Co-kultur af Glioblastoma Stamceller på mønstrede neuroner til at studere migration og cellulære interaktioner
Summary
Her præsenterer vi en brugervenlig co-kulturanalyse til at analysere glioblastoma (GBM) migration på mønstrede neuroner. Vi udviklede en makro i FiJi-software for nem kvantificering af GBM-cellemigration på neuroner og observerede, at neuroner ændrer GBM-celle invasiv kapacitet.
Abstract
Glioblastomas (GBMs), grade IV ondartede gliomer, er en af de dødeligste typer af kræft hos mennesker på grund af deres aggressive egenskaber. På trods af betydelige fremskridt i genetik af disse tumorer, hvordan GBM celler invadere den sunde hjerne parenchyma er ikke godt forstået. Især har det vist sig, at GBM-celler invaderer det peritumorale rum via forskellige ruter; hovedinteressen i dette papir er ruten langs hvide stof skrifter (WMTs). Samspillet mellem tumorceller med peritumoralnervecellekomponenterne er ikke godt karakteriseret. Heri er der beskrevet en metode, der evaluerer neuronernes indvirkning på GBM-celleinvasion. Dette papir præsenterer en avanceret co-kultur in vitro assay, der efterligner WMT invasion ved at analysere migration af GBM stamceller på neuroner. GBM-cellers opførsel i nærværelse af neuroner overvåges ved hjælp af en automatiseret sporingsprocedure med open source- og friadgangssoftware. Denne metode er nyttig til mange applikationer, især til funktionelle og mekanistiske undersøgelser samt til analyse af virkningerne af farmakologiske midler, der kan blokere GBM-cellemigration på neuroner.
Introduction
Primære ondartede gliomer, herunder GBMs, er ødelæggende tumorer, med en medium overlevelsesrate på 12 til 15 måneder rapporteret for GBM patienter. Nuværende terapi er afhængig af store tumor masse resektion og kemoterapi kombineret med strålebehandling, som kun udvider overlevelsesraten med få måneder. Terapeutiske fejl er tæt forbundet med dårlig levering af lægemidler på tværs af blod-hjerne barrieren (BBB) og til invasiv vækst i perivascular rum, meninges, og langs WMTs1. Perivascular invasion, også kaldet vaskulær co-option, er en godt studeret proces, og de molekylære mekanismer er begyndt at blive belyst; processen med GBM-celleinvasion langs WMT’er er imidlertid ikke godt forstået. Tumorceller migrere ind i den sunde hjerne langs Scherer sekundære strukturer2. For næsten et århundrede siden beskrev Hans-Joachim Scherer de invasive ruter for GBM, som nu omtales som perineuronal satellitose, perivascular satellitose, subpiel spredning og invasion langs WMT (Figur 1A).
Nogle kemokiner og deres receptorer, såsom stromal celle-afledt faktor-1α (SDF1α) og C-X-C motiv kemokin receptor 4 (CXCR4), men ikke vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF), synes at være impliceret i WMT invasion3. For nylig har en transcellulær NOTCH1-SOX2-akse vist sig at være en vigtig vej i WMT-invasion af GBM-celler4. Forfatterne beskrev, hvordan GBM stamceller invadere hjernen parenchyma på delvist unmyelinated neuroner, hvilket tyder på ødelæggelse af myelin kapper af GBM celler. En milepæl blev nået i 2019, da tre artikler blev foreløbigt offentliggjort i Nature-tidsskriftet, der understreger den elektriske aktivitets rolle i gliomudvikling5,6. Skelsættende arbejde af Monje og samarbejdspartnere kaste lys over den centrale rolle elektrisk aktivitet i udskillelsen af neuroligin-3, som fremmer gliom udvikling.
