Summary
Detaljerte instruksjoner er gitt for å bygge et åpen kildekode, modulært fluorimeter som er kompatibelt med mange rimelige varmeovner for å utføre sanntids kvantitativ isotermisk kjernesyreforsterkning.
Abstract
Tradisjonelle metoder for å oppdage og kvantifisere nukleinsyrer er avhengige av polymerasekjedereaksjon (PCR) og krever bruk av dyre termosyklere med integrert fluorescensdeteksjon av amlikoner. Isotermiske nukleinsyreforsterkningsteknologier eliminerer behovet for termisk sykling; Fluorescensbasert deteksjon av produkter er imidlertid fortsatt nødvendig for kvantitative resultater i sanntid. Flere bærbare isotermiske varmeovner med integrert fluorescensdeteksjon er nå kommersielt tilgjengelige; Kostnadene for disse enhetene er imidlertid fortsatt en betydelig barriere for utbredt adopsjon i ressursbegrensede innstillinger. Beskrevet her er en protokoll for design og montering av et modulært, rimelig fluorimeter konstruert av hyllekomponenter. Fluororimeteret er omsluttet av et kompakt 3D-trykt hus, og er designet for å plasseres på toppen av en kommersielt tilgjengelig varmeblokk som holder et PCR-rør. Fluororimeteret som er beskrevet her ble optimalisert for å oppdage fluorescein isothiocyanate (FITC) fargestoff, men systemet kan modifiseres for bruk med fargestoffer som vanligvis brukes som reportere i sanntid nukleinsyreforsterkningsreaksjoner. Klinisk anvendbarhet av systemet er demonstrert ved å utføre sanntids nukleinsyredeteksjon med to isotermiske forsterkningsteknologier: rekombinin polymeraseforsterkning (RPA) for påvisning av positiv kontroll DNA gitt i et kommersielt sett og omvendt transkripsjonssløyfemediert isotermisk forsterkning (RT-LAMP) for påvisning av klinisk meningsfulle nivåer av SARS-CoV-2 RNA.
Introduction
Isotermiske forsterkningsteknologier er mye brukt til påvisning av nukleinsyrer. Sammenlignet med tradisjonelle PCR-tilnærminger som krever termocycling, tillater isotermisk forsterkning nukleinsyreforsterkning ved en enkelt temperatur, og muliggjør dermed raskere tid til resultater og bedre toleranse for hemmere1,2. En annen viktig fordel med isotermisk forsterkning er redusert instrumenteringskompleksitet. De fleste isotermiske forsterkningsreaksjoner krever bare en varmeblokk og en deteksjonsmodalitet- enten sanntidsdeteksjon via fluorescensovervåking eller endepunktdeteksjon, for eksempel ved lateral strømning eller gelelektroforese3,4. Fluorescensdeteksjon i sanntid oppnås gjennom påvisning av fluorescens produsert ved å interkalere fargestoffer som aktiveres i nærvær av dobbeltstrenget DNA eller slukkede fluorescerende sonder som aktiveres i nærvær av spesifikke dobbeltstrengede DNA-sekvenser.
Mens kommersielt tilgjengelige stasjonære isotermiske fluormålere eksisterer, mangler mange tilpasning for analyseimplementering. Mange enheter krever for eksempel bestemte forbruksvarer eller forbruksvarer som leveres av firmaet, anbefaler foretrukne leverandører eller bruker proprietær programvare for å oppnå annonserte resultater. De fleste av disse systemene koster over $ 5,000 USD, noe som representerer en betydelig barriere for utbredt bruk i ressursbegrensede innstillinger. I tillegg har brukere med lavressursinnstillinger utfordringer med å vedlikeholde utstyr som er utformet for innstillinger med høy ressurs på grunn av tøffe miljøforhold, svake forsyningskjeder for reservedeler og spesialiserte verktøy som kreves for vedlikehold og reparasjon5. For å møte dette behovet, beskrevet her er design og montering av et modulært og rimelig fluororimeter konstruert av hyllekomponenter vedlagt i et kompakt 3D-trykt hus (Figur 1A-C) med to valgfrie konfigurasjoner. Den første konfigurasjonen av denne enheten bruker kommersielt tilgjengelige glassfiltre og et dikroisk speil for å blokkere overflødig bakgrunnslys og har en total kostnad for montering på $ 830 USD. Selv om disse filtrene ofte brukes i fluorescensbaserte bildebehandlingssystemer, har det tidligere vist seg å erstatte dyre optiske filterfolier av høy kvalitet for å muliggjøre nukleinsyredeteksjon6. Den andre konfigurasjonen av fluorimeteret inkorporerer disse billige filtrene og erstatter de dikroiske speilene med φ1/2" bjelkesplittere, noe som reduserer den totale kostnaden for systemet fra $ 830 til $ 450 USD.
