Summary
우리는 배아와 성인 마우스 혀의 상피 및 중간/ 결합 조직에서 대량의 고품질 단일 세포를 해리시키는 일반화 프로토콜을 개발했습니다.
Abstract
세포 해리는 개별 세포 수준 및/또는 세포 집단 수준에서의 연구를 위한 필수적인 절차였습니다(예를 들어, 단세포 RNA 염기서열 분석 및 1차 세포 배양). 가능한, 다량에 있는 건강한 세포를 산출하는 것은 중요합니다, 이렇게 하기 위하여 최적 조건은 조직에 달려 있습니다. 혀 상피 및 기본 중간 엽/결합 조직에 있는 세포 인구는 이질적이고 조직 구조물은 다른 지구및 다른 발달 단계에서 변화합니다. 우리는 초기 발달 [배아 일 12.5 (E12.5)] 및 젊은 성인 (8 주) 단계에서 마우스 혀 상피 및 중간/ 결합 조직에서 세포를 격리하기위한 프로토콜을 테스트했습니다. 상피와 근본적인 메센키메/결합 조직 사이의 깨끗한 분리는 쉽게 달성할 수 있었습니다. 그러나 세포를 추가처리 및 분리하고, 가능한 건강한 세포를 대량으로 산출하고, 효소 소화 완충제, 인큐베이션 시간 및 원심 분리 속도와 시간을 신중하게 선택하는 것이 중요합니다. 분리된 상피 또는 기본 메센키메/결합 조직의 배양은 37°C에서 30분 동안 트립신-EDTA0으로, 8분 동안 200 x g에서 원심분리로 이어져 높은 생존율(>90%)으로 세포의 높은 수율을 초래했습니다(>90%) 마우스 단계와 혀 부위에 관계없이. 더욱이, 우리는 배아와 성인 방언에서 해리된 상피 및 중간엽/결합 조직 세포 둘 다 세포 생존성의 유의한 감소 없이 적어도 3 시간 동안 세포 배양 기지를 둔 매체에서 살아남을 수 있었다는 것을 것을을 발견했습니다. 프로토콜은 초기 발달 (E12.5) 및 다른 조직 구획에서 세포 해리를 요구하는 젊은 성인 (8 주) 단계에서 마우스 혀에서 격리 된 세포의 준비를 필요로하는 연구에 유용 할 것이다.
Introduction
포유류 혀는 맛, 말하기 및 식품 가공에 중요한 복잡한 기관입니다. 그것은 메센키메 / 결합 조직에 의해 구획및 맛 유두와 미각을 포함하는 계층화 상피 시트에 의해 덮여 고도로 조직 된 조직의 여러 유형으로 구성되어 있습니다. 혀 상피와 중간엽/결합 조직 모두에서 세포 인구는 이질적이다. 혀에 있는 세포의 특정 모형의 기능 그리고 분포를 더 잘 이해하기 위하여는, 해리된 세포를 이용한 연구 결과가 필요합니다. 예를 들어, 단세포 RNA 시퀀싱은 개별 세포에서 전사 프로파일링을 위한 강력하고 높은 처리량 방법이며, 이는 단일 세포 해상도1,2,3,4에서복잡한 조직의 전사를 이해하도록 설계된다. 1차 세포 배양은미각5,6에대한 줄기/전구 세포의 기능 및 분화를 연구하는 유용한 도구로 입증되었다. 이러한 연구는 고품질 의 격리 된 세포 집단의 대량을 필요로 (예를 들어, 적절한 농도와 높은 생존력을 가진 충분한 총 세포 수).
따라서, 언어 조직의 다른 영역과 다른 발달 단계에서 세포를 분리 할 필요가있다. 현재, 혀 상피 및 기본 중간 엽/결합 조직에서 세포 해리에 사용할 수 있는 상세한 프로토콜이 없습니다. 여기서, 우리는 단세포 RNA 염기서열 분석 및 1차 줄기 세포 배양과 같은 살아있는 세포의 고품질을 요구하는 실험을 위해 세포를 준비하는 최적화된 세포 해리 방법을 보고합니다. 우리는 효소 소화 완충제, 부드러운 파이펫팅, 재서스펜션 배지 선택, 최적의 원심분리 시간 및 속도의 선택이 이러한 대량의 고품질 셀을 생성하는 데 중요하다는 것을 발견했습니다.
