Co-culture de cellules souches de glioblastome sur des neurones à motifs pour étudier la migration et les interactions cellulaires
Summary
Ici, nous présentons un test de co-culture facile à utiliser pour analyser la migration du glioblastome (GBM) sur des neurones à motifs. Nous avons développé une macro dans le logiciel FiJi pour une quantification facile de la migration des cellules GBM sur les neurones, et avons observé que les neurones modifient la capacité invasive des cellules GBM.
Abstract
Les glioblastomes (GBM), gliomes malins de grade IV, sont l’un des types les plus mortels de cancer humain en raison de leurs caractéristiques agressives. En dépit des avances significatives dans la génétique de ces tumeurs, comment les cellules de GBM envahissent le parenchyme sain de cerveau n’est pas bien comprise. Notamment, on lui a montré que les cellules de GBM envahissent l’espace peritumoral par différentes voies ; l’intérêt principal de cet article est la route le long des étendues de matière blanche (WMTs). Les interactions des cellules tumorales avec les composants peritumoral nerveux de cellules ne sont pas bien caractérisées. Ici, une méthode a été décrite qui évalue l’impact des neurones sur l’invasion cellulaire gbm. Ce document présente une analyse in vitro avancée de co-culture qui imite l’invasion de WMT en analysant la migration de GBM tige-comme des cellules sur des neurones. Le comportement des cellules GBM en présence de neurones est surveillé à l’aide d’une procédure de suivi automatisée avec un logiciel open source et en accès libre. Cette méthode est utile pour de nombreuses applications, en particulier, pour des études fonctionnelles et mécanistes ainsi que pour l’analyse des effets des agents pharmacologiques qui peuvent bloquer la migration cellulaire GBM sur les neurones.
Introduction
Les gliomes malins primaires, y compris gbms, sont des tumeurs dévastatrices, avec un taux de survie moyen de 12 à 15 mois rapportés pour des patients de GBM. La thérapie courante se fonde sur la grande résection de masse de tumeur et la chimiothérapie couplées avec la radiothérapie, qui prolonge seulement le taux de survie de quelques mois. Les échecs thérapeutiques sont intimement liés à une mauvaise administration de médicaments à travers la barrière hémato-encéphalique (BHE) et à la croissance invasive dans les espaces périvasculaires, les méninges et le long desTMM 1. L’invasion périvasculaire, également appelée co-option vasculaire, est un processus bien étudié, et les mécanismes moléculaires commencent à être élucidés ; cependant, le processus de l’invasion de cellules gbm le long de WMTs n’est pas bien compris. Les cellules tumorales migrent dans le cerveau sain le long des structures secondaires de Scherer2. En effet, il y a près d’un siècle, Hans-Joachim Scherer a décrit les voies invasives de la GBM, qui sont maintenant appelées satellitosis périnéuronal, satellitosis périvasculaire, propagation subpial, et invasion le long de la WMT (Figure 1A).
Certaines chimiokines et leurs récepteurs, tels que le facteur 1α dérivé des cellules stromales (SDF1α) et le récepteur 4 des chimiokines à motif C-X-C (CXCR4), mais pas le facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF), semblent être impliqués dans l’invasion WMT3. Plus récemment, un axe transcellulaire NOTCH1-SOX2 s’est avéré être une voie importante dans l’invasion WMT des cellules GBM4. Les auteurs ont décrit comment les cellules souches gbm envahissent le parenchyme de cerveau sur des neurones partiellement unmyelinated, suggérant la destruction des gaines de myelin par des cellules de GBM. Une étape importante a été franchie en 2019 lorsque trois articles ont été publiés de manière concluante dans la revue Nature, soulignant le rôle de l’activité électrique dans le développement du gliome5,6. Les travaux fondateurs de Monje et de ses collaborateurs ont mis en lumière le rôle central de l’activité électrique dans la sécrétion de neuroligine-3, qui favorise le développement du gliome.