Representative bilder av samlingen vises for den første konfigurasjonen i figur 1 og figur 2, men analoge bilder for den andre konfigurasjonen finnes i Tilleggsfil 6. For å unngå behovet for spesialisert optisk justering har det optiske systemet utpekt områder for å plassere hver optisk komponent og kan gjøres med en relativt lav-end 3D-skriver, noe som gir utbredt bruk av designet. De eneste forskjellene i konstruksjon og montering for de to konfigurasjonene er filene som brukes til 3D-utskrift og de optiske komponentene plassert i kabinettet. De eksterne dimensjonene til det 3D-trykte kabinettet for begge systemene er de samme. En kostnadssammenligning av de to systemene vises i tabell 1.
Som vist i figur 1A, for å opprettholde en liten formfaktor, består fluororimeteret av Φ1/2" (~ 12,5 mm) optikk, kombinert med kompakt belysning og deteksjon som er plassert for å måle signal gjennom toppen av PCR-røret. Systemet i figur 1 er designet for å oppdage fargestoffer med topp eksitasjons- og utslippsbølgelengder nær henholdsvis 490 nm og 525 nm, inkludert FITC og nært beslektede fargestoffer som SYBR og SYTO-9, som ofte brukes som reportere i sanntid nukleinsyreforsterkningsreaksjoner7,8. Eksitasjonskilden, optiske filtre og detektoren kan lett erstattes av komponenter som er kompatible med forskjellige fluorescerende fargestoffer etter ønske. Nukleinsyreforsterkningsreaksjoner utføres vanligvis i PCR-rør, og fluorimeteret er designet for å plasseres på toppen av enhver kommersielt tilgjengelig varmeblokk som holder PCR-rør (Figur 1D) noe som muliggjør sanntidsovervåking av isotermiske reaksjoner. Passende varmeblokker er tilgjengelige i de fleste biomedisinske laboratorier og kan kjøpes for mindre enn $ 500 USD.
Bruk av enkeltkortsdatamaskiner for å gi et rimelig, pleiepunktalternativ for å kontrollere bildeteknologier har tidligere blitt demonstrert9. Ved å bygge av dette arbeidet, brukes et enkeltkorts datadrevet grafisk brukergrensesnitt (figur 1D) i denne protokollen til å lette datalogging i sanntid og visning av resultater på omsorgspunktet, noe som eliminerer behovet for at en bærbar datamaskin behandler eller visualiserer data. Fluorescensmålinger ble overført gjennom I2C-protokollen fra lyssensorene til en mikrokontroller, og deretter gjort tilgjengelig for enkeltkortdatamaskinen gjennom seriell kommunikasjon. Elektriske tilkoblinger for belysning og dataoverføring ble gitt gjennom forenklede ledninger og lodding på miniatyriserte brødplater, noe som negerte behovet for spesialiserte kretskort (PCB). Programvaren som kreves for å kjøre fluorimeteret er tilgjengelig gjennom programvarerammeverk med åpen kildekode, og koden som kreves for å kjøre enheten, leveres i tilleggskodingsfilene. Det komplette fluorimeteret kan monteres for mellom $ 450 til $ 830 USD, og resultatene viser at det gir nøyaktige og pålitelige fluorescensmålinger for å overvåke sanntids isotermisk forsterkning av nukleinsyrer.
Protocol
1. Forberedelsestrinn: 3D-utskrift og lodding
MERK: Det optiske systemet som er beskrevet i denne protokollen, er beregnet på en standard tørrblokkvarmer.
- Hvis du vil opprette den første konfigurasjonen, skriver 3D ut CAD-filene som er angitt som henholdsvis Tilleggsfiler 1, 2 og 3:
- Hvis du vil opprette den andre konfigurasjonen, skriver 3D ut CAD-filene som er angitt som henholdsvis Tilleggsfiler 3, 4 og 5:
MERK: Disse delene er utformet for å skrives ut med støtter. I denne guiden brukes en svart polykarbonatfilament som kan opprettholde sin form etter å ha blitt utsatt for temperaturer opp til 110 °C. Generelt kan ethvert materiale som kan oppvarmes til temperaturen på ønsket isotermisk reaksjon uten betydelig deformasjon brukes. For å minimere effekten av interne refleksjoner og omgivelseslysforstyrrelser, anbefales et materiale som er svart eller en annen mørk farge. - Klargjør de to lys-til-digital sensor evalueringsmodulene for parallell overvåking av to prøver. På et av sensortestkortene fjerner du R4-motstanden og lodder en jumperledning fra høyre pute på R4-området på PCB til toppputen i R1-området på PCB. Dette vil endre I2C-adressen til sensoren, og dermed tillate samtidig måling av begge sensorene.
MERK: Sensoren som brukes består av to PCB: et USB-adapterkort og et sensortestkort som inneholder lyssensoren; bare sensortestkortet er nødvendig for denne enheten. - Loddeledninger til hver av de to lysdiodene (lysdioder). Koble en rød ledning (positiv) til puten merket "1" på LED-lampen og en svart ledning (negativ) på puten merket "2" på LED-lampen. Påfør et tynt lag med termisk lim på baksiden av LED-lampen, plasser LED-lampen på toppen av en endehette, og vent til det termiske limet kurerer. På den andre siden av endehetten legger du til en kjøleribbe.
