מידול גרורות במוח באמצעות הזרקת ורידים בזנב של תאי סרטן שד דלקתיים
Summary
אנו מתארים מודל עכבר xenograft של גרורות במוח של סרטן השד שנוצרו באמצעות הזרקת ורידים בזנב של קו תאי סרטן שד דלקתי מוגבר אנדוגניים HER2.
Abstract
התפשטות גרורתית למוח היא ביטוי שכיח והרסני של סוגים רבים של סרטן. בארצות הברית לבדה, כ-200,000 חולים מאובחנים עם גרורות במוח מדי שנה. הושגה התקדמות משמעותית בשיפור תוצאות ההישרדות של חולות עם סרטן שד ראשוני וממאירויות סיסטמיות; עם זאת, הפרוגנוזה העגומה עבור חולים עם גרורות קליניות במוח מדגישה את הצורך הדחוף לפתח סוכנים טיפוליים חדשניים ואסטרטגיות נגד מחלה קטלנית זו. היעדר מודלים ניסיוניים מתאימים היה אחד המכשולים העיקריים המעכבים את התקדמות ההבנה שלנו של גרורות מוחיות, ביולוגיה וטיפול. במאמר זה אנו מתארים מודל עכברי של גרורות במוח שנוצרו באמצעות הזרקת וריד זנב של קו תאים אנדוגני מוגבר HER2 שמקורו בסרטן שד דלקתי (IBC), צורה נדירה ואגרסיבית של סרטן השד. התאים סומנו בלוציפראז גחלילית ובחלבון פלואורסצנטי ירוק כדי לנטר גרורות במוח, וכומתו עומס גרורתי על ידי דימות ביולומינסצנטי, סטריאומיקרוסקופיה פלואורסצנטית והערכה היסטולוגית. עכברים מפתחים גרורות במוח באופן יציב ועקבי, מה שמאפשר חקירה של מתווכים מרכזיים בתהליך הגרורתי ופיתוח בדיקות פרה-קליניות של אסטרטגיות טיפול חדשות.
Introduction
גרורות במוח הן סיבוך שכיח וקטלני של ממאירויות מערכתיות. רוב גרורות המוח מקורן בגידולים ראשוניים של הריאה, השד או העור, אשר ביחד מהווים 67-80% מהמקרים 1,2. ההערכות לגבי היארעות גרורות במוח נעות בין 100,000 ל-240,000 מקרים, ומספרים אלה עשויים להיות מוערכים בחסר מכיוון שנתיחה לאחר המוות נדירה עבור חולים שמתו מסרטן גרורתי3. לחולים עם גרורות במוח יש פרוגנוזה גרועה יותר והישרדות כללית נמוכה יותר ביחס לחולים ללא גרורות במוח4. אפשרויות הטיפול הנוכחיות בגרורות במוח הן פליאטיביות ברובן ואינן מצליחות לשפר את תוצאות ההישרדות עבור רוב החולים5. לפיכך, גרורות במוח נותרו אתגר, והצורך נותר דחוף כדי להבין טוב יותר את המנגנונים של התקדמות גרורות במוח כדי לפתח טיפולים יעילים יותר.
השימוש במודלים ניסיוניים סיפק תובנות חשובות לגבי מנגנונים ספציפיים של התקדמות גרורתית של סרטן השד למוח ואיפשר להעריך את יעילותן של גישות טיפוליות שונות 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 . עם זאת, מעט מאוד מודלים יכולים לשחזר באופן מדויק ומלא את המורכבות של התפתחות גרורות במוח. מספר מודלים ניסיוניים in vivo נוצרו באמצעות חיסון תאים סרטניים לעכברים על ידי נתיבי מתן שונים, כולל אורתוטופיים, וריד זנב, תוך לבבי, עורקי תוך קרוטיד וזריקות תוך מוחיות. לכל טכניקה יתרונות וחסרונות, כפי שנסקר במקום אחר3. עם זאת, אף אחד מהמודלים האלה של עכברים לא יכול לשכפל באופן מלא את ההתקדמות הקלינית של גרורות במוח.