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Protocol
동물 사용 (연구 전반에 걸쳐 C57BL/6 마우스) 조지아 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 되었고 연구에 대 한 동물의 치료 및 사용에 대 한 건강 지침의 국가 학회에 따라 했다.
1. 동물 사용
참고: 마우스는 12시간/야간 주기하에서 조지아 대학의 동물 및 유제품 과학 부서의 동물 시설에서 사육되고 유지되었습니다.
- 배아 (E) 일 0.5로 마우스에서 질 플러그 검출의 날 정오를 지정합니다. 다음 실험을 위해 8주에 E12.5 및 산후 마우스에서 배아를 사용하십시오.
2. 실험 전 준비
참고: 이 프로토콜에 필요한 계측기는 재료 표에나열됩니다.
- 실험 전에 자동 클라이브 계측기. 실험 중에 비드 멸균제를 사용하여 기기를 살균합니다.
- 70% 에탄올 물티슈를 사용하여 수술 부위, 해부 현미경 및 생물 안전 캐비닛을 청소하십시오. 생물 안전 캐비닛의 자외선을 켜고 실험 절차 전에 20 분 동안 유지하십시오.
- 1:1 디스파제(5.0 mg/mL)와 콜라게나아제(2.0 mg/mL)의 효소 혼합물을 각각 2.5 및 1.0 mg/mL의 최종 농도로 준비하고 0.22 μm 주사기 필터7을사용하여 용액을 필터링한다.
- 성인 혀용 효소 혼합물 1mL 또는 특정 혀 부위(예: 후방 또는 전방 혀)를 위해 0.5mL를 준비합니다.
- 배아 혀를 위해 효소 혼합물 2mL를 준비합니다.
- 0.1 M PBS에서 2.5 % BSA의 10 mL을 만들고 1 mL 주사기 및 0.22 μm 주사기 필터를 사용하여 용액을 필터링하십시오.
- DMEM/F12에서 5%의 FBS 500 μL을 만듭니다.
- 10% FBS 및 1% BSA를 포함하는 DMEM/F12의 3mL을 만들고 1mL 주사기 및 0.22 μm 주사기 필터를 사용하여 용액을 필터링합니다.
3. 중간 엽/기본 결합 조직에서 혀 상피의 분리
- E12.5 마우스 혀의 중간에서 상피의 분리
- E12.5 배아를 운반하는 시간 초과 임신 한 여성 마우스를 CO2 챔버에 배치한 다음 자궁 경부 탈구를 합니다.
참고: E12.5의 마우스 배아는 임신한 암컷 마우스의 질 플러그를 발견한 후 12일 오후 12시(오후) 이후에 수집됩니다. - 수술 부위로 마우스를 이송합니다. 70% 에탄올을 사용하여 마우스 복부를 적시어 모피가 수술 부위에 들어가지 않도록 하십시오.
- 배아를 운반하는 자궁 뿔을 노출하기 위해 해부 가위를 사용하여 복부를 엽니 다. 해부 가위를 사용하여 자궁 뿔을 해부하고 100mm 문화 접시에 신선한 티로드의 용액 15mL로 전송합니다.
- 배아(도1A1)를해부하는 현미경으로 자궁 뿔에서 미니 가위와 미세포셉을 사용하여 해부한다.
- 미세한 집게를 사용하여 입 구멍을 넓게 조심스럽게 열고 미니 가위를 사용하여 하악에서 혀를 해부합니다(그림1A2).
- 100mm 배양 접시에 신선한 멸균 티로드의 용액 15mL를 사용하여 혀를 씻으시다.
- 디스파제(2.5 mg/mL)와 콜라게나아제(1.0 mg/mL)의 효소 혼합물을 35mm 배양 접시에 넣고 주걱과 미세포셉을 생체안전 캐비닛에 전달한다. 37 °C에서 20 분 동안 배양하십시오.