MERK: Når du tester lysdiodene før de er forseglet i kabinettet, må du sørge for å bruke riktig blått lys som blokkerer øyebeskyttelsen. - For å lage den andre konfigurasjonen, kutt to 1/4-tommers diameter sirkler fra et blått eksitasjonsfolieark og fire 1/4-tommers diameter sirkler fra et gult utslippsfolieark med saks eller et barberblad.
- Trykk en M2,5 sekskantet innsats inn i hvert av de fire hullene på den skrå delen av delen "LCD_Screen_Holder.stl".
2. Optisk montering
- Plasser en 3/16-tommers lang 4-40 gjenget innsats inn i hullet på toppen av delen "Optics_Enclosure_Bottom.stl". Plasser en 1/4-tommers lang 4-40 gjenget innsats i alle andre hull i den 3D-trykte delen, som vist i figur 2A.
- Sett sensortestkortet inn i husets øverste hulrom, med de fem pinnene vendt mot toppen og nærmest enhetens midtakse. Sikres med en 3/16-tommers lang 4-40 skrue gjennom hullet på sensortestkortet (Figur 2B).
- Plasser et av de 20 mm brennviddelinsene i avsnittet under sensortestkortet med den konvekse siden vendt mot bunnen av enheten og bort fra testkortet (Figur 2C).
- Hvis du vil opprette den første konfigurasjonen, plasserer du langpassfilteret i neste del under objektivet med 20 mm brennvidde (figur 2D) plassert i forrige trinn. For å opprette den andre konfigurasjonen, plasser to gule utslippsfilterfolier i delen under linsen.
- Hvis du vil opprette den første konfigurasjonen, plasserer du det dikroiske speilet i den diagonale delen nær midten av innkapslingen mens du observerer filterretningen som er angitt av produsenten (Figur 2E). For å opprette den andre konfigurasjonen, plasser strålesplitteren i den diagonale delen. Ingen spesifikk orientering er nødvendig for strålesplitteren.
- Plasser et annet objektiv på 20 mm brennvidde i avsnittet under det dikroiske speilet (eller strålesplitteren, avhengig av konfigurasjonen) med den konvekse siden pekende mot toppen av enheten (Figur 2F).
- Hvis du vil opprette den første konfigurasjonen, plasserer du eksitasjonsfilteret i delen til høyre for det dikroiske speilet, og kontrollerer at pilen peker mot det dikroiske speilet (Figur 2G). For å opprette den andre konfigurasjonen, plasser en blå eksitasjonsfilterfolie i delen til høyre for bjelkesplitteren.
- Plasser objektivet på 15 mm brennvidde til høyre for eksitasjonsfilteret med den konvekse siden vendt mot det dikroiske speilet (Figur 2H).
- Plasser en LED i den gjenværende delen av utskriften, med LED-lampen vendt mot det dikroiske speilet (eller strålesplitteren, avhengig av konfigurasjonen). Kontroller at de to ledningene som leder fra LED-lampen, er satt inn i de innfelte kanalene slik at utskriften lukkes tett.
- Gjenta trinn 2.3-2.9 for den andre siden av den 3D-trykte delen (Figur 2I).
- Lukk den tomme siden av utskriften på toppen av utskriften med de optiske komponentene ved å plassere de ekstruderte delene av den øverste halvdelen av innkapslingen i de innfelte sporene i den nederste halvdelen av innkapslingen. Fest de to utskrevne delene sammen med 3/8-tommers lange 4-40 skruer (Figur 2J).
MERK: Hvis de to utskrevne delene ikke er helt lukket, kan eksitasjonslyset slippe ut av det optiske huset. Sørg for at riktig blålysblokkerende øyebeskyttelse er slitt til en riktig forsegling er oppnådd. Eseal kabinettet til ingen overflødig lys unnslipper.
3. Montering av elektronikk og berøringsskjerm
- Koble de to minibrødplankene sammen, og plasser deretter mikrokontrolleren på et av brødbrettene. Kontroller at mikroUSB-porten på mikrokontrolleren vender utover.
- For å koble LED-modulasjonen kobler du CTL-pinnen til LED-driveren (+) til en digital pinne på mikrokontrolleren og LED-pinnen (-) på LED-driveren til en GND-pinne på mikrokontrolleren.
- Fjern plastdekslene på baksiden av brødplatene. Trykk den selvklebende underlaget på brødbrettene til den 3D-trykte delen for å feste de kombinerte brødplankene på innsiden av den bakre delen av den "LCD_Screen_Holder.stl"-trykte delen.
- Fest LCD-skjermholderen (Liquid Crystal Display) med de monterte brødplankene inni det optiske kabinettet montert i avsnitt 2 med en tomme lange 4-40 skruer.
