קיצור סרקומר של קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטים באמצעות חלבוני סרקומר מתויגים פלואורסצנטיים.
Summary
שיטה זו יכולה לשמש כדי לבחון קיצור סרקומר באמצעות קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטים עם חלבוני סרקומר מתויגים פלואורסצנטיים.
Abstract
קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטים (PSC-CMs) יכולים להיות מיוצרים הן מתאי גזע עובריים והן מתאי גזע פלוריפוטנטיים (ES/iPS). תאים אלה מספקים מקורות מבטיחים למידול מחלות לב. עבור קרדיומיופתיות, קיצור sarcomere היא אחת ההערכות הפיזיולוגיות הסטנדרטיות המשמשות עם קרדיומיוציטים למבוגרים כדי לבחון את פנוטיפים המחלה שלהם. עם זאת, השיטות הזמינות אינן מתאימות להערכת התכווצות של PSC-CMs, שכן לתאים אלה יש סרקומרים לא מפותחים שאינם נראים תחת מיקרוסקופיה של ניגודיות פאזה. כדי לטפל בבעיה זו ולבצע קיצור סרקומר עם PSC-CMs, נעשה שימוש בחלבוני סרקומר מתויגים פלואורסצנטיים והדמיה חיה פלואורסצנטית. קווי Z דקים וקו M שוכנים בשני הקצוות ובמרכז סרקומר, בהתאמה. חלבוני קו Z – α-Actinin (ACTN2), טלתונין (TCAP) וחלבון LIM הקשור לאקטין (PDLIM3) – וחלבון קו M אחד – מיומיסין-2 (Myom2) – תויגו בחלבונים פלואורסצנטיים. חלבונים מתויגים אלה יכולים לבוא לידי ביטוי מאללים אנדוגניים כמו דפיקות או מווירוסים הקשורים אדנו (AAVs). כאן, אנו מציגים את השיטות להבדיל בין תאי גזע של עכברים ופלוריפוטנטים אנושיים לקרדיומיוציטים, לייצר AAVs, ולבצע ולנתח הדמיה חיה. אנו מתארים גם את השיטות לייצור חותמות פולידימתילסילוקסן (PDMS) עבור תרבות בדוגמת PSC-CMs, המאפשרת ניתוח של קיצור סרקומר עם חלבונים מתויגים פלואורסצנטית. כדי להעריך קיצור של sarcomere, תמונות זמן לשגות של התאים הפועמים נרשמו בקצב מסגרת גבוה (50-100 פריימים לשנייה) תחת גירוי חשמלי (0.5-1 הרץ). כדי לנתח את אורך הסרקום במהלך התכווצות התא, התמונות המוקלטות של זמן לשגות היו כפופות ל- SarcOptiM, תוסף ל- ImageJ / פיג’י. האסטרטגיה שלנו מספקת פלטפורמה פשוטה לחקירת פנוטיפים של מחלות לב ב- PSC-CMs.
Introduction
מחלות לב וכלי דם הן הגורם המוביל לתמותה ברחבי העולם1 וקרדיומיופתיה מייצגת את הגורם השלישי למוות הקשור לב2. קרדיומיופתיה היא קבוצה קולקטיבית של מחלות המשפיעות על שרירי הלב. ההתפתחויות האחרונות של תאי גזע פלוריפוטנטים המושרים (iPS) וההבחנה המוכוונת של תאי IPS כלפי קרדיומיוציטים (PSC-CMs) פתחו את הדלת לחקר קרדיומיוציטים עם גנום המטופל כמודל במבחנה של קרדיומיופתיה. תאים אלה יכולים לשמש כדי להבין את הפתופיזיולוגיה של מחלות לב, כדי לרהור המנגנונים המולקולריים שלהם, ולבדוק מועמדים טיפוליים שונים3. יש כמות עצומה של עניין, ולכן, תאי iPS שמקורם בחולה נוצרו (למשל, קרדיומיופתיה היפרטרופית [HCM]4,5 , הפרעות קצבקרדיומיופתיהחדרית ימנית [ARVC]6, קרדיומיופתיה המורחבת [DCM]7,וקרדיומיופתיות הקשורות למיטוכונדריה8,9). כי אחד המאפיינים של קרדיומיופתיה הוא תפקוד לקוי ושיבוש של sarcomeres, כלי תקף המודד באופן אחיד פונקציה sarcomere יש צורך.