- 혀를 신선한 멸균 티로드용 액액을 100mm 배양 접시에 옮기고 미세한 집게를 사용하여 복부 측의 상피에서 메센키메를 부드럽게 제거합니다.
참고: 상피 시트는 인큐베이션 중에 기계적 힘없이 분리될 수 있습니다. - 100mm 배양 접시에 신선한 멸균 티로드의 용액의 15mL에 분리 된 상피와 메센키메를 두 번 세척하십시오.
참고: 디스파제 및 콜라게나아제의 활동은 세포 해리 절차(4.1단계)에서 EDTA에 의해 억제된다.
- E12.5 배아를 운반하는 시간 초과 임신 한 여성 마우스를 CO2 챔버에 배치한 다음 자궁 경부 탈구를 합니다.
- 성인 마우스의 기본 결합 조직에서 혀 상피의 분리
- 8주에 마우스를CO2 챔버에 배치하여 안락사합니다. 마우스가 호흡없이 안락사되어 있는지 확인하고 앞포 핀치 응답.
- 마우스를 수술 부위로 이송합니다. 70% 에탄올을 사용하여 마우스 머리를 적시면 모피가 구강안으로 들어가는 것을 방지합니다.
- 해부 가위를 사용하여 뺨을 따라 입의 모서리를 잘라 구강을 엽니다. 하악(그림 1B1)으로혀를 해부하고 플라스틱 랩층이있는 플라스틱 접시에 놓습니다.
- 외과 용 집게를 사용하여 해부 현미경으로 혀를 잡고, 후부 혀의 절삭 날(도 1B1,화살표)을 통해 혀의 하위 상피 공간에 해부 (2.5 mg /mL)와 콜라게나아제 (1.0 mg /mL)의 효소 혼합물을 주입합니다.
- 전방 및 후방 혀에서 조직 수집을 위해 전체 혀에 1mL의 효소 혼합물을 고르게 주입하십시오.
- 혀 팁에서 조직 수집을 위해 전방 혀에 국소적으로 효소 혼합물 0.5 mL을 주입하거나 주위 유두 조직 수집을 위한 후면 혀에 넣습니다.
참고 : 효소가 축적될 때 혀가 부풀어 오게됩니다(그림 1B2). 효소의 부드러운 주입은 압력을 손상으로부터 방지하고 혀에 가능한 한 많은 효소를 유지할 수 있습니다.
- 혀를 플라스틱 랩으로 감싸고 37°C에서 30분 동안 혀를 배양합니다.
- 미니 가위를 사용하여 혀 팁 및/또는 둘레 유두를 해부하고 주걱과 미세 한 집게를 사용하여 100mm 배양 접시에 15mL의 신선한 멸균 티로드 용액으로 조직을 전송하십시오.
- 미니 가위를 사용하여 효소 소화 하위 상피 공간에서 기본 결합 조직으로부터 상피를 분리합니다. 다운스트림 실험의 요구 사항에 따라 조직을 적절한 크기로 다듬습니다.
- 분리된 상피와 기본 결합 조직을 15mL의 신선한 멸균 티로드 용액을 100mm 배양 접시에 담아 두 번 씻으시다.
참고: 디스파제 및 콜라게나아제의 활동은 세포 해리 절차(4.1단계)에서 EDTA에 의해 억제된다.
4. 세포 해리
참고: 여기서 설명된 세포 해리 프로토콜은 E12.5 배아와 8주 된 마우스 모두에서 혀 상피 및 중간/결합 조직에 적용될 수 있다. 세포 현탁액의 동요 및 전송 중에 세포 손실을 줄이기 위해, pH 7.48에서0.1 M PBS에서 2.5 %의 BSA와 상용 낮은 보존 파이펫 팁 또는 미리 코팅 된 파이펫 팁을 사용합니다.
- 37°C에서 30분 동안 새로운 35mm 배양 접시에 0.25%의 트립신-EDTA의 3mL에 주걱 및 미세 집게를 사용하여 조직을 전송합니다. 1 mL 파이펫 팁으로 5 분마다 조직을 부드럽게 교반합니다.