- For å koble LED-strømforsyningen kobler du LED-pinnen (+) til LED-driveren til den positive ledningen til den første LED-lampen. Koble den negative ledningen til den første LED-lampen til den positive ledningen til den andre LED-lampen på brødplaten. Koble den negative ledningen til den andre LED-lampen til LED-pinnen (-) på LED-driveren.
MERK: Rekkefølgen på første eller andre LED er vilkårlig. - For å koble led-driverens strømforsyning, koble de positive og negative ledningene til 10 V strømforsyningen til henholdsvis VIN + og VIN-pinnene til LED-driveren. (En tønnekontakt til to-pinners adapter ble brukt.)
- Koble til sensorens testkortstrømforsyning og dataoverføring. Bare fire pinner på sensortestkortet brukes: SCK, SDA, VDUT og GND. Ta en 4-pinners hunn-til-hann jumper-ledning og koble disse pinnene på de lett-til-digitale sensortestkortene til minibrødbrettet gjennom åpningen øverst til høyre på LCD-holderutskriften.
- På brødplaten må du kontrollere at forbindelsene mellom følgende er på plass: mikrokontrollerens 3,3 V-pinne og VDUT-pinnen på begge testkortene; GND-pinnen på mikrokontrolleren og GND-pinnen på begge testkortene; den analoge 4 (A4) pinnen på mikrokontrolleren og SDA-pinnen på begge testkortene; og den analoge 5 (A5)-pinnen på mikrokontrolleren og SCK-pinnen på begge testkortene.
MERK: Fordi I2C-kommunikasjon brukes til lyssensorene, kan både SCK- og SDA-pinnene til begge sensorene rutes til de samme pinnene på mikrokontrolleren. - Fest enkeltkortdatamaskinen på LCD-skjermholderen med fire M2.5-skruer. Kontroller at HDMI- og strømadapterportene på den enkortede datamaskinen vender oppover, og at enkeltkortdatamaskinen er sentrert på den 3D-trykte delen.
- Koble berøringsskjermen til enkortsdatamaskinen i henhold til instruksjonene på berøringsskjermen, og koble deretter HDMI-porten på enkeltkortdatamaskinen til HDMI-porten på berøringsskjermen.
4. Programvareinstallasjon
- Installer og bruk webredigereren til å laste opp den tilpassede skissen "MiniFluorimeter_2Diode.ino" som finnes i Tilleggskodingsfil 1 til mikrokontrolleren. Kontroller at biblioteket ClosedCube OPT3002 er installert ved hjelp av Bibliotekbehandling.
- Endre variabelen led_A_pin til nummeret på den digitale pinnen som ble brukt i trinn 3.3 (delen Elektronikk og berøringsskjermenhet).
- Juster antall millisekunder LED-lampen slås på når fluorescensmålingene oppnås ved å endre verdien av variabelen ExposureTime. Juster antall millisekunder mellom LED-eksponeringer ved å endre verdien av variabelen led_A_Interval.
- Endre variabelen led_Power til et tall mellom null og ett for å justere lysstyrken på lysdiodene under eksponeringer. Null gir maksimal lysstyrke, og en gir lavest lysstyrke.
- Slå på muligheten til å kontrollere skjermen via berøringsskjerm ved å følge produsentens instruksjoner som følger med 3,5-tommers skjermen.
MERK: Hvis ønskelig, kan den 3,5-tommers skjermen brukes som en skjerm uten berøringsskjermfunksjoner, og et tastatur og en mus kan kobles til USB-portene på enkortsdatamaskinen for kontroll av enkeltkortdatamaskinen. - Last ned "MiniFluorimeter_2Diode_GUI.py" -filen fra Supplemental Coding File 2 til et ønsket sted på enkeltkortdatamaskinen.
- Kontroller at en fungerende versjon av Python er installert på den enkortde datamaskinen . Python 3.7 ble brukt i den medfølgende Python-modulen, men enhver stabil Python-versjon kunne brukes med passende endringer i det medfølgende skriptet. Installer bibliotekene som trengs for Python-programmet, på enkortdatamaskinen.
- Endre variabelen measurement_time til hvor lang tid det tar å ta målinger. Programmet avslutter anskaffelsen og lukkes etter at ønsket tid er utløpt. GUI tillater også at anskaffelse avsluttes via en knapp på brukergrensesnittet.
- Endre variabelen serialPort til den serielle adressen til den tilkoblede mikrokontrolleren.
5. Registrering av fluorescensdata i sanntid
- Slå på den kommersielle varmeblokken og la den nå ønsket temperatur.
- Forsyn den enkeltkortsdatamaskinen med en standard 5 V strømforsyning som følger med de fleste enkeltkorts datakjøp. Koble enkeltkortdatamaskinen til mikrokontrolleren med en microUSB til USB-kabel.
- Åpne det medfølgende Python-skriptet ved hjelp av berøringsskjermen. Endre variablene measurement_time og serialPort til de ønskede verdiene. Endre variabelen outputFilepath til navnet på datafilen programmet genererer. Kontroller at filnavnet slutter på .xlsx.
