, I., et al. Chronic drug-induced effects on contractile motion properties and cardiac biomarkers in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. British Journal of Pharmacology. 174 (21), 3766-3779 (2017).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
- Ribeiro, A. J. S., et al. Contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (41), 12705-12710 (2015).
- Roberts, B., et al. Fluorescent Gene Tagging of Transcriptionally Silent Genes in hiPSCs. Stem Cell Reports. 12 (5), 1145-1158 (2019).
- Chanthra, N., et al. A Novel Fluorescent Reporter System Identifies Laminin-511/521 as Potent Regulators of Cardiomyocyte Maturation. Scientific Reports. 10 (1), 4249 (2020).
- Ribeiro, M. C., et al. A cardiomyocyte show of force: A fluorescent alpha-actinin reporter line sheds light on human cardiomyocyte contractility versus substrate stiffness. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 141, 54-64 (2020).
- Yamanaka, S., Zahanich, I., Wersto, R. P., Boheler, K. R. Enhanced Proliferation of Monolayer Cultures of Embryonic Stem (ES) Cell-Derived Cardiomyocytes Following Acute Loss of Retinoblastoma. PLoS ONE. 3 (12), 3896 (2008).
- Miyazaki, T., Isobe, T., Nakatsuji, N., Suemori, H. Efficient Adhesion Culture of Human Pluripotent Stem Cells Using Laminin Fragments in an Uncoated Manner. Scientific Reports. 7 (1), 41165 (2017).
- Prasad, K. -. M. R., Xu, Y., Yang, Z., Acton, S. T., French, B. A. Robust cardiomyocyte-specific gene expression following systemic injection of AAV: in vivo gene delivery follows a Poisson distribution. Gene Therapy. 18 (1), 43-52 (2011).
- Arakawa, H., et al. Protein evolution by hypermutation and selection in the B cell line DT40. Nucleic Acids Research. 36 (1), e1 (2007).
- Konno, A., Hirai, H. Efficient whole brain transduction by systemic infusion of minimally purified AAV-PHP.eB. Journal of Neuroscience Methods. 346, 108914 (2020).
- Anzai, T., et al., Yoshida, Y., et al. Generation of Efficient Knock-in Mouse and Human Pluripotent Stem Cells Using CRISPR-Cas9. Methods of Molecular Biology. , (2020).
- Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. A Brief Review of Current Maturation Methods for Human Induced Pluripotent Stem Cells-Derived Cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).
- Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).
- Flores, L. R., Keeling, M. C., Zhang, X., Sliogeryte, K., Gavara, N. Lifeact-GFP alters F-actin organization, cellular morphology and biophysical behaviour. Scientific Reports. 9 (1), 3241 (2019).
- Sparrow, A. J., et al. Measurement of Myofilament-Localized Calcium Dynamics in Adult Cardiomyocytes and the Effect of Hypertrophic Cardiomyopathy Mutations. Circulation Research. 124 (8), 1228-1239 (2019).