גרורות במוח שכיחות במיוחד בחולות עם סרטן שד דלקתי (IBC), גרסה נדירה אך אגרסיבית של סרטן שד ראשוני. IBC מהווה 1% עד 4% ממקרי סרטן השד, אך הוא אחראי ל -10% לא פרופורציונליים ממקרי המוות הקשורים לסרטן השד בארצות הברית17,18. IBC ידוע לשלוח גרורות במהירות; ואכן, לשליש מחולי IBC יש גרורות מרוחקות בזמן האבחנה19,20. ספציפית לגרורות במוח, חולים עם IBC יש שכיחות גבוהה יותר של גרורות במוח מאשר חולים עם IBC שאינו IBC21. לאחרונה, הדגמנו כי קו התאים MDA-IBC3, הנגזר מנוזל ההיתוך הפלאורלי הממאיר של חולה עם ER-/PR–/HER2+ IBC המשחזר מאפייני IBC בקסנוגרפטים של עכברים, הוא בעל נטייה מוגברת לפתח גרורות במוח ולא גרורות ריאה בעכברים כאשר מוזרק על ידי וריד הזנב, מה שהופך את קו התאים הזה למודל טוב לחקר התפתחות גרורות במוח16.
במאמר זה נתאר את ההליכים ליצירת גרורות במוח באמצעות הזרקת תאי MDA-IBC3 לווריד הזנב ולהערכת העומס הגרורתי באמצעות מיקרוסקופ סטריאופלואורסצנטי והדמיית לוציפראז. שיטה זו שימשה לגילוי מתווכים מרכזיים של גרורות סרטן השד למוח ולבדיקת היעילות של התערבויות טיפוליות 16,22,23. החיסרון של טכניקה זו הוא שהיא אינה משחזרת את כל השלבים בתהליך הגרורתי במוח. עם זאת, יתרונותיו העיקריים כוללים חוסן ויכולת שחזור, מעורבות של הביולוגיה הרלוונטית של גרורות של intravasation, חציית הריאות ו extravasation לתוך המוח, ואת הפשטות היחסית שלה במונחים של טכניקה.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול כולל מספר שלבים קריטיים. תאים צריכים להישמר על קרח לא יותר משעה אחת כדי לשמור על כדאיות. יש להשתמש ברפידות כותנה אלכוהוליות כדי לנגב את זנבות העכברים לפני ההזרקה, תוך הקפדה לא לנגב חזק מדי או לעתים קרובות מדי כדי למנוע פגיעה בעור הזנב. ודא שאין בועות אוויר בתרחיף התא, כדי למנוע מעכ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לכריסטין פ. ווגן, MS, ELS, מהמחלקה לאונקולוגיה של קרינה של MD Anderson על העריכה המדעית של כתב היד, ולקרול מ. ג’ונסטון מהמחלקה להיסטולוגיה כירורגית של MD Anderson על העזרה עם צביעת המטוקסילין ואאוזין. אנו מודים לליבת הרפואה והכירורגיה הווטרינרית ב- MD Anderson על תמיכתם במחקרים בבעלי חיים. עבודה זו נתמכה על ידי המענקים הבאים: Susan G. Komen Career Catalyst Research grant (CCR16377813 ל-BGD), מענק Research Scholar של האגודה האמריקאית לסרטן (RSG-19-126-01 ל-BGD), והתוכנית לחקר סרטן השד הנדירה והאגרסיבית של מדינת טקסס. נתמך גם בחלקו על ידי מענק תמיכה של מרכז הסרטן (ליבה) P30 CA016672 מהמכון הלאומי לסרטן, המכונים הלאומיים לבריאות, למרכז הסרטן MD Anderson באוניברסיטת טקסס.