- Plasser to PCR-rør som inneholder reaksjonene som skal overvåkes i varmeblokken. Påse at plasseringen av PCR-rørene stemmer overens med fluororimeterets optiske kanaler når det er plassert på varmeblokken.
- Plasser fluororimeteret på toppen av varmeblokken med PCR-rørene sentrert mellom de fire pluggene som ekstruderer fra hver optiske kanal på fluormeteret. For optimale målinger, sørg for at det 3D-trykte fluormeteret er festet sikkert i brønnene i varmeblokken.
- Fest fluormåleren på en sikker måte, koble til strømforsyningsadapteren for lysdiodene.
- Bruk berøringsskjermen til å starte Python-programmet. Et grafisk brukergrensesnitt (GUI) vises på LCD-skjermen og måler sanntidsfluorescensen.
- Vær oppmerksom på sanntids fluorescensmålingene over tid for både PCR-rør som vises til brukeren på GUI.
- Etter at eksperimenttiden bestemt av brukeren har gått, opphører oppkjøpet. Vis målene i utdatadatafilen som er lagret på den brukerdefinerte plasseringen. For å avslutte målingene tidlig, klikk på knappen merket "Stopp anskaffelse" på brukergrensesnittet.
Representative Results
Når fluormålerytelsen er montert, kan den valideres ved å måle fluorescens fra en fortynningsserie med FITC-fargestoff. I figur 3Avises målinger av FITC-fargestoff ved konsentrasjoner på 0, 20, 40, 60 og 80 pg/μL fremstilt i 1x PBS på begge kanaler i den første konfigurasjonen av fluormeteret. Hver prøve ble målt tre ganger med en LED-eksponering på 1,5 s med 20 s intervaller. Begge kanalene på fluormeteret viser en lineær respons over ønsket område.
Klinisk anvendbarhet av fluormåleren ble videre demonstrert ved å bruke systemet sammen med en kommersielt tilgjengelig tørrvarmeblokk for å utføre forsterkning med to isotermiske forsterkningsteknologier: RPA og RT-LAMP.
Figur 3B viser baseline-trukket tidsforløp for fluorescens målt under 39 °C forsterkning av 50 μL sanntids RPA positive og negative kontrollreaksjoner for kit positiv kontroll DNA gitt i et standard kommersielt sett og utarbeidet i henhold til produsentens instruksjoner. RPA-reaksjoner, som gir et relativt lavt nivå av fluorescens, ble målt ved hjelp av den første konfigurasjonen av fluorimeteret som oppnår bedre undertrykkelse av eksitasjonslys.
Figur 3C viser tidskursmålingen av en tilpasset RT-LAMP-analyse ved 65 °C ved hjelp av N2-, E1- og As1e-primersettene beskrevet av Zhang et al10og Rabe og Cepko11. RT-LAMP-reaksjoner gir større fluorescens og ble målt ved hjelp av den andre, rimeligere fluormålerkonfigurasjonen. Oligonukleotider ble kjøpt og resuspendert i 2x TE-buffer ved en konsentrasjon på 1 mM. Fremover indre primer (FIP) og bakover indre primer (BIP) oligos ble bestilt med høy ytelse flytende kromatografi rensing. Hvert primersett (N2, E1, og As1e) ble kombinert for å lage 1000 μL av en 25x blanding som følger: 40 μL FIP, 40 μL BIP, 5 μL F3, 5 μL B3, 10 μL LF, 10 μL LB og 890 μL 1x TE buffer. For å montere hver RT-LAMP-reaksjon ble 1 μL av hvert primersett lagt til 0,5 μL 50x fluorescerende fargestoff og 12,5 μL 2x masterblanding og reaksjonsvolumet ble brakt opp til 20 μL med nukleasefritt vann i henhold til produsentens instruksjoner. SARS-CoV-2 RNA Control ble serielt fortynnet i nukleasefritt vann til konsentrasjoner på 10, 100 eller 1000 kopier per μL, og 5 μL ble tilsatt for et totalt reaksjonsvolum på 25 μL. Ingen målkontroll (NTC) som ble brukt i alle eksperimenter var nukleasefritt vann. RT-LAMP reaksjoner ble overlagt med 25 μL molekylærbiologisk mineralolje.
RPA- og RT-LAMP-reaksjoner ble montert i to brønner med en 0,2 ml lavprofils 8-rørs PCR-stripe og avkortet med ultraklede flate hetter. Hver RPA- og RT-LAMP-reaksjon ble kjørt i triplikat. I alle tester kvantifiserte mini-fluorimeteret vellykket den tidsmessige økningen av fluorescensnivåer forbundet med DNA-forsterkning.
