Co-coltura di cellule simili a staminali di glioblastoma su neuroni modellati per studiare la migrazione e le interazioni cellulari

Summary

Qui presentiamo un saggio di co-coltura facile da usare per analizzare la migrazione del glioblastoma (GBM) sui neuroni modellati. Abbiamo sviluppato una macro nel software FiJi per una facile quantificazione della migrazione cellulare GBM sui neuroni, e abbiamo osservato che i neuroni modificano la capacità invasiva delle cellule GBM.

Abstract

I glioblastomi (GBM), gliomi maligni di IV grado, sono uno dei tipi più leciti di cancro umano a causa delle loro caratteristiche aggressive. Nonostante i significativi progressi nella genetica di questi tumori, come le cellule GBM invadano il parenchima cerebrale sano non è ben compreso. In particolare, è stato dimostrato che le cellule GBM invadono lo spazio peritumorale attraverso percorsi diversi; l’interesse principale di questo documento è il percorso lungo i tratti di materia bianca (WMT). Le interazioni delle cellule tumorali con i componenti delle cellule nervose peritumorali non sono ben caratterizzate. Qui è stato descritto un metodo che valuta l’impatto dei neuroni sull’invasione cellulare del GBM. Questo articolo presenta un saggio avanzato di co-coltura in vitro che imita l’invasione wmt analizzando la migrazione delle cellule staminali GBM sui neuroni. Il comportamento delle cellule GBM in presenza di neuroni viene monitorato utilizzando una procedura di tracciamento automatizzato con software open source e ad accesso libero. Questo metodo è utile per molte applicazioni, in particolare, per studi funzionali e meccanicistici nonché per analizzare gli effetti degli agenti farmacologici che possono bloccare la migrazione cellulare GBM sui neuroni.

Introduction

I gliomi maligni primari, compresi i GBM, sono tumori devastanti, con un tasso medio di sopravvivenza da 12 a 15 mesi riportato per i pazienti affetti da GBM. La terapia attuale si basa su una grande resezione della massa tumorale e sulla chemioterapia accoppiata alla radioterapia, che estende il tasso di sopravvivenza solo di pochi mesi. I fallimenti terapeutici sono intimamente correlati allo scarso parto di farmaci attraverso la barriera ematica (BBB) e alla crescita invasiva in spazi perivascolari, meningi e lungo le WMT¹. L’invasione perivascolare, chiamata anche co-opzione vascolare, è un processo ben studiato, e i meccanismi molecolari stanno iniziando ad essere chiariti; tuttavia, il processo di invasione cellulare GBM lungo le MMM non è ben compreso. Le cellule tumorali migrano nel cervello sano lungo le strutture secondarie^{2 di}Scherer . Infatti, quasi un secolo fa, Hans-Joachim Scherer descrisse le rotte invasive del GBM, che ora sono indicate come satellitosi perineuronale, satellitosi perivascolare, diffusione subpiale e invasione lungo la WMT (Figura 1A).

Alcune chemiochine e i loro recettori, come il fattore 1α derivato dalle cellule stromali (SDF1α) e il recettore della chemiochina con motivo C-X-C 4 (CXCR4), ma non il fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF), sembrano essere implicati nell’invasione WMT³. Più recentemente, un asse TRANSCELLULAR NOTCH1-SOX2 ha dimostrato di essere un percorso importante nell’invasione WMT delle cellule GBM⁴. Gli autori hanno descritto come le cellule staminali GBM invadano il parenchima cerebrale su neuroni parzialmente non mielinati, suggerendo la distruzione delle suone di mielina da parte delle cellule GBM. Una pietra miliare è stata raggiunta nel 2019 quando tre articoli sono stati pubblicati inconsacrazione sulla rivista Nature, sottolineando il ruolo dell’attività elettrica nello sviluppo del glioma^5,6. Il lavoro seminale di Monje e collaboratori fa luce sul ruolo centrale dell’attività elettrica nella secrezione di neuroligin-3, che promuove lo sviluppo del glioma.

Winkler e collaboratori hanno descritto le connessioni tra cellule GBM (microtubi) cruciali in passaggi invasivi e, ultimamente, interazioni tra cellule GBM e neuroni attraverso sinapsi di neuroglioma appena descritte. Queste strutture favoriscono la stimolazione glutattergica dei recettori dell’acido α-ammino-3-idrossi-5-metil-4-isoxazolepropionico (AMPA) situati nella membrana cellulare GBM, che promuove lo sviluppo e l’invasione del tumore. L’invasione delle cellule tumorali è un processo centrale nella diffusione di metastasi o focolai secondari distanti, come osservato nei pazienti affetti da GBM. Diversi fattori sono stati identificati come importanti nell’invasione gbm come la trombospondina-1, un fattore di crescita beta trasformante (proteina matricellulare regolata da TGFβ o il recettore delle chemiochine CXCR3)^7,8.