참고: 절삭날이 해리된 세포를 물리적으로 손상시킬 수 있으므로 파이펫 팁을 잘라지 마십시오. - DMEM/F12에 5% FBS의 500 μL을 추가하여 반응을 멈추고 배지를 5mL 저결합 원심분리기로 이송합니다.
- 원심분리기 세포 현탁액은 실온에서 8분 동안 200 x g로 정지하고 상체를 제거합니다.
- 1mL 파이펫 팁을 사용하여 10% FBS 및 1% BSA를 함유한 DMEM/F12의 3mL에서 세포를 부드럽게 다시 중단하고 70 μm 세포 스트레이너를 사용하여 세포를 필터링한 다음 35 μm 셀 스트레이너를 사용한다.
- 원심분리기 세포 현탁액은 실온에서 8분 동안 200 x g로 현탁액. 대부분의 배지를 제거하고 50-300 μL을 세포를 다시 일시 중단하는 최종 부피로 둡니다.
참고: 단일 셀 현탁액의 최종 부피를 변경하여 다운스트림 실험의 요구 사항에 따라 셀 농도를 조정합니다.
5. 혈종계를 이용한 세포 계산 및 생존 가능성 테스트
참고: 측정 정확도를 향상시키기 위해 각 샘플에 대해 3개의 기술적 복제가 권장됩니다.
- 단일 셀 서스펜션의 5-10 μL을 동일한 볼륨의 Trypan blue로 부드럽게 혼합하고 혈류계에 추가합니다.
참고: 사용하기 전에 70% 에탄올을 사용하여 혈종계를 철저히 청소하십시오. 혈종계의 먼지 입자는 진한 파란색으로 염색되어 생존 가능성 테스트의 정확도에 영향을 미칩니다. 현미경의 밑에 혈구계를 확인하십시오. - 총 세포 수, 라이브 셀 수(흰색) 및 Trypanblue(그림 2,화살표)에 의해 염색된 죽은 세포(dark blue)의 수를 각각 4제곱으로 16개의그리드(그림 2)로계산하여 이미징 시스템을 사용하여 반전된 현미경을 사용한다.
- 셀 농도 계산:
세포 농도 =
- 생존 가능성을 계산합니다.
생존 가능성 =
- 생존 가능성을 계산합니다.
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Representative Results
기본 메센키메/결합 조직으로부터 혀 상피의 분리
배아 마우스 혀에서, 적당한 효소 소화 후에 하위 상피 공간에 있는 간격이 보입니다. 일부 혀의 상피 시트는 인큐베이션 중에 기계적 힘없이 분리됩니다.
성인 마우스 혀에서, 성공적인 효소 주입은 주입 된 영역(도 1B2)에서붓기에 의해 표시되며, 이는 효소가 혀에 의해 유지 될 수 있음을 시사한다. 바늘에 의한 중간및/또는 혀 상피 침투에 대한 불충분한 효소 및/또는 깊은 바늘 삽입은 주입 부위의 부분적 부종또는 전혀 붓지 유발하지 않습니다. 효소 소화 후, 적절한 효소 소화를 가진 근본적인 결합 조직은 느슨해지고 끈적거리게 됩니다. 상피 시트의 가장자리를 부드럽게 들어 올릴 때 상피 공간의 간격이 표시됩니다.
총 세포 수 및 생존가능성에 대한 세포 해리의 효과
4단계, E12.5 혀, 상피 시트, 그리고 혀의 상피 아래 바로 얇은 중간층이 각각 풀을 이루었다. 혈류계(그림2)를이용한 수동 셀 계수는 프로토콜이 상피 시트로부터 95.2%의 생존력을 가진 총 63,917세포를 산출한 것으로 나타났다(약 0.3mm2 크기당 크기). 혀)(도 1A3)및 총 294,333 세포는 폐장 (혀 당 크기 약 0.3 mm2)에서 96.3 %의 생존력을 갖는다(그림 1A4).