Figur 1: Optisk hus og montert miniatyrfluorimeter på toppen av varmeblokken. (A) Diagram over optisk hus som viser optiske komponenter plassert i en deteksjonskanal. (B) Diagram over den første konfigurasjonen av miniatyrfluorimeteret etter montering. (C) Fotografi av det optiske huset med optiske komponenter plassert i en deteksjonskanal. (D) Fotografi av montert miniatyr fluorimeter plassert på toppen av en kommersielt tilgjengelig varmeblokk. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Monterings- og elektrisk kontrolldiagram over miniatyrfluorimeteret. A-J) Trinnvis plassering av de optiske komponentene i det 3D-trykte optiske huset for den første systemkonfigurasjonen. (K) Elektrisk diagram over miniatyrfluorimeteret for begge konfigurasjoner. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Representative målinger oppnådd med miniatyrfluorimeteret. (A) Målt fluorescens vs. FITC fargekonsentrasjon i begge kanaler viser lineær respons over ønsket dynamisk område. (B) Fluorescens i sanntid vs. tid for isotermisk forsterkning av positive og negative kontroller av et kommersielt tilgjengelig sett. Forsterkning skjer som forventet for den positive kontrollen. (C) Fluorescens i sanntid vs tid for isotermisk forsterkning av 50, 500 og 5000 kopier av SARS-CoV-2 RNA og en NTC-prøve fra en tilpasset RT-LAMP-analyse. Forsterkning skjer som forventet nær grensen for påvisning av analysen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| System 1 | System 2 | |||
| vare | kvantitet | Totalpris (USD) | kvantitet | Totalpris (USD) |
| Optiske komponenter | ||||
| Linser | 6 | 158.14 | 6 | 158.14 |
| Speil | 2 | 244.56 | 2 | 60 |
| Optiske filtre | 4 | 200 | 6 | 5 |
| Delsum | 602.7 | Delsum | 223.14 | |
| Belysning og deteksjon | ||||
| Lysdioder | 2 | 72.62 | 2 | 72.62 |
| LED-driver | 1 | 11.49 | 1 | 11.49 |
| Fotodiode | 2 | 50 | 2 | 50 |
| Delsum | 134.11 | Delsum | 134.11 | |
| Elektronikk og skjerm | ||||
| Arduino Nano | 1 | 20.7 | 1 | 20.7 |
| Bringebær Pi | 1 | 35 | 1 | 35 |
| LCD-skjerm | 1 | 25 | 1 | 25 |
| Mini brødbrett | 1 | 4 | 1 | 4 |
| 10V strømforsyning | 1 | 8.6 | 1 | 8.6 |
| Delsum | 93.3 | Delsum | 93.3 | |
| Total kostnad (USD) | 830.11 | 450.55 | ||
Tabell 1: Kostnadssammenligning av de to konfigurasjonene til miniatyrfluorimeteret.
Tilleggsfil 1: System1_Optics_Enclosure_Top.stl Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 2: System1_Optics_Enclosure_Bottom.stl, og klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 3: LCD_Screen_Holder.stl Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 4: System2_Optics_Enclosure_Top.stl Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 5: System2_Optics_Enclosure_Bottom.stl, og klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 6: System2_BuildInstructions.pdf Klikk her for å laste ned denne filen.
Ekstra kodefil 1: MiniFluorimeter_2Diode.ino Klikk her for å laste ned denne kodefilen.
Ekstra kodefil 2: MiniFluorimeter_2Diode_GUI.py Klikk her for å laste ned denne kodefilen.
Discussion
Beskrevet her er en åpen kildekode, rimelig, modulær, bærbar fluorimeter for kvantitativ fluorescensdeteksjon av isotermiske forsterkningsreaksjoner. Open source-prosjekter forenkler raskt og billig vedlikehold med lett tilgjengelige reservedeler og gir brukerne fleksibilitet til å tilpasse systemet til deres behov basert på modulær design. Denne protokollen beskriver prosessen med å montere mekaniske, optiske og elektriske komponenter og validere optisk ytelse. Videre ble fleksibiliteten til fluorimeteret til å overvåke to forskjellige typer isotermiske forsterkningsanalyser med betydelig forskjellige temperatur-, volum- og fluorescenskrav, RPA exo og RT-LAMP, demonstrert. RPA utføres ved 39 °C i 50 μL-reaksjoner som bruker en sekvensspesifikk FAM-merket sonde for fluorescensgenerering, mens RT-LAMP utføres ved 65 °C i et 25 μL reaksjonsvolum og bruker et interkalerende fargestoff for å rapportere tilstedeværelsen av det forsterkede DNA-et. Fordi fluorescensmålinger gjøres gjennom toppen av PCR-rør med flate hetter, er fluorimeteret i stand til å oppdage fluorescens fra begge analysevolumene, og varmekravene er bare begrenset av den kommersielle varmeblokken som er valgt. Videre er fluorescensintensiteten produsert i RT-LAMP nesten i størrelsesorden større enn den som produseres i RPA, på grunn av fargestoff- kontra sondebaserte metoder for fluorescenssignalgenerering. Det dynamiske området til den valgte optiske sensoren kan imidlertid oppdage og kvantifisere både signalene, og baseline subtraksjonsalgoritmer står for disse forskjellene for å produsere pålitelige fluorescensavlesninger.
