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Biologia do Desenvolvimento

집단 운동 특성을 분석하기 위해 1차 마우스 배아 성 성 메센키메 세포의 격리 및 시간 경과 이미징

Published: February 13, 2021
doi:
10.3791/62151
, , ,
1Department of Anatomy and Cell Biology,University of Kansas Medical Center, 2Department of Biological Physics,Eotvos University

Summary

우리는 2차원 (2D) 성장 및 상처 복구 분석의 시간 경과 화상 진찰을 위한 1 차적인 마우스 배아 성 구형 중간엽 세포의 격리 그리고 문화를 위한 프로토콜을 제시합니다. 우리는 또한 세포 스트림 형성 및 방향 운동성을 결정하기 위하여 시간 경과 화상 진찰 데이터의 분석을 위한 방법론을 제공합니다.

Abstract

입맛의 발달은 혀 옆에 있는 양측 의 성술 선반의 수직 성장을 수반하는 역동적인 과정이며 혀 위의 고도 와 융합이 뒤따릅니다. 이 프로세스에 있는 결점은 갈라진 구개, 일반적인 출생 결함으로 이끌어 내습니다. 최근 연구에 따르면 성구 선반 고도에는 선반의 방향을 수직에서 수평으로 변환하는 리모델링 프로세스가 포함됩니다. 이 동적 리모델링에서 성구 선반 중간엽 세포의 역할은 연구하기 어려웠습니다. 시간 경과-이미징 기반 정량 분석은 최근 1차 마우스 배아 성 구종 중간엽(MEPM) 세포가 집단 운동으로 자가 조직할 수 있음을 보여주기 위해 사용되었습니다. 정량적 분석은 미각 고도 결함이있는 마우스 모델에서 돌연변이 MEPM 세포의 차이를 식별 할 수 있습니다. 이 논문은 E13.5 배아에서 MEPM 세포를 분리하고 배양하는 방법을 설명하며, 특히 시간 경과 이미징을 위해- 그리고 스트림 형성, 모양 정렬 및 방향의 지속성을 위한 측정을 포함하여 집단 운동의 다양한 세포 특성을 결정합니다. 그것은 MEPM 세포고도의 동적 과정에서 구성 선반 mesenchyme의 역할을 연구하기위한 프록시 모델 역할을 할 수 있음을 posit. 이러한 정량적 방법을 사용하면 두개골 면안면 분야의 조사관이 대조군 및 돌연변이 세포의 집단 운동 특성을 평가하고 비교할 수 있으며, 이는 팔성 선반 고도 동안 중간엽 리모델링에 대한 이해를 증대시깁니다. 더욱이, MEPM 세포는 일반적으로 집단 세포 운동의 조사를 위한 희소한 중간엽 세포 모형을 제공한다.

Introduction

미각 발달은 성기사 발생에 결함이 갈라진 입맛-고립된 케이스에서 또는 증후군1의수백의 일환으로 생기는 일반적인 출생 결함으로 이끌어 내면서 광범위하게 연구되고 있다1,2. 배아 입맛의 발달은 배아 조직의 운동과 융합을 수반하는 동적 과정입니다. 이 과정은 네 가지 주요 단계로 나눌 수 있습니다 : 1) 성술 선반의 유도, 2) 혀 옆에 있는 성구 선반의 수직 성장, 혀 위의 성구 선반의 3) 고도, 그리고 4) 중간선1,3,4에서성구 선반의 융합. 지난 수십 년 동안 많은 마우스 돌연변이체가갈라진 구개5,6,7,8을나타내는 것으로 확인되었습니다. 이러한 모델의 특성화는 성구 선반 유도, 증식 및 융합 단계의 결함을 나타내고 있습니다. 그러나, 성구 선반 고도 결함은 드물다. 따라서, 성구 선반 고도의 역학을 이해하는 것은 연구의 흥미로운 영역입니다.

성병 선반 고도 결함이있는 일부 마우스 돌연변이체의 신중한 분석은 성병 선반의 매우 전방 영역이 뒤집는 것처럼 보이는 것을 보여주는 현재 모델로 이어졌으며, 성골 선반의 수직적 또는 “리모델링”은 입맛1,3,4의중간에서 후방 부위로발생합니다. 9,10,11. 성구 선반의 내측 가장자리 상피는 이 리모델링에 필요한 신호를 시작하고, 이는 그 후 성구 선반 mesenchyme에 의해 구동됩니다. 최근, 많은 연구자들은 태아 선반(12,13)과관련된 일시적인 경구 접착력을 보여 마우스 모델에서 성구 선반 고도 지연을 확인했다. 중간엽 리모델링은 수평 방향으로 벌지를 만드는 세포의 재구성을 포함하며 동시에 수직 방향9,10,14에서성구 선반을 후퇴시킵니다. 성병 선반 고도 및 근본적인 중간엽 리모델링에 영향을 미치기 위해 제안된 여러 메커니즘 중세포증식(15,16,17,화학작용성 그라데이션18,및 세포외 매트릭스 구성요소19,20)이있다. 중요한 질문이 발생: Specc1l-결핍마우스에서 관찰된 성환 선반 고도 지연은 또한 부분적으로 성병 선반 리모델링의 결함으로 인해, 그리고 이 리모델링 결함은 1차 MEPM 세포의 행동에 본질적인 결함에서 나타날 수있는 21?