Winkler et ses collaborateurs ont décrit les connexions entre les cellules GBM (microtubes) étant cruciales dans les étapes invasives, et dernièrement, les interactions entre les cellules GBM et les neurones via les synapses de neurogliome nouvellement décrites. Ces structures favorisent la stimulation glutamatergique des récepteurs de l’acide α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) situés à la membrane cellulaire gbm, qui favorise le développement et l’invasion de tumeur. L’invasion de cellules de tumeur est un processus central dans la diffusion des métastases ou des foyers secondaires éloignés, comme observé dans des patients de GBM. Plusieurs facteurs ont été identifiés comme étant importants dans l’invasion du GBM tels que la thrombospondine-1, un facteur de croissance transformant bêta (protéine matricellulaire régulée par TGFβ, ou le récepteur de chimiokine CXCR3)7,8.
Ici, un modèle biomimétique simplifié a été décrit pour l’étude de l’invasion gbm, dans lequel les neurones sont modelés sur des pistes de laminine, et les cellules GBM sont ensemencées dessus, comme des cellules uniques ou comme des sphéroïdes (Figure 1B). Les deux décors expérimentaux visent à récapituler l’invasion sur les neurones, qui est observée dans GBM9,10,11. De tels modèles ont été développés dans le passé sous forme de biomatériaux en nanofibres alignés (électrofilage noyau-coquille) qui permettent d’étudier la migration cellulaire en modulant les propriétés mécaniques ou chimiques12. Le modèle de co-culture décrit dans cet article permet de mieux comprendre comment les cellules GBM s’échappent sur les neurones en définissant de nouvelles voies moléculaires impliquées dans ce processus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les glioblastomes envahissent largement le parenchyme en utilisant différents modes: cooptation des vaisseaux sanguins environnants, invasion interstitielle ou invasion sur wmts18. Ce dernier mode n’est pas bien caractérisé dans la littérature en raison de la difficulté à trouver des modèles in vitro ou in vivo appropriés liés à l’invasion de WMT. Ici, un modèle simplifié a été proposé dans lequel les neurones de rongeurs cultivés ont été modelés sur des su…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la Fondation ARC 2020, ligue contre le cancer (Comite de la Gironde), ARTC, Plan Cancer 2021, INCA PLBIO. Alveole est soutenu par l’Agence Nationale de la Recherche (Grant Labex BRAIN ANR-10-LABX-43). Joris Guyon est boursier du CHU Toulouse.
Materials
| (3-aminopropyl) triethoxysilane | Sigma | 440140-100ML | The amino group is useful for the bioconjugation of mPEG-SVA |
| 96-well round-bottom plate | Sarstedt | 2582624 | Used to prepare spheroids |
| Accutase | Gibco | A11105-01 | Stored at -20 °C (long-term) or 4 °C (short-term), sphere dissociation enzyme |
| B27 | Gibco | 12587 | Stored at -20 °C, defrost before use |
| Basic Fibroblast Growth Factor | Peprotech | 100-18B | Stored at -20 °C, defrost before use |
| Countess Cell Counting ChamberSlides | Invitrogen | C10283 | Used to cell counting |
| Coverslips | Marienfeld | 111580 | Cell culture substrate |
| Dessicator cartridges | Sigma | Z363456-6EA | Used to reduce mosture during (3-aminopropyl) triethoxysilane treatment |
| DPBS 10x | Pan Biotech | P04-53-500 | Stored at 4 °C |
| Fiji software, MTrack2 macro | ImageJ | Used to analyze pictures | |
| Flask 75 cm² | Falcon | 10497302 | |
| HBSS | Sigma | H8264-500ML | |
| Heparin sodium | Sigma | H3149-100KU | Stored at 4 °C |
| Laminin | 114956-81-9 | Promotes neuronal adhesion | |
| Leonardo software | loading of envisioned micropatterns | ||
| MetaMorph Software | Molecular Devices LLC | NA | Microscopy automation software |
| Methylcellulose | Sigma | M0512 | Diluted in NBM for a 2% final concentration |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | Stored at 4 °C |
| Nikon TiE (S Fluor, 20x/0.75 NA) | inverted microscope equipped with a motorized stage | ||
| Penicillin – Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Stored at 4 °C |
| PLPP | Alveole | PLPPclassic_1ml | Photoinitiator used to degrade the PEG brush |
| Poly(ethylene glycol)-Succinimidyl Valerate (mPEG-SVA) | Laysan Bio | VA-PEG-VA-5000-5g | Used as an anti-fouling coating |
| PRIMO | Alveole | PRIMO1 | Digital micromirror device (DMD)-based UV projection apparatus |
| Trypan blue 0.4% | ThermoFisher | T10282 | Used for cell counting |
| Trypsin-EDTA | Sigma | T4049-100ML | Used to detach adherent cells |
Referências
- Shergalis, A., Bankhead, A., Luesakul, U., Muangsin, N., Neamati, N. Current challenges and opportunities in treating glioblastoma. Pharmacology Reviews. 70, 412-445 (2018).