For å lette teknologiformidling og minimere potensielle vedlikeholdskostnader, ble det brukt en modulær design som er kompatibel med varmeovner som er allment tilgjengelige i forskjellige omgivelser. I den nåværende protokollen ble det brukt en vanlig tørrblokkvarmer; den samme optiske og elektriske designen kan enkelt tilpasses andre kommersielt tilgjengelige varmeovner. Hvis en annen tørrblokkvarmer skal brukes, vil det være nødvendig med minimale endringer i 3D-husdesignet. Spesielt må bunnpinnene til de optiske kabinettet STL-filer endres for å sikre riktig justering med brønnene til andre kommersielle varmeblokker. Mens kapslingene som vises i eksemplene, ble skrevet ut på en relativt lav-end 3D-skriver (se Materialfortegnelse), bør det utvises forsiktighet for å sikre at skriveroppløsningen og/eller utskriftstoleransene er tilstrekkelige for å imøtekomme de optiske komponentene og gjengede innsatsene. I STL-filene som følger med, ble det lagt til en toleranse på 0,01-0,02 tommer på hver side av de optiske komponentene i radiale og aksiale retninger basert på dimensjonene som er angitt av produsenten. Dette sikrer at alle optiske komponenter passer godt innenfor utskriften, og at kabinettet helt blokkerer overflødig lys fra å komme inn eller ut. For å sikre en riktig pressetilpasning for de gjengede innsatsene, ble en lignende toleranse på 0,01-0,02 tommer trukket fra den produsentleverte diameteren i CAD-filen.
RPA-reaksjoner ble overvåket ved hjelp av den første fluormålerkonfigurasjonen, mens RT-LAMP-reaksjoner kunne overvåkes ved hjelp av begge konfigurasjonene. Den forbedrede stray light-avvisningen av den første konfigurasjonen var nødvendig for å overvåke de lave nivåene av fluorescens produsert av den fluorogene sonden i RPA-reaksjoner. I motsetning bruker RT-LAMP et interkalerende fargestoff for signalgenerering, noe som resulterer i en høyere fluorescensintensitet som er kompatibel med det nedre dynamiske området i den andre konfigurasjonen ved hjelp av fotografiske filterfolier. Brukere bør velge fluormålerkonfigurasjonen som samsvarer med fluorescenssignalet som genererer elementinterkalerende fargestoff eller fluorogen sonde i analysen.
En begrensning ved dette systemet er at oppvarming leveres av en kommersielt tilgjengelig varmeblokk drevet gjennom et standard vegguttak. Dette systemet kan videreutvikles for bruk i områder som mangler pålitelig tilgang til elektrisitet ved å inkorporere bærbare og oppladbare batteripakker som vist i andre grupper12. En annen begrensning er systemets relativt lave gjennomstrømning, noe som gir mulighet for samtidig fluorescensmåling av bare to prøver om gangen. Flere utskrifter av kabinettet kan plasseres på toppen av samme varmeblokk for å øke gjennomstrømningen; Lyssensoren som brukes, har imidlertid bare fire unike I2C-adresser. Dette begrenser maksimalt antall prøver som kan måles samtidig til fire. En annen lyssensor med et større antall unike I2C-adresser er nødvendig for å øke gjennomstrømningen ytterligere.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Spesiell takk til Chelsey Smith, Megan Chang, Emilie Newsham, Sai Paul og Christopher Goh for deres hjelp med prøveforberedelse. Forfatterne takker Caroline Noxon for manuskriptrevisjon. Støtten til dette arbeidet ble gitt fra det amerikanske folket av USAID gjennom et IAVI-forskningsstipend CCID 9204 under tildeling AID-OAA-A16-00032 mellom IAVI og USAID.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/4-inch-long 4-40 threaded insert | McMaster-Carr | 90742A116 | Used to secure the two sides of the 3D printed optical enclosure together. |
| 10v power supply | GlobTek, Inc. | WR9HU1800CCP-F(R6B) | AC/DC Wall Mount Adapter 10V 18W |
| 15 mm focal length lens | Thorlabs | LA 1074 | Two total are used for the fluorimeter. This lens is used to focus the LED illumination. |
| 1-inch-long 4-40 screws | McMaster-Carr | ||
| 20 mm focal length lens | Thorlabs | LA 1540 | Four total are used for the fluorimeter. |
| 2x WarmStart LAMP Master Mix | New England Biolabs, Inc | E1700 | Master mix was used to create the LAMP reactions shown in Figure 3C |
| 3.5” Touch Screen | Uctronics | BO10601 | |
| 3/16-inch-long 4-40 screw | McMaster-Carr | 90128A105 | |
| 3/16-inch-long 4-40 threaded insert | McMaster-Carr | 90742A115 | Used to secure the OPT3002 test board onto the 3D printed enclosure |
| 3/8-inch-long 4-40 screws | McMaster-Carr | 90128A108 | Used to secure the two sides of the 3D printed optical enclosure together. |