Winkler og samarbejdspartnere beskrev forbindelser mellem GBM-celler (mikrorør) som afgørende i invasive trin, og på det seneste har interaktioner mellem GBM-celler og neuroner via nyligt beskrevne neurogliomasynapser. Disse strukturer favoriserer glutamatergisk stimulation af α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolpropionsyre (AMPA) receptorer placeret på GBM cellemembranen, som fremmer tumor udvikling og invasion. Tumorcelleinvasion er en central proces i udbredelsen af metastaser eller fjerne sekundære foci, som observeret hos GBM-patienter. Flere faktorer er blevet identificeret som vigtige i GBM invasion såsom thrombospondin-1, en transformerende vækstfaktor beta (TGFβ-reguleret matricellulært protein, eller kemokin receptor CXCR3)7,8.
Her er en forenklet biomimetisk model blevet beskrevet for at studere GBM-invasion, hvor neuroner er mønstret på spor af laminin, og GBM-celler er seedet på det, som enkeltceller eller som sfæroider (Figur 1B). De to eksperimentelle indstillinger har til formål at opsummere invasion på neuroner, som observeres i GBM9,10,11. Sådanne modeller er tidligere blevet udviklet som justerede nanofiberbiomaterialer (core-shell elektrospinning), der gør det muligt at studere cellemigration ved at modulere mekaniske eller kemiske egenskaber12. Den co-kulturmodel, der er beskrevet i denne artikel, giver en bedre forståelse af, hvordan GBM-celler undslipper på neuroner ved at definere nye molekylære veje, der er involveret i denne proces.
Protocol
Representative Results
Discussion
Glioblastomas invaderer i vid udstrækning parenchyma ved hjælp af forskellige tilstande: co-option af omkringliggende blodkar, interstitiel invasion eller invasion på WMTs18. Sidstnævnte tilstand er ikke godt karakteriseret i litteraturen på grund af vanskelighederne med at finde egnede in vitro- eller in vivo-modeller relateret til WMT-invasion. Her er der foreslået en forenklet model, hvor dyrkede gnaverneuroner blev mønstret på lamininbelagte overflader, og fluorescere…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Fondation ARC 2020, Ligue Contre le Cancer (Comite de la Gironde), ARTC, Plan Cancer 2021, INCA PLBIO. Alveole er støttet af Agence Nationale de la Recherche (Grant Labex BRAIN ANR-10-LABX-43). Joris Guyon er modtager af stipendium fra Toulouse University Hospital (CHU Toulouse).
Materials
| (3-aminopropyl) triethoxysilane | Sigma | 440140-100ML | The amino group is useful for the bioconjugation of mPEG-SVA |
| 96-well round-bottom plate | Sarstedt | 2582624 | Used to prepare spheroids |
| Accutase | Gibco | A11105-01 | Stored at -20 °C (long-term) or 4 °C (short-term), sphere dissociation enzyme |
| B27 | Gibco | 12587 | Stored at -20 °C, defrost before use |
| Basic Fibroblast Growth Factor | Peprotech | 100-18B | Stored at -20 °C, defrost before use |
| Countess Cell Counting ChamberSlides | Invitrogen | C10283 | Used to cell counting |
| Coverslips | Marienfeld | 111580 | Cell culture substrate |
| Dessicator cartridges | Sigma | Z363456-6EA | Used to reduce mosture during (3-aminopropyl) triethoxysilane treatment |
| DPBS 10x | Pan Biotech | P04-53-500 | Stored at 4 °C |
| Fiji software, MTrack2 macro | ImageJ | Used to analyze pictures | |
| Flask 75 cm² | Falcon | 10497302 | |
| HBSS | Sigma | H8264-500ML | |
| Heparin sodium | Sigma | H3149-100KU | Stored at 4 °C |
| Laminin | 114956-81-9 | Promotes neuronal adhesion | |
| Leonardo software | loading of envisioned micropatterns | ||
| MetaMorph Software | Molecular Devices LLC | NA | Microscopy automation software |
| Methylcellulose | Sigma | M0512 | Diluted in NBM for a 2% final concentration |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | Stored at 4 °C |
| Nikon TiE (S Fluor, 20x/0.75 NA) | inverted microscope equipped with a motorized stage | ||
| Penicillin – Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Stored at 4 °C |
| PLPP | Alveole | PLPPclassic_1ml | Photoinitiator used to degrade the PEG brush |
| Poly(ethylene glycol)-Succinimidyl Valerate (mPEG-SVA) | Laysan Bio | VA-PEG-VA-5000-5g | Used as an anti-fouling coating |
| PRIMO | Alveole | PRIMO1 | Digital micromirror device (DMD)-based UV projection apparatus |
| Trypan blue 0.4% | ThermoFisher | T10282 | Used for cell counting |
| Trypsin-EDTA | Sigma | T4049-100ML | Used to detach adherent cells |
Referências
- Shergalis, A., Bankhead, A., Luesakul, U., Muangsin, N., Neamati, N. Current challenges and opportunities in treating glioblastoma. Pharmacology Reviews. 70, 412-445 (2018).