8주에 10개의 성인 혀를 사용하여 혀 팁의 상피 시트 조각(미각이 조밀하게 분포되는 곳), 외경 유두의 상피 시트, 그리고 유두의 상피 아래 결합 조직의 얇은 층이 각각 풀레이졌다. 혈세포계(도2)를이용한 수동 세포 수는 혀 팁의 상피 시트로부터 95.4%의 생존력을 가진 총 187,333세포를 산출한 것으로 나타났다(혀당 크기약 0.075 mm2), 총 544,000세포(그림 1B3),544,000세포 외피주 유두의 상피 시트로부터 96.3%(혀당 크기 약 0.1mm2) (그림 1B5)및 결합 조직(혀당 크기 약 0.1mm2)의 생존력을 가진 총 150,500세포(그림1B6).
그림 1. 세포 해리를 위한 조직 준비. A) E12.5 전체 배아(A1), 해부된 혀(A2)의 등쪽뷰, 상피 시트(A3)및 메센키메(A4)의 대표적인 이미지가 혀로부터 분리된다. B)성인 혀의 대표적인 이미지 (B1)및 효소 주입 후 (B2). 상피 시트(B3)와폐막(B4)의 등쪽 뷰와 혀 팁의 메센키메(B4) 및 상피 시트(B5) 및 원황 유두의 기본 결합 조직(B6)이있다. 스케일 바 :A 1,A3, A4, B1,B2에서1mm; A2에서200 μm; B3,B4, B5 및 B 6에서 100μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 혈종계에 시각화된 분리된 세포의 대표적인 이미지. A)E12.5에서 배아의 상피시트(A 1)및 메센키메(A2)로부터 분리된 세포. B)상피 시트로부터의 분리된 세포(B1)및 8주 에 서둘레의 기본 결합 조직 코어(B2). 오른쪽 상단 모서리에 증폭된 격자를 둘러싸는 대시 선이 있습니다. 화살표는 Trypan 파란색에 의해 얼룩 죽은 세포를 가리킵니다. 스케일 바: B1,B2,B3및 B4용100 μm; 오른쪽 상단 모서리에 있는 고출력 이미지용 25 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
현재까지, 혀 상피 및 기본 중간 엽/결합 조직에서 세포 해리에 사용할 수 있는 상세한 프로토콜이 없습니다. 이 현재 세포 해리 프로토콜은 높은 세포 생존가능성(>90%)을 가진 단일 세포 현탁액을 생성하는 재현 가능한 절차를 제공합니다. E12.5및 성인 마우스에서 고립된 세포가 크기가 다르더라도 태아 및 산후 단계에서 상피 시트 및 중간 엽/결합 조직을 포함한 마우스 혀 조직에서. 예를 들어, E12.5 마우스 혀의 상피 및 중간부에서 분리된 세포는 8주 된 마우스 혀에서 세포의 큰 가변성(작은 에서 큰 것)과 는 대조적으로 일관되고 작습니다. 높은 생존율(>90%)의 장점으로 분리된 세포의, 항복된 단세포 현탁액은 실행 가능한 세포의 고품질을 요구하는 다운스트림 실험을 용이하게 할 수 있다(예를 들어, 단세포 RNA 시퀀싱 및 1차 세포 배양).
세포의 높은 생존가능성을 보장하기 위해 주의 해야 합니다. 디스파제 와 콜라게나아제 혼합물을 가진 적절한 소화 시간은 실행 가능한 세포를 보존하면서 효과적으로 메센키메 / 기본 결합 조직에서 상피를 분리 할 수 있습니다. 배아 혀를 위한 20 분 잠복과 성인 혀를 위한 30 분 잠복이 좋습니다. 상피 시트는 효소 소화 후 쉽게 벗겨질 수 있지만, 분리를 위한 가위로 절단하는 것이 권장되며, 이는 혀 상피 의 기저 영역에서 줄기 세포 인구를 보존할 수 있다9. 트립신을 단독으로 0.25% 트립신-EDTA의 선택은 0.25% 트립신-EDTA가 세포를 보다 효율적으로 해리하고 트립신에 비해 분리세포를 유지할 수 있으므로 세포를 해리시키는 데 매우 권장됩니다. 세포 배양 기반 배지(DMEM/F12 함유 10% FBS 및 1% BSA)를 효소 소화 후 세포를 다시 일시 중단하는 것이 매우 중요하며 세포 현탁액 배지에 비해 격리된 세포의 생존가능성이 높은 데 기여합니다(예를 들어, 0.1 M PBS에서 1% BSA). 또한, 분리된 세포는 시간이 지남에 따라 이 매체에서 더 높은 생존율을 가지고 있습니다: 세포 생존가능성의 현저한 감소 없이 적어도 3h. 파이펫팅 기술은 높은 셀 생존가능성을 보장하는 또 다른 중요한 요소입니다. 피펫을 사용하여 체퍼를 부드럽게 흡입하고 세포를 다시 일시 중단하면 세포손실과 세포에 대한 물리적 손상을 줄일 수 있습니다.