| 3D printer filament | 3D Universe | UMNFC-PC285-BLACK | Black or another dark color preferred |
| 3D printer used | Ultimaker | Ultimaker 2+ | |
| 8-tube PCR strips | BioRad | #TLS0801 | |
| Advanced Mini Dry Block Heater | VWR International | 10153-320 | The following heat blocks are acceptable substitutes without the need for redesigning the optical assembly: 949VWMNLUS, 949VWMHLUS, and 949VWMHLEU |
| barrel jack to two-pin adapter | SparkFun Electronics | 1568-1238-ND | |
| Blue Excitation Filter Foil | LEE | LE071S | Selected for use with FITC - other fluorescent dyes may require different filters. |
| Blue LED - 460 nm | Mouser | LZ1-30DB00-0100 | Selected for use with FITC - other fluorescent dyes may require different parts |
| Dichroic Mirror | Thorlabs | DMLP505T | Selected for use with FITC - other fluorescent dyes may require different parts |
| Emission Filter | Edmunds Optics | OG-515 | Selected for use with FITC - other fluorescent dyes may require different parts. The arrow on the part points away from the illumination source. |
| Excitation Filter | Omega Filters | 490AESP | Selected for use with FITC - other fluorescent dyes may require different parts |
| LED Driver | LEDdynamics | 3021-D-I-700 | |
| M2.5 Hex Shaped insert | McMaster-Carr | 91292A009 | Used to secure the Raspberry Pi to the 3D printed LCD Screen Holder |
| Microcontroller | Arduino | Nano | |
| Mini Breadboard | Adafruit | 65 | |
| Molecular biology-grade mineral oil | Sigma Aldrich | 69794 | |
| OPT3002EVM - Light-to-Digital Sensor | Texas Instruments | OPT3002EVM: | Light-to-digital sensor used. Consists of two PCBs: a SM-USB_DIG board and the OPT3002 test board; only the OPT3002 test board is needed for this device. |
| Purchased oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | ||
| RPA kit positive control DNA | TwistDx Limited | CONTROL01DNAE | |
| SARS-CoV-2 RNA Control | Twist Biosciences | MN908947.3 | |
| Single board computer | Raspberry Pi | Raspberry Pi 3 | |
| TwistAmp RPA exo kit | TwistDx Limited | TAEXO02KIT | |
| Ultraclear flat caps | BioRad | #TCS0803 | |
| Yellow Emmission Filter Foil | LEE | LE767S | Selected for use with FITC - other fluorescent dyes may require different parts |
References
- Daher, R. K., Stewart, G., Boissinot, M., Bergeron, M. G. Recombinase polymerase amplification for diagnostic applications. Clinical Chemistry. 62 (7), 947-958 (2016).
- Yan, L., et al. Isothermal Amplified Detection of DNA and RNA. Molecular BioSystems. 10 (5), 970-1003 (2014).
- Giuffrida, M. C., Spoto, G. Integration of Isothermal Amplification Methods in Microfluidic Devices: Recent Advances. Biosensors and Bioelectronics. 90, 174-186 (2017).
- Gill, P., Ghaemi, A. Nucleic Acid Isothermal Amplification Technologies-A Review. Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids. 27 (3), 224-243 (2008).
- Richards-Kortum, R., Oden, M. Devices for Low-Resource Health Care. Science. 342 (6162), 1055-1057 (2013).
- Katzmeier, F., et al. A Low-Cost Fluorescence Reader for in vitro Transcription and Nucleic Acid Detection with Cas13a. PLOS One. 14 (12), e0220091 (2019).
- Safavieh, M., et al. Emerging Loop-Mediated Isothermal Amplification-Based Microchip and Microdevice Technologies for Nucleic Acid Detection. ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (3), 278-294 (2016).
- Monis, P. T., Giglio, S., Saint, C. P. Comparison of SYTO9 and SYBR Green I for Real-Time Polymerase Chain Reaction and Investigation of the Effect of Dye concentration on Amplifcation and DNA Melting Curve Analysis. Analytical Biochemistry. 340 (1), 24-34 (2005).
- Parra, S., et al. Development of Low-Cost Point-of-Care Technologies for Cervical Cancer Prevention Based on a Single-Board Computer. IEEE Journal of Translational Engineering in Health and Medicine. 8 (4300210), (2020).
- Zhang, Y., et al. Enhancing Colorimetric Loop-Mediated Isothermal Amplification Speed and Sensitivity with Guanidine Chloride. Biotechniques. 69 (3), 178-185 (2020).
- Rabe, B. A., Cepko, C. SARS-CoV-2 Detection Using an Isothermal Amplification Reaction and a Rapid, Inexpensive Protocol for Sample Inactivation and Purification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (39), 24450-24458 (2020).
- Snodgrass, R., et al. A Portable Device for Nucleic Acid Quantification Powered by Sunlight, a Flame or Electricity. Nature Biomedical Engineering. 2 (9), 657-665 (2018).