- Scherer, H. J. The forms of growth in gliomas and their practical significance. Brain. 63, 1-35 (1940).
- Zagzag, D., et al. Hypoxia- and vascular endothelial growth factor-induced stromal cell-derived factor-1α/CXCR4 expression in glioblastomas. American Journal of Pathology. 173, 545-560 (2008).
- Wang, J., et al. Invasion of white matter tracts by glioma stem cells is regulated by a NOTCH1-SOX2 positive-feedback loop. Nature Neurosciences. 22, 91-105 (2019).
- Venkataramani, V., et al. Glutamatergic synaptic input to glioma cells drives brain tumour progression. Nature. 573, 532-538 (2019).
- Venkatesh, H. S., et al. Electrical and synaptic integration of glioma into neural circuits. Nature. 573, 539-545 (2019).
- Boyé, K., et al. The role of CXCR3/LRP1 cross-talk in the invasion of primary brain tumors. Nature Communications. 8, 1571 (2017).
- Daubon, T., et al. Deciphering the complex role of thrombospondin-1 in glioblastoma development. Nature Communications. 10, 1146 (2019).
- Gritsenko, P. G., et al. p120-catenin-dependent collective brain infiltration by glioma cell networks. Nature Cell Biology. 22, 97-107 (2020).
- Guyon, J., et al. A 3D spheroid model for glioblastoma. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (158), (2020).
- Strale, P. O., et al. Multiprotein Printing by Light?Induced Molecular Adsorption. Advanced Materials. , (2015).
- Rao, S. S., et al. Mimicking white matter tract topography using core-shell electrospun nanofibers to examine migration of malignant brain tumors. Biomaterials. 34, 5181-5190 (2013).
- Visweshwaran, S. P., Maritzen, T. A simple 3D cellular chemotaxis assay and analysis workflow suitable for a wide range of migrating cells. MethodsX. 6, 2807-2821 (2019).
- Qian, H., Sheetz, M. P., Elson, E. L. Single particle tracking. Analysis of diffusion and flow in two-dimensional systems. Biophysics Journal. 60, 910-921 (1991).
- Pasturel, A., Strale, P. -. O., Studer, V. Tailoring common hydrogels into 3D cell culture templates. Advance Healthcare Materials. 9, 2000519 (2020).
- Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145, 831-834 (2011).
- Clark, A. J., et al. Co-cultures with stem cell-derived human sensory neurons reveal regulators of peripheral myelination. Brain. 140, 898-913 (2017).
- Linkous, A., et al. Modeling patient-derived glioblastoma with cerebral organoids. Cell Reports. 26, 3203-3211 (2019).
- Han, M., et al. Interfering with long non-coding RNA MIR22HG processing inhibits glioblastoma progression through suppression of Wnt/β-catenin signalling. Brain. 143, 512-530 (2020).