1차 MEPM 세포는 유전자 발현22,23,24,25,26, 27,28,29,및증식(30,31) 및 이주를 포함하는 몇 가지 연구를 위해 두개안면 분야에서 사용되어왔다. 그러나 집단 세포 행동 분석에 대한 것은 없습니다. MEPM 세포의 시간 경과 이미징은 MEPM 세포가 집단운동(21)의방향 이동 및 형성된 밀도 의존세포 스트림-특성을 표시한다는 것을 보여주기 위해 2D 배양 및 상처 수리 소약으로 수행되었다. 더욱이, Specc1l 돌연변이 세포는 더 좁은 세포 스트림을 형성하고 높게 가변적인 세포 이주 궤적을 보여주었습니다. 이러한 조정된 운동성의 부족은 Specc1l 돌연변이배아(13,21)의미각 고도 지연에 기여하는 것으로 여겨진다. 따라서, 1차 MEPM 세포를 이용한 이러한 비교적 간단한 작용체는 성술 선반 고도 동안 중간엽 리모델링을 연구하기 위한 프록시역할을 할 수 있다. 이 논문은 2D 및 상처 복구 분석을 위한 1차 MEPM 세포의 격리 및 배양뿐만 아니라 시간 경과 이미징 및 분석을 설명합니다.

Protocol

동물과 관련된 모든 실험은 KUMC 기관 동물 관리 및 사용 위원회가 승인 한 프로토콜로 수행되었으며 지침 및 규정에 따라 수행되었습니다 (프로토콜 번호 : 2018-2447). 1. 수확 E13.5 배아 CO2 흡입 챔버를 사용 하거나 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 된 절차에 의해 임신 한 여성 마우스를 안락사. 즉시 해부로 진행합니다. 피부와 복리료를 제거하…

Representative Results

성구 선반의 해부는 그림 1에설명되어 있습니다. 절개 순서는 조직의 미끄러짐을 최소화하도록 설계되었습니다. 머리제거(도 1A,B)에따라 아래턱이 제거됩니다(도1B,C). 머리의상부(도 1C,D)의절개는 거꾸로 배치할 때 조직을 안정화하기 위해 수행된다(도1E…

Discussion

성구 선반 고도는 수직에서 수평 리모델링 이벤트1,3,4,9,11을구성한다. 이 리모델링 과정은 성구 선반 중간엽 세포가 정성있게 행동하도록 요구한다고 가정합니다. 야생형 MEPM 세포를 가진 분석은 이 세포 행동이 본질적이고21의양수일 수 있다는 것을 보여?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 프로젝트는 국립 보건원 보조금 DE026172 (I.S.), GM102801 (A.C.)에 의해 부분적으로 지원되었다. I.S.는 또한 생물 의학 연구 우수성 센터 (COBRE) 보조금 (국립 일반 의학 연구소 P20 GM104936), 캔자스 IDeA 생체 의학 연구 우수 보조금 (국립 일반 의료 과학 P20 GM103418), 캔자스 지적 발달 장애 연구 센터 (KIDDRC) 보조금 (KIDDRC) 보조금 (KidDRC) 및 국립 보건 연구소 (키드 르 크)에 의해 부분적으로 지원되었다 HD090216).

Materials

Beaker, 250 mL (x2) Fisher Scientific FB-100-250
CO2 Matheson Gas UN1013
Conical tubes, 15 mL (x1) Midwest Scientific C15B
Debian operating system computational analysis of time-lapse images
Dulbecco's Modified Eagles Medium/High Glucose with 4 mM L-Glutamine and Sodium Pyruvate Cytiva Life Sciences SH30243.01
EtOH, 100% Decon Laboratories 2701
EVOS FL Auto ThermoFisher Scientific AMAFD1000
EVOS Onstage Incubator ThermoFisher Scientific AMC1000
EVOS Onstage Vessel Holder, Multi-Well Plates ThermoFisher Scientific AMEPVH028
Fetal Bovine Serum Corning 35-010-CV
Fine point #5 Stainless Steel Forceps (x2) Fine Science Tools 11295-10 Dissection
Instrument sterilizer bead bath Fine Science Tools 18000-45
Microcetrifuge tubes, 1.5mL Avant 2925
Micro-Dissecting Stainless Steel Scissors, Straight Roboz RS-5910 Dissection
NucBlue (Hoechst) Live Ready Probes ThermoFisher Scientific R37605
Penicillin Streptomycin Solution, 100x Corning 30-002-CI
Silicone Insert, 2-well Ibidi 80209
Small Perforated Stainless Steel Spoon Fine Science Tools MC17C Dissection
Spring Scissors, 4 mm Fine Science Tools 15018-10
Sterile 10 cm dishe(s) Corning 430293
Sterile 12-well plate(s) PR1MA 667512
Sterile 6-well plate(s) Thermo Fisher Scientific 140675
Sterile PBS Corning 21-031-CV
Sterile plastic bulb transfer pipette ThermoFisher Scientific 202-1S
Trypsin, 0.25% ThermoFisher Scientific 25200056
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Referências

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Keywords: Primary Mouse Embryonic Palatal Mesenchyme CellsTime-lapse ImagingCollective Movement AttributesPalatal Shelf ElevationCraniofacial FieldMesenchymal RemodelingEmbryonic Day 13.5Palatal ShellMEPM Culture MediumFine ForcepsStainless Steel ScissorsCell Isolation
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Goering, J. P., Isai, D. G., Czirok, A., Saadi, I. Isolation and Time-Lapse Imaging of Primary Mouse Embryonic Palatal Mesenchyme Cells to Analyze Collective Movement Attributes. J. Vis. Exp. (168), e62151, doi:10.3791/62151 (2021).
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