Qui, è stato descritto un modello biomimetico semplificato per lo studio dell’invasione GBM, in cui i neuroni sono modellati su tracce di laminina, e le cellule GBM sono seminate su di essa, come singole cellule o come sferoidi (Figura 1B). Le due impostazioni sperimentali sono finalizzate a ricapitolare l’invasione sui neuroni, che si osserva in GBM^9,10,11. Tali modelli sono stati sviluppati in passato come biomateriali in nanofibra allineati (elettrofilatura a guscio centrale) che consentono di studiare la migrazione cellulare modulando le proprietà meccaniche^{o chimiche 12}. Il modello di co-coltura descritto in questo articolo consente una migliore comprensione di come le cellule GBM fuggono sui neuroni definendo nuove vie molecolari coinvolte in questo processo.

Protocol

Il consenso scritto informato è stato ottenuto da tutti i pazienti (dall’ospedale haukeland di Bergen, Norvegia, secondo le normative del comitato etico locale). Questo protocollo segue le linee guida dei comitati etici per la ricerca umana e animale dell’Università di Bordeaux. I ratti gravidi venivano ospitati e trattati nella struttura animale dell’Università di Bordeaux. L’eutanasia di un ratto incinta a tempo E18 è stata eseguita utilizzando CO2. Tutte le procedure sugli animali sono state fatte secon…

Representative Results

I neuroni modellati co-coltivati con cellule GBM fluorescenti sono stati preparati come descritto nella sezione del protocollo e sono stati eseguiti esperimenti di tracciamento. Le cellule GBM hanno rapidamente modificato la loro forma durante la migrazione sui neuroni (Figura 1B: pannello 6 e Video 1). Le cellule migrarono lungo le estensioni neuronali, in un movimento casuale (Video 1). Le cellule GBM fluorescenti e i neuroni non fluoresce…

Discussion

I glioblastomi invadono ampiamente il parenchima usando diverse modalità: co-opzione dei vasi sanguigni circostanti, invasione interstiziale o invasione sulle^{RM 18}. Quest’ultima modalità non è ben caratterizzata in letteratura a causa della difficoltà di trovare modelli adatti in vitro o in vivo relativi all’invasione WMT. Qui, è stato proposto un modello semplificato in cui i neuroni roditori coltivati sono stati modellati su superfici rivestite di laminina, e le cellule fl…

Materials

(3-aminopropyl) triethoxysilane	Sigma	440140-100ML	The amino group is useful for the bioconjugation of mPEG-SVA
96-well round-bottom plate	Sarstedt	2582624	Used to prepare spheroids
Accutase	Gibco	A11105-01	Stored at -20 °C (long-term) or 4 °C (short-term), sphere dissociation enzyme
B27	Gibco	12587	Stored at -20 °C, defrost before use
Basic Fibroblast Growth Factor	Peprotech	100-18B	Stored at -20 °C, defrost before use
Countess Cell Counting ChamberSlides	Invitrogen	C10283	Used to cell counting
Coverslips	Marienfeld	111580	Cell culture substrate
Dessicator cartridges	Sigma	Z363456-6EA	Used to reduce mosture during (3-aminopropyl) triethoxysilane treatment
DPBS 10x	Pan Biotech	P04-53-500	Stored at 4 °C
Fiji software, MTrack2 macro	ImageJ		Used to analyze pictures
Flask 75 cm²	Falcon	10497302
HBSS	Sigma	H8264-500ML
Heparin sodium	Sigma	H3149-100KU	Stored at 4 °C
Laminin		114956-81-9	Promotes neuronal adhesion
Leonardo software			loading of envisioned micropatterns
MetaMorph Software	Molecular Devices LLC	NA	Microscopy automation software
Methylcellulose	Sigma	M0512	Diluted in NBM for a 2% final concentration
Neurobasal medium	Gibco	21103-049	Stored at 4 °C
Nikon TiE (S Fluor, 20x/0.75 NA)			inverted microscope equipped with a motorized stage
Penicillin – Streptomycin	Gibco	15140-122	Stored at 4 °C
PLPP	Alveole	PLPPclassic_1ml	Photoinitiator used to degrade the PEG brush
Poly(ethylene glycol)-Succinimidyl Valerate (mPEG-SVA)	Laysan Bio	VA-PEG-VA-5000-5g	Used as an anti-fouling coating
PRIMO	Alveole	PRIMO1	Digital micromirror device (DMD)-based UV projection apparatus
Trypan blue 0.4%	ThermoFisher	T10282	Used for cell counting
Trypsin-EDTA	Sigma	T4049-100ML	Used to detach adherent cells