- Scherer, H. J. The forms of growth in gliomas and their practical significance. Brain. 63, 1-35 (1940).
- Zagzag, D., et al. Hypoxia- and vascular endothelial growth factor-induced stromal cell-derived factor-1α/CXCR4 expression in glioblastomas. American Journal of Pathology. 173, 545-560 (2008).
- Wang, J., et al. Invasion of white matter tracts by glioma stem cells is regulated by a NOTCH1-SOX2 positive-feedback loop. Nature Neurosciences. 22, 91-105 (2019).
- Venkataramani, V., et al. Glutamatergic synaptic input to glioma cells drives brain tumour progression. Nature. 573, 532-538 (2019).
- Venkatesh, H. S., et al. Electrical and synaptic integration of glioma into neural circuits. Nature. 573, 539-545 (2019).
- Boyé, K., et al. The role of CXCR3/LRP1 cross-talk in the invasion of primary brain tumors. Nature Communications. 8, 1571 (2017).
- Daubon, T., et al. Deciphering the complex role of thrombospondin-1 in glioblastoma development. Nature Communications. 10, 1146 (2019).
- Gritsenko, P. G., et al. p120-catenin-dependent collective brain infiltration by glioma cell networks. Nature Cell Biology. 22, 97-107 (2020).
- Guyon, J., et al. A 3D spheroid model for glioblastoma. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (158), (2020).
- Strale, P. O., et al. Multiprotein Printing by Light?Induced Molecular Adsorption. Advanced Materials. , (2015).
- Rao, S. S., et al. Mimicking white matter tract topography using core-shell electrospun nanofibers to examine migration of malignant brain tumors. Biomaterials. 34, 5181-5190 (2013).
- Visweshwaran, S. P., Maritzen, T. A simple 3D cellular chemotaxis assay and analysis workflow suitable for a wide range of migrating cells. MethodsX. 6, 2807-2821 (2019).
- Qian, H., Sheetz, M. P., Elson, E. L. Single particle tracking. Analysis of diffusion and flow in two-dimensional systems. Biophysics Journal. 60, 910-921 (1991).
- Pasturel, A., Strale, P. -. O., Studer, V. Tailoring common hydrogels into 3D cell culture templates. Advance Healthcare Materials. 9, 2000519 (2020).
- Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145, 831-834 (2011).
- Clark, A. J., et al. Co-cultures with stem cell-derived human sensory neurons reveal regulators of peripheral myelination. Brain. 140, 898-913 (2017).
- Linkous, A., et al. Modeling patient-derived glioblastoma with cerebral organoids. Cell Reports. 26, 3203-3211 (2019).
- Han, M., et al. Interfering with long non-coding RNA MIR22HG processing inhibits glioblastoma progression through suppression of Wnt/β-catenin signalling. Brain. 143, 512-530 (2020).