Materials
| Cell Culture | |||
| 1000 µL pipette tip filtered | Genesee Scientific | 23430 | |
| 10 mL Serological Pipets | Genesee Scientific | 12-112 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | 1% |
| Centrifuge tubes 15 mL bulk | Genesee Scientific | 28103 | |
| Corning 500 mL Hams F-12 Medium [+] L-glutamine | GIBICO Inc. USA | MT10080CV | |
| Countess II Automated Cell Counter (Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| 1x DPBS | Thermo Fisher Scientific | 21-031-CV | |
| Eppendorf centufuge 5810R | Eppendorf | ||
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBICO Inc. USA | 16000044 | 10% |
| Fisherbrand Sterile Cell Strainers (40 μm) | Thermo Fisher Scientific | 22-363-547 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | 1 µg/mL |
| Insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | 5 µg/mL |
| Invitrogen Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| MDA-IBC3 cell lines | MD Anderson Cancer Center | Generated by Dr. Woodward's lab24 | |
| Luciferase–green fluorescent protein (Luc–GFP) plasmid | System Biosciences | BLIV713PA-1 | |
| microtubes clear sterile 1.7 mL | Genesee Scientific | 24282S | |
| Olympus 10 µL Reach Barrier Tip, Low Binding, Racked, Sterile | Genesee Scientific | 23-401C | |
| TC Treated Flasks (T75), 250mL, Vent | Genesee Scientific | 25-209 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200114 | |
| Tail vein injection | |||
| C.B-17/IcrHsd-Prkdc scid Lyst bg-J – SCID/Beige | Envigo | SCID/beige mice | |
| BD Insulin Syringe with the BD Ultra-Fine Needle 0.5mL 30Gx1/2" (12.7mm) | BD | 328466 | |
| Plas Labs Broome-Style Rodent Restrainers | Plas Labs 551BSRR | 01-288-32A | Order fromThermo Fisher Scientific |
| Volu SolSupplier Diversity Partner Ethanol 95% SDA (190 Proof) | Thermo Fisher Scientific | 50420872 | 70 % used |
| Imaging | |||
| BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | BD | 329461 | |
| Disposable PES Filter Units 0.45 µm | Fisherbrand | FB12566501 | filter system to sterilize the D-luciferin |
| D-Luciferin | Biosynth | L8220-1g | stock concentration = 47.6 mM (15.15 mg/mL); use concentration = 1.515 mg/mL |
| 1.7 mL microtube amber | Genesee Scientific | 24-282AM | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | NDC-14043-704-06 | Liquid anesthetic for use in anesthetic vaporizer |
| IVIS 200 | PerkinElmer | machine for luciferase imaging, up to 5 mice imaging at the same time, with anesthesia machine | |
| Plastic Containers with Lids | Fisherbrand | 02-544-127 | |
| Tissue Cassettes | Thermo Scientific | 1000957 | |
| Webcol Alcohol Prep | Covidien | 6818 | |
| Stereomicroscope Imaging | |||
| Stereomicroscope AZ100 | Nikon | model AZ-STGE | software NIS-ELEMENT |
| Formalin 10% | Fisher Chemical | SF100-4 | |
| TC treated dishes 100×20 mm | Genesee Scientific | 25202 |
Referências
- Achrol, A. S., et al. Brain metastases. Nature Reviews Disease Primers. 5 (1), 5 (2019).
- Nayak, L., Lee, E. Q., Wen, P. Y. Epidemiology of brain metastases. Current Oncology Report. 14 (1), 48-54 (2012).
- Lowery, F. J., Yu, D. Brain metastasis: Unique challenges and open opportunities. Biochimica et Biophysica Acta Review Cancer. 1867 (1), 49-57 (2017).
- Brufsky, A. M., et al. Central nervous system metastases in patients with HER2-positive metastatic breast cancer: incidence, treatment, and survival in patients from registHER. Clinical Cancer Research. 17 (14), 4834-4843 (2011).