קיצור Sarcomere היא הטכניקה הנפוצה ביותר להערכת תפקוד sarcomere ואת התכווצות של cardiomyocytes למבוגרים נגזר מודלים בעלי חיים ובני אדם. כדי לבצע קיצור סרקומרים, נדרשים סרקומרים מפותחים הנראים תחת ניגודיות פאזה. עם זאת, PSC-CMs מתורבתים במבחנה להציג סרקומרים מפותחים ולא מאורגנים, ולכן, אינם יכולים לשמש כדי למדוד כראוי sarcomere קיצור10. קושי זה להעריך כראוי את התכווצות של PSC-CMs מעכב את השימוש בהם כפלטפורמה להערכת תפקודי הלב במבחנה. כדי להעריך התכווצות PSC-CMs בעקיפין, מיקרוסקופיה כוח אטומי, מערכי מיקרו-פוסט, מיקרוסקופיה כוח המתיחה, ומדידות עקיפה שימשו למדידת ההשפעות של התנועה המופעלת על ידי תאים אלה על סביבתם11,12,13. הקלטות וידאו-מיקרוסקופיה מתוחכמות יותר ופחות פולשניות של תנועה תאית בפועל (למשל, SI8000 מ- SONY) יכולות לשמש לחילופין כדי להעריך את החוזה שלהם, עם זאת, שיטה זו אינה מודדת ישירות תנועה סרקומרית או קינטיקה של יצירת כוח14.
כדי למדוד ישירות את תנועת הסרקומורה ב- PSC-CMs, מתגלות גישות חדשות, כגון תיוג פלואורסצנטי לחלבון סרקומר. לדוגמה, Lifeact משמש לתיוג actin filamentous (F-actin) כדי למדוד תנועת סרקומר15,16. תאי IPS מהונדסים גנטית הם אפשרות נוספת לתיוג חלבוני סרקומר (למשל, α-אקטינין [ACTN2] ומיומיסין-2 [MYOM2]) על ידי חלבון פלואורסצנטי17,18,19.
במאמר זה, אנו מתארים כיצד לבצע הדמיה בזמן לשגות למדידת קיצור סרקומר באמצעות Myom2-TagRFP (תאי גזע עוברי עכבר [ES] ) ו ACTN2-mCherry (תאי IPS אנושיים). אנו גם מראים שתרבות בדוגמת דפוס מקלה על יישור סרקומר. בנוסף, אנו מתארים שיטה חלופית של תיוג סרקומר, באמצעות וירוסים הקשורים לאדנו (AAVs), אשר ניתן ליישם באופן נרחב על תאי iPS שמקורם בחולה.
Protocol
Representative Results
Discussion
PSC-CMs יש פוטנציאל גדול להיות מנוצל כפלטפורמת מביהה כדי מודל מחלות לב ולבדוק את ההשפעות של תרופות. עם זאת, יש לקבוע תחילה שיטה מדויקת ומאוחדת להערכת פונקציות PSC-CMs. רוב הבדיקות התפקודיות עובדות עם PSC-CMs, למשל, אלקטרופיזיולוגיה, סידן ארעי, ומטבוליזם26, ואחד המחקרים הראשונים שמקו…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לכל חברי המעבדה באגף לרפואה רגנרטיבית באוניברסיטה הרפואית ג’יצ’י על הדיון המועיל והסיוע הטכני. מחקר זה נתמך על ידי המענקים של הסוכנות היפנית למחקר ופיתוח רפואי (AMED; JP18bm0704012 ו JP20bm0804018), האגודה היפנית לקידום המדע (JSPS; JP19KK0219), וחברת התפוצה היפנית (המענק למחקר בסיסי) ל- H.U.