단일 세포 현탁액에서 격리 된 세포의 농도는 다운스트림 실험에 대한 또 다른 중요한 고려 사항입니다. 총 주어진 세포 수에서, 세포 농도는 재중단 된 용액의 최종 볼륨에 따라 조정 될 수있다. 총 세포 수가 알려지지 않은 첫 번째 예심의 경우 격리 된 셀의 재중단이 낮은 부피에서 시작해야합니다. 그런 다음, 절연 된 세포는 다운스트림 실험의 요구 사항에 따라 희석 될 수있다. 참고로, 배양 배지 기반 용액에서 세포 응집체는 농도가 4000세포/μL(혈우세포계의 평방당 약 200세포)보다 높았을 때 발견되었습니다. 최적의 농도는 500에서 2500 세포/μL 범위입니다.
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Disclosures
이해 상충이 선언되지 않았습니다.
Acknowledgments
이 연구는 건강의 국가 학회에 의해 지원되었다, HXL에 R01DC012308 및 R21DC018089를 부여 번호. 우리는 브렛 마샬 (조지아 대학, 아테네, GA) 및 에곤 랑히니 (10 X 게놈, 플레전턴, 캘리포니아)에게 세포 해리에 관한 기술 적 지원 및 상담에 감사드립니다. 프란시스카 깁슨 번리 (조지아 대학, 아테네, 조지아) 영어 편집에 대한.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| bovine serum albumin (BSA) | Gold Biotechnology | A-420-100 | |
| C57BL/6 mouse (C57BL/6J) | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| collagenase (Collagenase A) | Sigma-Aldrich | 10103586001 | |
| culture dish (35 mm in diameter) | Genesee Scientific | 32-103G | |
| culture dish (100 mm in diameter) | Genesee Scientific | 32-107G | |
| dispase (Dispase II) | Sigma-Aldrich | 04942078001 | |
| dissecting scissors (Student Fine Scissors) | Find Science Tool | 91460-11 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | C838U82 | |
| fine forceps (Dumount #3 Forceps) | Find Science Tool | 11293-00 | |
| hemocytometer | Hausser Scientific | 3520 | |
| inverted microscope with imaging system (EVOS XL Core Cell Imaging System) | Life Technologies | AMEX1000 | |
| low retention pipette tips | METTLER TOLEDO | 17014342 | |
| mini-scissors (Evo Spring Scissors) | Fine Science Tool | 15800-01 | |
| plastic warp | VWR | 46610-056 | |
| spatula (Moria Spoon) | Fine Science Tool | 10321-08 | |
| surgical forceps (Dumount #2 Laminectomy Forceps) | Fine Science Tool | 11223-20 | |
| Trypan blue | Gibco | 15250061 | |
| Tyrode’s solution | Sigma-Aldrich | T2145-10L | made from Tyrode's salts |
| 0.25% typsin-EDTA | Gibco | 25200056 | |
| 0.1 M Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Hoefer | 33946 | made from 1 M PBS |
| 0.22-μm syringe filter | Genesee Scientific | 25-243 | |
| 70% ethanol | Koptec | 233919 | made from 100% ethanol |
| 1-mL syringe | BD | 8194938 | |
| 5-mL low binding microcentrifuge tube | Eppendorf | 30122348 | |
| 30-G needle | BD | 9193532 | |
| 35-μm cell strainer | Falcon | 64750 | |
| 70-μm cell strainer | Falcon | 64752 |
References
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