- Valiente, M., et al. The evolving landscape of brain metastasis. Trends in Cancer. 4 (3), 176-196 (2018).
- Bos, P. D., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain. Nature. 459 (7249), 1005-1009 (2009).
- Woditschka, S., et al. DNA double-strand break repair genes and oxidative damage in brain metastasis of breast cancer. Journal of the National Cancer Institute. 106 (7), (2014).
- Palmieri, D., et al. Vorinostat inhibits brain metastatic colonization in a model of triple-negative breast cancer and induces DNA double-strand breaks. Clinical Cancer Research. 15 (19), 6148-6157 (2009).
- Kim, S. J., et al. Astrocytes upregulate survival genes in tumor cells and induce protection from chemotherapy. Neoplasia. 13 (3), 286-298 (2011).
- Zhang, S., et al. SRC family kinases as novel therapeutic targets to treat breast cancer brain metastases. Pesquisa do Câncer. 73 (18), 5764-5774 (2013).
- Valiente, M., et al. Serpins promote cancer cell survival and vascular co-option in brain metastasis. Cell. 156 (5), 1002-1016 (2014).
- Gril, B., et al. Effect of lapatinib on the outgrowth of metastatic breast cancer cells to the brain. Journal of the National Cancer Institute. 100 (15), 1092-1103 (2008).
- Gril, B., et al. Pazopanib reveals a role for tumor cell B-Raf in the prevention of HER2+ breast cancer brain metastasis. Clinical Cancer Research. 17 (1), 142-153 (2011).
- Palmieri, D., et al. Profound prevention of experimental brain metastases of breast cancer by temozolomide in an MGMT-dependent manner. Clinical Cancer Research. 20 (10), 2727-2739 (2014).
- Priego, N., et al. STAT3 labels a subpopulation of reactive astrocytes required for brain metastasis. Nature Medicine. 24 (7), 1024-1035 (2018).
- Debeb, B. G., et al. miR-141-mediated regulation of brain metastasis from breast cancer. Journal of the National Cancer Institute. 108 (8), (2016).
- Chang, S., Parker, S. L., Pham, T., Buzdar, A. U., Hursting, S. D. Inflammatory breast carcinoma incidence and survival: the surveillance, epidemiology, and end results program of the National Cancer Institute, 1975-1992. Cancer. 82 (12), 2366-2372 (1998).
- Hance, K. W., Anderson, W. F., Devesa, S. S., Young, H. A., Levine, P. H. Trends in inflammatory breast carcinoma incidence and survival: the surveillance, epidemiology, and end results program at the National Cancer Institute. Journal of National Cancer Institute. 97 (13), 966-975 (2005).
- Dirix, L. Y., Van Dam, P., Prove, A., Vermeulen, P. B. Inflammatory breast cancer: Current understanding. Current Opinion in Oncology. 18 (6), 563-571 (2006).
- Wang, Z., et al. Pattern of distant metastases in inflammatory breast cancer – A large-cohort retrospective study. Journal of Cancer. 11 (2), 292-300 (2020).
- Uemura, M. I., et al. Development of CNS metastases and survival in patients with inflammatory breast cancer. Cancer. 124 (11), 2299-2305 (2018).
- Smith, D. L., Debeb, B. G., Thames, H. D., Woodward, W. A. Computational modeling of micrometastatic breast cancer radiation dose response. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 96 (1), 179-187 (2016).
- Fukumura, K., et al. Multi-omic molecular profiling reveals potentially targetable abnormalities shared across multiple histologies of brain metastasis. Acta Neuropathol. , (2021).
- Klopp, A. H., et al. Mesenchymal stem cells promote mammosphere formation and decrease E-cadherin in normal and malignant breast cells. PLoS One. 5 (8), 12180 (2010).
- Villodre, E. S., et al. Abstract P3-01-10: Ndrg1-egfr axis in inflammatory breast cancer tumorigenesis and brain metastasis. Pesquisa do Câncer. 80 (4), 10 (2020).