Materials
| 1-Thioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145-25 | |
| 2-Mercaptoethanol (55mM) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | |
| 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine (MPC) polymer, | NOF Corp. | LIPIDURE-CM5206 | |
| 2-Propanol | Fujifilm wako | 166-04836 | |
| 35-mm imaging dish with a polymer coverslip (µ-Dish 35 mm, high) | ibidi | 81156 | |
| AAVproR Helper Free System (AAV6) (vectors; pHelper, pRC6, pAAV-CMV-Vector) |
Takara | 6651 | |
| ACTN2-mCherry (AR12, AR21) hiPSCs | N.A. | We inserted IRES-puromycin resistant casette to 3' UTR of TNNT2 locus and mCherry around the stop codon of ACTN2 in 610B1 hiPSC line, following a method describe elsewhere (Anzai, Methods Mol Biol, in press) | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| B-27 Supplement, minus insulin | Thermo Fisher Scientific | A18956-01 | |
| B27 supplement (50X), minus Vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587-010 | |
| Benzonase (25 U/µL) | Merck Millipore | 70746 | |
| Blasticidin S Hydrochloride | Fujifilm wako | 029-18701 | |
| BMP-4, Human, Recombinant, | R&D Systems, Inc. | 314-BP-010 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A4503-100g | |
| C59, Wnt Antagonist (WntC59) | abcam | ab142216 | |
| CAD drawing software, | Robert McNeel and Associates, WA, USA | Rhinoceros 6.0 | |
| Centrifugal ultrafiltration unit (100k MWCO), Vivaspin-20 | Sartorius | VS2042 | |
| CHIR99021 | Cayman | 13122 | |
| Chromium etchant | Nihon Kagaku Sangyo Co., Ltd., Japan | N14B | |
| Chromium mask coated with AZP1350 | Clean Surface Technology Co., Japan | CBL2506Bu-AZP | |
| Dr. GenTLE Precipitation Carrier (20mg/mL Glycogen, 3 M Sodium Acetate (pH 5.2)) | Takara | 9094 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) – high glucose | Sigma-Aldrich | D6429-500 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) – high glucose, without sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Ethanol (99.5) | Fujifilm wako | 057-00456 | |
| Fetal Bovine Serum | Moregate | 59301104 | |
| FGF-10, Human, Recombinant, | R&D Systems, Inc. | 345-FG-025 | |
| Fibroblast Growth Factor(basic), human, recombinant | Fujifilm wako | 060-04543 | |
| Gelatin from porcine skin powder | Sigma-Aldrich | G1890-100g | |
| Glasgow Minimum Essential Medium (GMEM) | Sigma-Aldrich | G5154-500 | |
| GLASS BOTTOM culture plates | MatTek | P24G-1.5-13-F/H | |
| Ham’s F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11765-062 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Thermo Fisher Scientific | 12440-061 | |
| L-alanine-L-glutamine (GlutaMAX Supplement, 200mM) | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| L(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt | Fujifilm wako | 196-01252 | |
| Laminin-511 E8 fragment (LN511-E8, iMatrix-511) | Nippi | 892012 | |
| Mask aligner | Union Optical Co., Ltd., Japan | PEM-800 | |
| Maskless lithography tool | NanoSystem Solutions, Inc., Japan | D-Light DL-1000 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF (0.45-µm filter) | Merck Millipore | SLHVR33RS | |
| Myom2-RFP (SMM18) | N.A. | Developed in our previous paper (Chanthra, Sci Rep, 2020) | |
| N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| ORCA-Flash4.0 V3 digital CMOS camera | Hamamatsu | C13440-20CU | |
| PD0325901 | Stemgent | 04-0006-10 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Petri dish | Sansei medical co. Ltd | 01-004 | |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1) | Nippon Gene | 311-90151 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) elastomer | Dow Corning Corp., MI, USA | SILPOT 184 | |
| polyethylenimine MAX (MW. 40,000) | Polyscience | 24765-1 | |
| Positive photoresist developer | Tokyo Ohka Kogyo Co., Ltd., Japan | NMD-3 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | |
| Proteinase K | Takara | 9034 | |
| Puromycin Dihydrochloride | Fujifilm wako | 166-23153 | |
| Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A Protein | R&D Systems, Inc. | 338-AC-050 | |
| Recombinant trypsin-like protease (rTrypsin; TrypLE express) | Thermo Fisher Scientific | 12604-039 | |
| RPMI1640 Medium | Thermo Fisher Scientific | 11875-119 | |
| Silicon wafer | Matsuzaki Seisakusyo Co., Ltd., Japan | N.A. | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
| Spin-coater | Mikasa Co., Ltd., Japan | MS-A100 | |
| Spininng confocal microscopy | Oxford Instruments | Andor Dragonfly Spinning Disk System | |
| StemSure LIF, Mouse, recombinant, Solution (10^6U) | Fujifilm wako | 195-16053 | |
| SU-8 3010 | Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA | SU-8 3010 | |
| SU-8 developer | Kayaku Advanced Materials, Inc., MA, USA | SU-8 developer | |
| Tris-EDTA | Nippon Gene | 314-90021 | |
| Vascular Endothelial Growth Factor-A165(VEGF), Human, recombinant | Fujifilm wako | 226-01781 |
Referências
- Mensah, G. A., Roth, G. A., Fuster, V. The Global Burden of Cardiovascular Diseases and Risk Factors. Journal of the American College of Cardiology. 74 (20), 2529-2532 (2019).
- Wexler, R. K., Elton, T., Pleister, A., Feldman, D. Cardiomyopathy: an overview. American Family Physician. 79 (9), 778-784 (2009).
- Parrotta, E. I., Lucchino, V., Scaramuzzino, L., Scalise, S., Cuda, G. Modeling Cardiac Disease Mechanisms Using Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes: Progress, Promises and Challenges. International Journal of Molecular Sciences. , 30 (2020).
- Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).
- Lan, F., et al. Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).
- Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494 (7435), 105-110 (2013).
- Gramlich, M., et al. Antisense-mediated exon skipping: a therapeutic strategy for titin-based dilated cardiomyopathy. EMBO Molecular Medicine. 7 (5), 562-576 (2015).
- Wang, G., et al. Modeling the mitochondrial cardiomyopathy of Barth syndrome with induced pluripotent stem cell and heart-on-chip technologies. Nature Medicine. 20 (6), 616-623 (2014).
- Li, S., et al. Mitochondrial Dysfunctions Contribute to Hypertrophic Cardiomyopathy in Patient iPSC-Derived Cardiomyocytes with MT-RNR2 Mutation. Stem Cell Reports. 10 (3), 808-821 (2018).
- Cho, G. -. S., et al. Neonatal Transplantation Confers Maturation of PSC-Derived Cardiomyocytes Conducive to Modeling Cardiomyopathy. Cell Reports. 18 (2), 571-582 (2017).
- Yang, X., et al. Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 296-304 (2014).
- Ribeiro, A. J. S., et al. Multi-Imaging Method to Assay the Contractile Mechanical Output of Micropatterned Human iPSC-Derived Cardiac Myocytes. Circulation Research. 120 (10), 1572-1583 (2017).
- Sewanan, L. R., Campbell, S. G. Modelling sarcomeric cardiomyopathies with human cardiomyocytes derived from induced pluripotent stem cells. The Journal of Physiology. 598 (14), 2909-2922 (2020).
- Kopljar, I., et al. Chronic drug-induced effects on contractile motion properties and cardiac biomarkers in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. British Journal of Pharmacology. 174 (21), 3766-3779 (2017).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
- Ribeiro, A. J. S., et al. Contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (41), 12705-12710 (2015).
- Roberts, B., et al. Fluorescent Gene Tagging of Transcriptionally Silent Genes in hiPSCs. Stem Cell Reports. 12 (5), 1145-1158 (2019).
- Chanthra, N., et al. A Novel Fluorescent Reporter System Identifies Laminin-511/521 as Potent Regulators of Cardiomyocyte Maturation. Scientific Reports. 10 (1), 4249 (2020).
- Ribeiro, M. C., et al. A cardiomyocyte show of force: A fluorescent alpha-actinin reporter line sheds light on human cardiomyocyte contractility versus substrate stiffness. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 141, 54-64 (2020).
- Yamanaka, S., Zahanich, I., Wersto, R. P., Boheler, K. R. Enhanced Proliferation of Monolayer Cultures of Embryonic Stem (ES) Cell-Derived Cardiomyocytes Following Acute Loss of Retinoblastoma. PLoS ONE. 3 (12), 3896 (2008).
- Miyazaki, T., Isobe, T., Nakatsuji, N., Suemori, H. Efficient Adhesion Culture of Human Pluripotent Stem Cells Using Laminin Fragments in an Uncoated Manner. Scientific Reports. 7 (1), 41165 (2017).
- Prasad, K. -. M. R., Xu, Y., Yang, Z., Acton, S. T., French, B. A. Robust cardiomyocyte-specific gene expression following systemic injection of AAV: in vivo gene delivery follows a Poisson distribution. Gene Therapy. 18 (1), 43-52 (2011).
- Arakawa, H., et al. Protein evolution by hypermutation and selection in the B cell line DT40. Nucleic Acids Research. 36 (1), e1 (2007).
- Konno, A., Hirai, H. Efficient whole brain transduction by systemic infusion of minimally purified AAV-PHP.eB. Journal of Neuroscience Methods. 346, 108914 (2020).
- Anzai, T., et al., Yoshida, Y., et al. Generation of Efficient Knock-in Mouse and Human Pluripotent Stem Cells Using CRISPR-Cas9. Methods of Molecular Biology. , (2020).
- Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. A Brief Review of Current Maturation Methods for Human Induced Pluripotent Stem Cells-Derived Cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).
- Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).
- Flores, L. R., Keeling, M. C., Zhang, X., Sliogeryte, K., Gavara, N. Lifeact-GFP alters F-actin organization, cellular morphology and biophysical behaviour. Scientific Reports. 9 (1), 3241 (2019).
- Sparrow, A. J., et al. Measurement of Myofilament-Localized Calcium Dynamics in Adult Cardiomyocytes and the Effect of Hypertrophic Cardiomyopathy Mutations. Circulation Research. 124 (8), 1228-1239 (2019).
